專利名稱：一株植物乳桿菌r23的制作方法
技術領域：
本發明涉及微生物技術領域，特別涉及一株具有益生特性、產蘋果酸乳酸發酵酶的植物乳桿菌R23及其在果酒降酸等方面的應用，該菌為植物乳桿菌屬的植物乳桿菌 (Lactobacillus plantarum)，命名為植物乳桿菌R23，該菌已于2011年8月1日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，其保藏號為CGMCC No. 5105。
背景技術：
果酒中高含量的蘋果酸會導致酒體酸澀、粗糙感強，蘋果酸-乳酸發酵(MLF)是乳酸菌以雙羧基的L-蘋果酸為底物，在蘋果酸-乳酸酶(MLE)催化下轉變成單羧基L-乳酸和CO2的過程，此過程可使酒體變柔和，并起到風味修飾作用，是釀造優質果酒的重要生物降酸工序之一。但是果酒中高含量的二氧化硫和酒精濃度、低PH值，以及較低的發酵條件等均抑制了乳酸菌的生長，從而大大降低了乳酸菌的降酸效果；迫切需要選育一種耐高二氧化硫、高酒精度、低PH和釀酒特性好的乳酸菌種。
發明內容
為了解決現有技術所存在的問題，本發明提供了一株植物乳桿菌R23，它不僅高產蘋果酸乳酸酶，具有良好的生物降酸能力，而且具有較強的益生特性。本發明技術方案由以下幾部分構成方案一一株植物乳桿菌R23 (Lactobacillus plantarum R23)，其特征在于所述植物乳桿菌于2011年8月1日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCCJi 于北京市朝陽區北辰西路1號院3號)，其保藏號為CGMCC No. 5105。本發明所述的植物源乳桿菌是從自然發酵的“早鐘六號”枇杷酒中分離、篩選出的具有較強的益生特性與產酶能力的乳酸菌，命名為植物乳桿菌R23 (Lactobacillus plantarum R23)，簡稱 R23。所述植物乳桿菌具有以下形態特征菌落直徑1.0 1.8mm，呈圓形，表面光滑，邊緣完整，中央突起，乳白色，不透明；液體培養無菌膜、無氣泡、菌液渾濁、分層明顯、菌體不易離心且底部有白色沉淀；細胞形態為桿狀或橢圓，桿狀菌體大小為 0. 37ymX2. 25 μ m(長X寬)，橢圓狀菌體大小為0. 58 μ mX 2. 01 μ m(長X寬)，細胞常呈單個排列，無芽孢，不運動。所述植物乳桿菌具有以下生理生化特性菌株能在15°C以下生長，甲基紅試驗和 0. 美蘭牛乳試驗為陽性，兼性厭氧，接觸酶試驗、氧化酶試驗、伏普試驗、淀粉水解試驗、 吲哚試驗、明膠水解試驗、硫化氫試驗、硝酸鹽還原試驗、葡萄糖酸鹽試驗及精氨酸產氨試驗均為陰性；糖發酵試驗結果表明，所述植物乳桿菌不能代謝山梨醇，對木糖呈陽性弱反應，其它15種碳源均可利用。此外，所述植物乳桿菌具有以下益生特性①較強 的抗逆性能耐受PH值大于等于2. 5的酸度，能耐受高達0. 5%的膽鹽濃度；②較強的抗氧化能力所述植物乳桿菌培養24h后的胞外代謝產物，對超氧陰離子自由基和羥自由基的清除率分別達77. 8%和 80. 94% ；③較強的粘附能力表面疏水性達17. 71%。所述植物乳桿菌具有以下發酵特性抗逆能力強，即所述植物乳桿菌能在具有如下一個以上條件的酒體內正常生長SO2 含量120 士 10mg/L;酒精度(ν/ν)13士2% ；ρΗ 值3. 3 士 0.2; 總酸(以蘋果酸計)1. 0士0. 2% ；培養溫度18 士 2°C。所述植物乳桿菌具有蘋果酸乳酸發酵特性，即所述植物乳桿菌產蘋果酸乳酸酶， 并且在植物乳桿菌菌體對數生長期內，產蘋果酸乳酸酶量及其活力隨著植物乳桿菌菌量的增加而增加，在穩定期的4-8h內酶活較高；所述植物乳桿菌菌體產蘋果酸乳酸酶的培養條件為發酵溫度30士5°C，ρΗ值6. 5士0. 5，L-蘋果酸濃度4. 5士0. 5g/L ；各因素對產蘋果酸乳酸酶量的影響主次順序是起始L-蘋果酸濃度>發酵溫度>起始ρΗ值。所述植物乳桿菌菌體產蘋果酸乳酸酶的最適培養條件為發酵溫度33. 5°C，ρΗ值 6. 2，L-蘋果酸濃度4. Og/L。在此條件下植物乳桿菌R23厭氧發酵28h的產酶量為1. 34mg/ mL,酶活力為462. 33u，總活力為619. 52U。所述植物乳桿菌在枇杷果酒中的生長及蘋果酸乳酸發酵特性如下所述植物乳桿菌在枇杷果酒的菌量總體呈下降趨勢，厭氧條件能明顯提高菌體細胞在枇杷果酒中的存活率和降酸效果；生長曲線的下降趨勢與接種量、總二氧化硫濃度、酒精度及發酵溫度呈正效應，與PH值呈負效應，完成蘋果酸乳酸發酵后菌量下降速率加快；當接種量為108CFU/mL、 總二氧化硫<70!^/1且酒精度<12.7% (體積分數)時，能完全將枇杷果酒中的蘋果酸轉化為乳酸；當PH值< 3. 3時，蘋果酸乳酸發酵無法完成。方案二方案一所述的植物乳桿菌R23在果酒釀造中的應用，其特性在于所述植物乳桿菌在含有蘋果酸的果酒中能夠優先利用蘋果酸，經蘋果酸乳酸發酵，實現生物降酸。發酵方法如下將所述植物乳桿菌菌株在種子發酵培養基中活化后，以 9. 8 X IO7 5. 6 X 108cfu/mL接種量接入總硫濃度39.6 - 120. 7mg/L、酒精度10 13%且總酸6. 8 11. 9g/L的果酒中，在22士 1°C下恒溫發酵4_5天。所述植物乳桿菌適宜的種子發酵培養基LH18由以下組分構成番茄汁IOOmL,酵母膏7. 4g，牛肉膏10g，葡萄糖30g，硫酸鎂0. 36g，蘋果酸鈉20g，吐溫lg，胰蛋白胨15g，檸檬酸銨2g，MnSO4O. 05g，加水補足1L。所述含有蘋果酸的果酒包括枇杷酒、獼猴桃酒和刺葡萄酒等①所述植物乳桿菌應用于枇杷酒釀造中，能將高含量的蘋果酸轉化為乳酸，降低枇杷酒中的蘋果酸含量，增加酒體柔和度，提高枇杷酒質量，降酸率達30%以上，柔和指數提高33%以上。②所述植物乳桿菌應用于“中華”獼猴桃酒生物降酸中，總酸下降31 %以上，柔和指數提高27%以上。
③所述植物乳桿菌應用于“溪塔”刺葡萄酒生物降酸中，總酸下降28%以上，柔和指數提高20%以上。方案三 方案一所述的植物乳桿菌R23在生產發酵型無菌果汁飲料中的應用，其特性在于所述植物乳桿菌能用于果汁飲料加工中生產發酵型無菌果汁飲料，所生產的發酵型無菌果汁飲料含有所述植物乳桿菌的益生型代謝產物、細胞碎片或分泌物中的至少一種。方法如下將所述植物乳桿菌菌株的擴培菌液以8. 6 X IO7 2. 1 X 108cfu/ml接種量，接入到無菌發酵罐內，該罐內裝有經95 100°C處理2min的果汁，人工調節發酵溫度30°C 士2°C、好氧發酵48小時后得到適度乳酸發酵的果汁乳酸發酵液，過濾后進行飲料調配，制成含量在20%的渾濁型乳酸發酵飲料，再灌裝殺菌即可。例如所述植物乳桿菌能用于枇杷汁飲料加工中，生產發酵型無菌枇杷汁飲料，所生產的發酵型無菌枇杷汁飲料含有所述植物乳桿菌的益生型代謝產物、細胞碎片或分泌物中的至少一種。所述植物乳桿菌能用于葡萄汁飲料加工中，生產發酵型無菌葡萄汁飲料，所生產的發酵型無菌葡萄汁飲料含有所述植物乳桿菌的益生型代謝產物、細胞碎片或分泌物中的至少一種。所述植物乳桿菌能用于獼猴桃汁飲料加工中，生產發酵型無菌獼猴桃汁飲料，所生產的發酵型無菌獼猴桃汁飲料含有所述植物乳桿菌的益生型代謝產物、細胞碎片或分泌物中的至少一種。方案四方案一所述的植物乳桿菌R23在生產發酵性乳酸菌活菌飲料中的應用，其特性在于所述植物乳桿菌能用于果汁飲料加工中生產發酵型乳酸菌活菌飲料，所生產的發酵型乳酸菌活菌飲料含有活性植物乳桿菌，并含有所述植物乳桿菌的益生型代謝產物、細胞碎片或分泌物中的至少一種。方法如下將該菌株的擴培菌液以8. 6 X IO7 2. 1 X 108cfu/ml接種量，接入到無菌發酵罐內，該罐內裝有經95 100°C處理2min的果汁，人工調節發酵溫度30°C 士2°C、好氧發酵48小時后得到適度乳酸發酵的活性果汁乳酸發酵液，過濾后進行飲料調配，制成含量在20%的渾濁型活性乳酸發酵飲料，再灌裝即可。例如所述植物乳桿菌能用于枇杷汁飲料加工中，生產發酵型枇杷汁乳酸菌活菌飲料，所生產的發酵型乳酸菌活菌飲料含有活性植物乳桿菌，或者含有活性植物乳桿菌以及所述植物乳桿菌的益生型代謝產物、細胞碎片或分泌物中的至少一種。所述植物乳桿菌能用于葡萄汁飲料加工中，生產發酵型葡萄汁乳酸菌活菌飲料， 所生產的發酵型乳酸菌活菌飲料含有活性植物乳桿菌，或者含有活性植物乳桿菌以及所述植物乳桿菌的益生型代謝產物、細胞碎片或分泌物中的至少一種。所述植物乳桿菌能用于獼猴桃汁飲料加工中，生產發酵型獼猴桃汁乳酸菌活菌飲料，所生產的發酵型乳酸菌活菌飲料含有活性植物乳桿菌，或者含有活性植物乳桿菌以及所述植物乳桿菌的益生型代謝產物、細胞碎片或分泌物中的至少一種。方案五含有方案一所述的植物乳桿菌R23的菌劑，其特征在于所述菌劑為直投式發酵齊U，其中含有植物 乳桿菌，活菌數在IO11CfuAil以上。所述菌劑在4-6°C條件下保存1年，活菌數在101(lCfu/ml以上，細胞存活率達70% 以上。所述菌劑可用于果酒降酸、果蔬汁飲料加工、發酵乳制品等。此外，還可對所述植物乳桿菌生產的蘋果酸乳酸酶進行提取純化，制得酶制劑，用于果酒降酸、果蔬汁飲料加工等。較之現有技術而言，本發明所提供的植物乳桿菌不僅具有較強的益生特性，而且高產蘋果酸乳酸酶，可在MLE的作用下進行蘋果酸乳酸發酵，能有效降低果酒、果汁中的蘋果酸、增加乳酸及揮發酯等的含量，從而使果酒、果汁口感更加柔和、協調，氣味芳香濃郁， 為提高果酒、果汁品質奠定基礎；此外該菌還有一定的抑菌效果，對一些致病菌具有抑制作用。
圖1是植物乳桿菌R23和對照菌6045的表面疏水性對比示意圖，參見實施例1。圖2是植物乳桿菌R23和對照菌6045的抗氧化能力對比示意圖，參見實施例1。圖3-a是植物乳桿菌R23的生長曲線示意圖，參見實施例2。圖3-b是植物乳桿菌R23在不同生長期的MLE產量及酶活力示意圖，參見實施例 2。圖4是發酵溫度對植物乳桿菌R23的MLE的影響示意圖，參見實施例2。圖5是pH值對植物乳桿菌R23的MLE的影響示意圖，參見實施例2。圖6是L-蘋果酸對植物乳桿菌R23的MLE的影響示意圖，參見實施例2。圖7是NAD+的添加量對植物乳桿菌R23的MLE的影響示意圖，參見實施例2。圖8是供氧條件對植物乳桿菌R23的MLE的影響示意圖，參見實施例2。圖9是植物乳桿菌R23的抗氧化能力的陽性對照標準曲線示意圖。
具體實施例方式以下將結合實施例說明本發明所述的植物乳桿菌的益生特性，諸如抗逆性、抗氧化能力、粘附能力等；產蘋果酸乳酸酶特性，諸如產酶條件、影響因子等；以及植物乳桿菌在果酒釀造、生產發酵型無菌果汁飲料、生產發酵型乳酸菌活菌飲料等方面的應用。實施例1 本發明所述的植物乳桿菌的益生特性1.耐酸及耐膽鹽能力將收集的植物乳桿菌R23菌泥和對照菌6045分別用無菌生理鹽水洗滌2次，并以原體積的十分之一制成懸懸菌，以的接種量分別接種于PH值為3. 5,3. 0,2. 5,2. 0,1. 5 和膽鹽濃度為0%、0. 1%、0. 3%、0. 5%的LH18培養基中，25°C控溫培養4h，每2h取樣進行活菌計數，平行3次取平均值。各菌株在不同pH值及膽鹽濃度環境中培養4h后的菌量變化見表1、表2 植物乳桿菌R23在pH值2. 5環境下培養4h的生物量仍達106CFU/mL，而 6045僅可耐受pH值3. 0的酸度，在pH值2. 5酸性條件下培養4h和2h均已死亡；植物乳桿菌R23可耐受0. 5%膽鹽，培養4h后的生物量仍可達107CFU/mL，而6045僅可耐受0. 3% 膽鹽濃度。結果表明，植物乳桿菌R23對酸度和膽鹽的抗逆能力均優于對照菌6045。
表1各菌株的耐酸能力(lgCFU/mL，i士 s )
權利要求
1.一株植物乳桿菌R23(Lactoabcillus ρlantarum R23)，其特征在于所述植物乳桿菌于2011年8月1日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，其保藏號為 CGMCC No. 5105。
2.根據權利要求1所述的植物乳桿菌R23，其特征在于所述植物乳桿菌具有以下益生特性①較強的抗逆性能耐受PH值大于等于2. 5的酸度，能耐受高達0. 5%的膽鹽濃度；②較強的抗氧化能力所述植物乳桿菌培養24h后的胞外代謝產物，對超氧陰離子自由基和羥自由基的清除率分別達77. 8%和80. 94% ；③較強的粘附能力表面疏水性達 17. 71%。
3.根據權利要求2所述的植物乳桿菌R23，其特征在于所述植物乳桿菌具有以下發酵特性抗逆能力強，即所述植物乳桿菌能在具有如下一個以上條件的酒體內正常生長SO2 含量120 士 10mg/L;酒精度(ν/ν)13士2% ；ρΗ 值3. 3 士 0.2;總酸(以蘋果酸計)1.0士0.2% ；培養溫度18 士 2°C。
4.根據權利要求1所述的植物乳桿菌R23，其特征在于所述植物乳桿菌在枇杷果酒的菌量總體呈下降趨勢，厭氧條件能明顯提高菌體細胞在枇杷果酒中的存活率和降酸效果。
5.如權利要求1-4中任一項所述的植物乳桿菌R23在果酒釀造中的應用，其特性在于 所述植物乳桿菌在含有蘋果酸的果酒中能夠優先利用蘋果酸，經蘋果酸乳酸發酵，實現生物降酸。
6.如權利要求1-4中任一項所述的植物乳桿菌R23在生產發酵型無菌果汁飲料中的應用，其特性在于所述植物乳桿菌能用于果汁飲料加工中生產發酵型無菌果汁飲料，所生產的發酵型無菌果汁飲料含有所述植物乳桿菌的益生型代謝產物、細胞碎片或分泌物中的至少一種。
7.如權利要求1-4中任一項所述的植物乳桿菌R23在生產發酵型乳酸菌活菌飲料中的應用，其特性在于所述植物乳桿菌能用于果汁飲料加工中生產發酵型乳酸菌活菌飲料，所生產的發酵型乳酸菌活菌飲料含有活性植物乳桿菌，并含有所述植物乳桿菌的益生型代謝產物、細胞碎片或分泌物中的至少一種。
8 一種含有權利要求1-4中任一項所述的植物乳桿菌R23的菌劑，其特征在于所述菌劑為直投式發酵劑，其中含有植物乳桿菌，活菌數在IO11CfuAil以上。
全文摘要
本發明涉及一株植物乳桿菌R23(Lactobacillus plantarumR23)，其特征在于所述植物乳桿菌于2011年8月1日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，其保藏號為CGMCC No.5105。所述植物乳桿菌R23不僅高產蘋果酸乳酸酶，具有良好的生物降酸能力，而且具有以下所述的較強的益生特性①較強的抗逆性，②較強的抗氧化能力，③較強的粘附能力。所述植物乳桿菌在含有蘋果酸的果酒中能夠優先利用蘋果酸，經蘋果酸乳酸發酵，實現生物降酸。所述植物乳桿菌能用于果汁飲料加工中生產發酵型無菌果汁飲料，所述植物乳桿菌能用于果汁飲料加工中生產發酵型乳酸菌活菌飲料。
文檔編號C12G3/02GK102358888SQ20111028156
公開日2012年2月22日 申請日期2011年9月20日 優先權日2011年9月20日
發明者任香蕓, 何志剛, 莊林歆, 李維新, 林曉姿, 梁璋成, 魏巍 申請人:福建省農業科學院農業工程技術研究所