專利名稱：萊茵衣藻油脂代謝基因CrDGAT2-5及其編碼蛋白與應用的制作方法
技術領域：
本發明屬微生物技術領域，涉及一種能顯著提高藻類中性脂含量的基因及其編碼蛋白與應用，特別涉及一種能顯著提高萊茵衣藻中性脂含量的萊茵衣藻油脂代謝基因 CrDGAT2-5及其編碼蛋白與應用。
背景技術：
隨著石油等化石燃料不可再生資源儲量日益減少，全世界各國都在尋求可持續發展的新能源。目前化石燃料的替代能源主要形式是燃料乙醇和生物柴油。生物柴油由于具備來源廣泛，成本低等優點，已經成為目前最有希望解決未來石油能源危機的可再生能源之一。目前，制備生物柴油的原料有餐飲廢棄油、動物油脂、各種油料作物和微藻。餐飲廢棄油來源有限；生產動物油脂成本高、周期長；植物油脂的生產又受到生產地域、季節周期等條件的制約，且大量種植油料作物用于生產生物柴油將會占用大量耕地和水資源同時將導致糧油作物價格上漲。微藻作為原料生產生物柴油具有極大的優勢種類多，來源廣泛、油脂成分可以直接生產生物柴油、吸收CO2有利于壞境改善、利用光能轉化為化學能的效率高、油脂含量高、繁殖迅速、只需荒地，不會與糧食生產爭水爭地、培養簡單易于大規模培養，因此以微藻為原料生產生物柴油已成為不可阻擋的趨勢。用于生產生物柴油的理想的藻株要求具備生長迅速、含油量高且脂肪酸組成適宜制備生物柴油等特點。目前微藻有三種選育方式直接從種質庫中篩選、人工誘變和利用生物基因工程與生物代謝工程人工制造工程藻株。前兩種方法費時費力且隨機性較強，第三種方法則最簡單最直接，可以快速完善理想的工程藻株來滿足各種生產需求。隨著分子生物學的發展，從分子水平揭示微藻油脂，主要是中性脂三酰甘油(TAG)的合成和代謝機理， 改良藻種，控制微藻的代謝產物流向，已成為利用微藻制備生物柴油研究的重點。迄今，微藻TAG的合成和代謝分子機理研究還很薄弱，只有少量萊茵衣藻油脂體的分離以及油脂體中蛋白質分離的零星報道，對微藻中TAG的形成和積累網絡途徑相關基因的功能了解甚微。二酰基甘油酰基轉移酶(Diacylgycerol acyltransferase, DGAT)是 TAG合成中的關鍵酶，作用是催化二酰甘油加上脂肪酸酰基形成三酰甘油。目前對高等植物的研究表明DGAT基因活性增強時可以提高9% -12%的油脂含量。DGAT有四種類型 DGAT1，DGAT2，WS/DGAT和細胞質內DGAT(Cytosolic DGAT)，在微藻中尚無DGAT基因家族的報道。對其它物種脂質合成途徑和代謝過程研究表明對微藻的DGAT基因的深入研究對提高微藻含油量以及品質具有重要意義，尤其是近年來新興的比較基因組學以及萊茵衣藻基因組測序的完成均為萊茵衣藻的TAG代謝途徑相關候選基因的研究提供了可能性。
發明內容
本發明的目的是提供一種能顯著提高藻類中性脂含量和生物量的萊茵衣藻油脂代謝基因CrDGAT2-5及其編碼蛋白與應用。
本發明所提供的能提高藻類中性脂含量和生物量的萊茵衣藻油脂代謝基因 CrDGAT2~5 (Chlamydomonas reinhardtii Diacylgycerol acyltransferase2~5)是以 JGI 萊茵衣藻基因數據庫公布的au. g4218_tl基因為模板設計特異性引物，擴增cDNA獲得，其序列如SEQ ID NO :1所示的核苷酸，該基因來源于萊茵衣藻，在JGI萊茵衣藻基因數據庫的名稱為au. g4218_tl，位于12號染色體8831356-8833893區域，含7個外顯子。對其研究發現該基因可以顯著提高萊茵衣藻中中性脂含量和生物量。上述萊茵衣藻油脂代謝基因CrDGAT2_5，根據其堿基序列分析而推測編碼 CrDGAT2-5 (Diacylgycerol acyltransferase2_5)蛋白質序列，其序列如 SEQ ID NO :2 所示的氨基酸殘基序列的蛋白質，蛋白ID為285889，是由320個氨基酸殘基組成的蛋白質。一種蛋白質，是將SEQ ID NO :2所示的蛋白質序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID NO :2所示的氨基酸殘基序列相同活性的由SEQ ID NO 2衍生的蛋白質。一種DNA序列，是將萊茵衣藻油脂代謝基因CrDGAT2-5經PCR擴增而得到，其序列如SEQ ID NO :3所示，與SEQ ID NO :1所示的核苷酸具有90%以上同源性且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。含有本發明基因的表達載體、細胞系及至少有15個核苷酸與由SEQ ID N0:1所示核苷酸序列或其互補鏈組成的DNA互補的DNA均屬本發明的保護范圍。采用任何一種引導外源基因在植物中表達的載體，將本發明所提供的萊茵衣藻油脂代謝基因CrDGAT2-5轉入藻類導致中性脂含量和生物量增加，在微藻中將此基因敲除 (或沉默)后中性脂含量降低。如通過電轉化法轉化萊茵衣藻，得到純合的CrDGAT2-5轉化子(即為CrDGAT2-5過量表達的單拷貝純合萊茵衣藻)。為了便于對轉基因細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所使用的載體進行加工，如加入了植物可選擇性標記或具有抗性的抗生素標記物。用于轉化的生物可以是細菌細胞，動物細胞和植物。一旦獲得一種轉化植物，其中已將本發明的DNA導入了基因組，就可能通過無性或有性繁殖獲得后代，或者從該植株及其后代通過克隆獲得繁殖材料來生產植物。用本發明DNA轉化的植物細胞，包含這些細胞的植物體，該植物后代和克隆后代，以及所有從該植物獲得的繁殖材料都屬于本發明中。本發明的基因可以用于制備該基因的重組蛋白。重組蛋白常如下制備將編碼本發明蛋白的DNA插入適當的表達載體，將該載體導入適當的細胞，培養轉化的細胞，為使這些細胞表達所述重組蛋白和純化所表達的蛋白。 重組蛋白可表達為與便于純化的其他蛋白融合的蛋白，如與谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)融合的蛋白。對宿主細胞沒有限制，只要該細胞適于表達所述重組蛋白。所得重組蛋白可用于制備與該蛋白結合的抗體。例如用本發明的純化重組蛋白或一部分免疫動物(如兔)，一段時間后采血，從而制備多克隆抗體。得到的抗體可用于檢測或純化本發明的蛋白和能與本發明蛋白互作的蛋白。相應的本發明包括能結合本發明蛋白的抗體。本發明以JGI萊茵衣藻基因數據庫公布的au. g4218_tl基因序列為模板進行擴增 cDNA獲得萊茵衣藻油脂代謝基因CrDGAT2-5，運用于萊茵衣藻中可以顯著提高中性脂含量和生物量，對提高微藻含油量以及品質具有重要意義。
圖 1 為 CrDGAT2-5 的 RT-PCR 擴增結果。M :DL2000 DNA 分子量標準；1 :CrDGAT2_5
擴增結果；圖2為CrDGAT2_5過量表達轉化子生物量的變化情況。圖3為CrDGAT2_5過量表達轉化子中性脂含量的變化情況。圖4為原始藻株組、pCAMBIA1302空載體組、pCAMBIA1302_CrDGAT2_5轉化組第六天時尼羅紅染色后熒光觀察圖；圖5CrDGAT2_5干涉藻株的生物量及中性脂含量變化圖。A)六組轉化子生物量的變化情況。B)六組轉化子中性脂含量的變化情況。圖6為Maa7/X^空載體轉化子和CrDGAT2_5干涉藻株尼羅紅染色后熒光觀察圖。圖7CrDGAT2_5基因在萊茵衣藻CC425中的亞細胞定位。圖8CrDGAT2_5基因在洋蔥表皮細胞中的亞細胞定位。圖9誘導的GST-CrDGAT2_5融合重組蛋白電泳圖。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。Marker均購自大連寶生物公司。下述實施例中，如無特殊說明，均為質量百分含量。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。實施例一 CrDGAT2_5的克隆1、萊茵衣藻總RNA的提取萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)藻株CC425，培養于光照培養箱， 100 μ mol HT2sec-1白光，全光照條件下，待生長至對數生長期，取藻液50mL，10000r/min離心Imin收集藻體，液氮速凍后碾磨成粉末，按照Trizol的方法提取總RNA02、引物設計根據JGI Chlamydomonas database上公布的au. g4218_tl基因序列為模板，設計如下特異性引物，進行PCR擴增CrDGAT2_5全長擴增引物引物序列(5，一3，)正向引物 ATGGCCTCTTACTTCCCCGGC反向引物 TCATTGCACGATGGCCAGCGG3、cDNA 的合成按照寶生物工程(大連)有限公司提供的Takara的試劑盒，使RNA反轉錄成cDNA。4、制備 PCR Master 混合物
試劑每管加入量(PL)
cDNA第一鏈1
IOXPCR緩沖液5
dNTP Mix (IOmM)1
正向引物1
反向引物1
PCR 級水40.5
LA Taq 酶 0.55、進行 PCR 擴940C 5min ;35 個循環94°C lmin，55°C lmin，72°C Imin ；72°C IOmin0取8 μ L進行瓊脂糖凝膠電泳分析結果如圖1，-20°C保存。6、PCR產物的純化和膠回收按照上海華舜生物工程有限公司的小量膠回收試劑盒回收DNA片斷，PCR產物連接到pGEM-T Vector (promega公司)，轉化大腸桿菌DH5 α，挑選陽性克隆測序。7、CrDGAT2-5基因生物信息學分析來源于萊茵衣藻的CrDGAT2_5推測的蛋白質含有320個氨基酸，經ExPASy數據庫中蛋白質軟件(http://eXpaSy. org/tools/)分析其分子量為35kD，等電點為9. 27，為一種疏水蛋白質。實施例二 過量表達CrDGAT2_5基因的轉化子獲得1、植物雙元表達載體的構建設計帶有NcoI和Spe I酶切位點的引物(正向5，-AGAACCATGGCAGGTGGAAAGTCAA ACGG-3，；反向5，-CATAACTAGTCTACTCGATGGACAGCGGG-3，) ,PCR 擴增 CrDGAT2_5 基因全長。NcoI 和Spe I雙酶切修飾后的CrDGAT2-5產物和pCAMBIA1302的NcoI和Spe I雙酶切載體大片段進行連接。連接產物轉化大腸桿菌DH5ci，PCR鑒定陽性克隆，提取質粒進行雙酶切鑒定。提取正確的重組表達質粒pCAMBIA1302-CrDGAT2-5，用于轉化。2、過量表達CrDGAT2_5萊茵衣藻轉化子的獲得(電轉化法)萊茵衣藻(藻株CC425，購自中國科學院水生生物研究所)，培養于光照培養箱，lOOymol m^sec"1白光，全光照條件下，待生長至藻細胞數為2 X IO7個/mL ;2000rpm離心5min，收集藻細胞；無菌去離子水洗滌沉淀并重復3次，用含60mM蔗糖的TAP液體培養基(2.42g/L Tris-base+lml/L冰醋酸+119mg/L K2HP04+61mg/LKH2P04+0. 4g/L NH4Cl+0. lg/ LMgSO4 · 7H20+50mg/LCaCl2 · 2H20+lml/LTrace)重懸沉淀；冰浴 IOmin ；取藻液加入重組質粒，混勻后轉移至電擊杯中，室溫靜置5min ；1. 5kV, 10 μ F, 200 Ω, 6msec條件下電擊，室溫靜置lOmin，加入5mL TAP液體培養基，22 °C，lOOrpm，昏暗光線復蘇他；2000rpm,離心 5min,收集藻細胞，調節藻細胞數目到1 X IO6個/mL ；轉移藻液至含1. 5mM L-色氨酸、5 μ g/ mLL-paromomycin的TAP固體選擇培養基上，緩慢傾斜旋轉，使藻液分布均勻；關閉光源，吹干，24°C光照培養箱，IOOymol n^sec—1白光，全光照條件下培養至形成單個藻落。3、對照萊茵衣藻的獲得
用pCMBIA1302代替pCMBIA1302_CrDGAT2_5，用電轉化法轉化萊茵衣藻CC425，方
法同步驟2，得到轉空載體的藻株。實施例三CrDGAT2_5過量表達藻株的生理表型觀察轉pCMBIA1302空載體組、CrDGAT2_5過量表達組、原始藻株CC425，各選100個藻株，培養于光照培養箱，IOOymol n^sec—1白光，全光照條件下，待生長至對數生長期，2000rpm，離心5min，雙蒸水重懸，按10 %接種量接種到不含抗生素的HSM-N液體培養基(2g/LNaAc · 3H20+1. 44g/L K2HP04+0. 72g/L KH2P04+0 . 54 6 7g/L NaCl+20mg/ LMgSO4 · 7H20+10mg/LCaCl2 · 2H20+lml/L Trace-N)，連續震蕩培養 6 天。每 24h 測量以下生理值。1、生物量統計按照Harris于1989年描述的方法使用血球計數板計數，并計算出生物量。結果顯示過量表達CrDGAT2-5基因的藻株比非轉基因藻株CrCC425和轉空載體藻株生物量明顯增加了。在第6天時增長最高，相對于非轉基因藻株CrCC425和轉空載體藻株生物量分別提高39%和178%。，轉空載體的藻株生物量略微下降了(圖2)。2、中性脂含量測定使用尼羅紅熒光法測量中性脂含量各取200 μ L藻液加入標準96孔酶標板中， 在多熒光功能酶標儀中，測定激發光和發散光波長分別為470nm和570nm測量熒光值，讀數Al ；用終濃度為0. 1 μ g/mL尼羅紅染色藻液lOmin，再次使用多熒光功能酶標儀測量熒光值，讀數A2 ；根據公式中性脂含量(mg/L) = 0. 0208(A2-A1)+11. 7112，計算得到數據并作圖。CrDGAT2-5過量表達藻株的中性脂含量比非轉基因藻株和轉空載體的藻株提高了 20-40% (圖3)。另取藻液，經終濃度為10 μ g/mL尼羅紅染色IOmin后，使用熒光顯微鏡在激發光為480nm，發散光為560歷-600歷下進行觀察及拍照，也可見過量表達CrDGAT2_5基因中性脂含量明顯升高(圖4)。實施例四干涉表達CrDGAT2_5基因的轉化子的獲得1、植物干涉表達載體的構建設計特異性引物(正向5，-ATGGCCTCTTACTTCCCCGGC-3，；反向5，-TCATTGCACG ATGGCCAGCGG-3’)擴增CrDGAT2_5基因286bp片段用于干涉研究。正義片段分別在正向和反向引物引入HindIII和XbaI位點，擴增的PCR產物和RNAi中間載體T2251載體分別經 HindIIIAbaI雙酶切后，連接，轉化，鑒定，測序確定正確的陽性克隆。反義片段在正向和反向引物中分別引入BamHI與Mil位點，經過BamHI和Mil雙酶切后，與同樣經BamHI/ SalI雙酶切修飾已連接正義片段的Τ2251載體連接，轉化，鑒定獲得CrDGAT2_5反向重復序列插入的中間載體T2251-CrDGAT2-5。EcoRI酶切Maa7/X^載體并去磷酸化與同樣經 EcoRI酶切的T2251-CrDGAT2-5載體連接，轉化，鑒定得到用于RNA干涉的最終載體Maa7/ XIR-CrDGAT2-502、干涉表達CrDGAT2_5萊茵衣藻的獲得采用電轉化法轉化萊茵衣藻CC425，具體步驟參見實施例二中步驟2。3、對照萊茵衣藻的獲得用Maa7/X^代替Maa7/XIR-CrDGAT2_5用電轉化法轉化萊茵衣藻CC425，方法同步驟2，得到轉空載體的藻株。
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實施例五CrDGAT2_5干涉表達藻株的生理表型觀察CrDGAT2-5干涉表達組，待長出單個藻落后，接種到含1. 5mM L-色氨酸、5 μ M5-FI 的TAP固體選擇培養基上，轉載體組直接接種到含1. 5mM L-色氨酸、5 μ g/ mL Paromomycin的TAP固體選擇培養基上，培養于光照培養箱，100 μ mol n^sec—1白光，全光照條件下，待第三次長出單個藻落，挑取陽性轉化子，接種到HSM液體培養基Qg/ LNaAc · 3H20+1. 44g/L K2HP04+0. 72g/L KH2P04+0. 5g/LNH4Cl+20mg/LMgS04 · 7H20+10mg/ LCaCl2 · 2H20+lml/L Trace)中，連續震蕩培養9天。每24h測量以下生理值。生物量和中性脂含量的測定參照實例3。結果CrDGAT2_5干涉表達的藻株生物量明顯降低，在第9天時下降了 48% ；中性脂含量同樣呈下降趨勢，在第9天時下降最多，降低了 74% (圖0，CrDGAT2-5干涉表達組的中性脂含量下降也可以通過尼羅紅染色后照相明顯可見(圖6)。實施例六CrDGAT2_5基因的亞細胞定位取pCAMBIA1302-CrDGAT2-5過量表達的藻株和pCAMBIA1302空載體轉化組及空白CC2255藻株在熒光顯微鏡下觀察，發現CrDGAT-5在細胞質中表達強烈(圖7)，將 pCAMBIA1302-CrDGAT2-5質粒采用基因槍轟擊洋蔥表皮細胞后觀察也發現CrDGAT2_5基因定位于細胞質(圖8)。實施例七CrDGAT2_5重組蛋白的獲得l、CrDGAT2_5蛋白表達載體的構建設計CrDGAT2_5全長擴增引物(正向5，-AATCGGATCCATGGCCTCTTA CTTCCCC-3，)和(反向5，-ATAAGTCGACTCATTGCACGATGGCCAGCGG-3，)，分別引入 BamHI 和 Sal I 酶切位點， 進行PCR擴增。PCR產物和pGEX-6P-l載體均經BamHI和Mil雙酶切后，回收，連接，轉化大腸桿菌BL21。鑒定，挑取正確的陽性克隆。2、GST-CrDGAT2-5融合重組蛋白的誘導轉化質粒pGEX-6P-l-CrDGAT2-5的BL21菌，在37 °C搖床培養至對數生長期，加入終濃度ImM的IPTG，220rpm，37°C誘導4小時，離心菌體，進行SDS-PAGE電泳，誘導的 GST-CrDGAT2-5融合重組蛋白大小為61kD(圖9)，CrDGAT2_5蛋白與預期的35kD —致。
權利要求
1.一種萊茵衣藻油脂代謝基因CrDGAT2-5，其特征是來源于萊茵衣藻，其序列如SEQ ID NO :1所示的核苷酸。
2.—種權利要求1所述的基因的編碼蛋白，其特征是將根據權利要求1所述序列分析而推測得到，其序列如SEQ ID NO :2所示的氨基酸殘基序列的蛋白質，蛋白ID為285889， 是由320個氨基酸殘基組成的蛋白質。
3.—種權利要求2所述的編碼蛋白的衍生蛋白質，其特征是將SEQ ID NO :2所示的蛋白質序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID NO :2所示的氨基酸殘基序列相同活性的由SEQ ID NO :2衍生的蛋白質。
4.一種DNA序列，其特征是將萊茵衣藻油脂代謝基因CrDGAT2-5經PCR擴增而得到，其序列如SEQ ID NO :3所示，與SEQ ID NO :1所示的核苷酸具有90%以上同源性且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。
5.一種植物表達載體，其特征是利用SEQ ID NO =USEQ ID NO :2或SEQ ID N0:1所示序列構建的表達載體，用于提高植物的中性脂含量和生物量。
全文摘要
本發明涉及一種萊茵衣藻油脂代謝基因CrDGAT2-5及其編碼蛋白與應用，所述萊茵衣藻油脂代謝基因CrDGAT2-5是以JGI萊茵衣藻基因數據庫公布的au.g4218_t1基因為模板進行擴增cDNA獲得，其序列如SEQ ID NO1所示的核苷酸；其編碼蛋白是根據其堿基序列分析而推測編碼CrDGAT2-5蛋白質序列，其序列如SEQ ID NO2所示的氨基酸殘基序列的蛋白質；將該基因運用于萊茵衣藻進行植物表達可以顯著提高萊茵衣藻中中性脂含量和生物量。本發明以JGI萊茵衣藻基因數據庫公布的au.g4218_t1基因為模板進行擴增cDNA獲得萊茵衣藻油脂代謝基因CrDGAT2-5，運用于萊茵衣藻中可以顯著提高中性脂含量和生物量，對提高微藻含油量以及品質具有重要意義。
文檔編號C12N9/10GK102321642SQ20111027668
公開日2012年1月18日 申請日期2011年9月16日 優先權日2011年9月16日
發明者羅秋蘭, 費小雯, 辜博, 鄧曉東 申請人:中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所