專利名稱：化學合成的HBV 1.2x基因組、表達系統及其構建方法
技術領域：
本發明涉及是關于一種化學合成的HBV1. 2x基因組、表達系統及其構建方法。
背景技術：
合成生物學是新生交叉學科，對生命過程或生物體進行有目標的設計、改造、重新合成改造乃至重新合成，有助于解決生物醫藥、環境能源、生物材料等問題，對于解決國計民生相關的重大生物技術問題有著長遠的戰略意義和現實意義。一般的合成過程是把目標DNA序列分成大小不同的DNA的片段,化學合成每段寡核苷酸，寡核苷酸包含與其它寡核苷酸的重疊片段，經過PCR和連接酶鏈反應，得到全長的DNA，由測序驗證保證序列100%準確。發明內容
本發明的目的是針對現有技術的不足，提供一種不依賴天然模板、可以根據需要改造的化學合成的HBV1. 2x基因組、表達系統及構建方法。
為實現上述目的，本發明采用了以下技術方案一種化學合成的HBV1. 2x基因組， 所述HBV1. 2x基因組的DNA序列為SEQ ID NO :1所示的第一序列。
進一步的，所述第一序列由SEQ ID NO :2所示的第二序列改造而成，所述第二序列的1501-3215片段和1-2150片段構成改造序列，改造序列對應第二序列的1501-3215片段和1-2150片段，其中1501-3215片段的第1909個核苷酸由T突變為C、第1912個核苷酸由C突變為T、第2248個核苷酸由T突變為C，在改造序列(對應第二序列的1501-3215， 1-2150，其中包含上述三個突變點)的兩端均加入序列GATATC(即EcoRV酶切位點)得到所述第一序列。
一種HBV基因型/基因亞型表達系統，包括表達載體及克隆到所述表達載體的所述的HBV 1.2x基因組。
所述表達載體是pcDNA3.1。
一種所述的表達系統的構建方法，包括如下步驟
a)獲得HBV1. 2x基因組，所述HBV1. 2x基因組的DNA序列為SEQ ID NO 1所示的序列；
b)將所述HBV1. 2x基因組克隆到真核表達載體；
c)轉染人肝癌細胞株H印G2細胞，得到所述表達系統。
一種HBV基因型/基因壓型快速診斷試劑盒，包括重組質粒，所述重組質粒包括真核表達載體及插入所述真核表達載體的所述的HBV1. 2x基因組，所述重組質粒的HBV基因型/基因亞型特異性片段用作陽性對照模板。
本發明的有益效果是本發明不用依賴天然模板，而且可以根據需要進行改造； 本發明HBV1. 2x基因組構建重組質粒pcDNA3.1 (+)/HBV，然后轉入肝腫瘤細胞系!fepG2細胞，培養上清中檢測到HBV特異性抗原HBe Ag和HBs Ag，從而能夠實現HBV特異性抗原的表達。
圖1是本發明重組質粒pcDNA3.1 (+) /HBV結構示意圖。
具體實施方式
下面通過具體實施方式
結合附圖對本發明作進一步詳細說明。
本發明HBV1. 2x基因組是由現有HBV基因組改造，本發明HBV1. 2x基因組的序列為SEQ ID NO :1所示的第一序列，現有HBV基因組的序列為SEQ ID NO 2所示的第二序列。現有HBV基因組的相關信息如下HBV subtype C2, genotype C ;GenBank :FJ899789.1。 改造序列對應第二序列的1501-3215片段和1-2150片段，其中1501-3215片段的第1909 個核苷酸由T突變為C、第1912個核苷酸由C突變為T (該位點可以作為Clal酶切位點)、 第2248個核苷酸由T突變為C(該位點可以作為Xhol酶切位點)，然后在突變后的改造序列的兩端均加入序列GATATC (該兩端可以作為EcoRV酶切位點)，得到第一序列。
如圖1所示，把合成得到的第一序列插入到PCDNA3.1 (+)的EcoRV位點，構建重組質粒pcDNA3.1 (+) /HBV,然后轉入肝腫瘤細胞系IfepG2細胞，培養上清中檢測到HBV特異性抗原HBeAg和HBsAg，其檢測結果如表I所示
表I ELISA檢測轉染細胞上清液特異性分泌蛋白
權利要求
1.一種化學合成的HBV1. 2x基因組，其特征在于所述HBV1. 2x基因組的DNA序列為SEQ ID NO :1所示的第一序列。
2.如權利要求1所述的HBV1. 2x基因組，其特征在于所述HBV1. 2x基因組的DNA序列為SEQ ID NO 1所示的第一序列，所述第一序列由SEQ ID NO 2所示的第二序列改造而成，改造序列對應所述第二序列的1501-3215片段和1-2150片段，所述1501-3215片段的第1909個核苷酸由T突變為C、第1912個核苷酸由C突變為T、第2248個核苷酸由T突變為C，在所述改造序列的兩端均加入序列GATATC得到所述第一序列。
3.一種HBV基因型/基因亞型表達系統，其特征在于包括表達載體及克隆到所述表達載體的如權利要求1或2所述的HBV1. 2x基因組。
4.如權利要求3所述的表達系統，其特征在于所述表達載體是pcDNA3.1。
5.一種如權利要求3所述的表達系統的構建方法，其特征在于包括如下步驟 a)獲得HBV1. 2x基因組，所述HBV1. 2x基因組的DNA序列為SEQ ID NO 1所示的序列； b)將所述HBV1. 2x基因組克隆到真核表達載體； c)轉染人肝癌細胞株H印G2細胞，得到所述表達系統。
6.如權利要求5所述的構建方法,其特征在于所述真核表達載體為pcDNA3.1。
7.一種HBV基因型/基因亞型快速診斷試劑盒，其特征在于包括重組質粒，所述重組質粒包括真核表達載體及插入所述真核表達載體的如權利要求1或2所述的HBV1. 2x基因組，所述重組質粒的HBV基因型/基因亞型特異性片段用作陽性對照模板。
全文摘要
本發明公開了一種化學合成的HBV 1.2x基因組、表達系統及構建方法，所述HBV 1.2x基因組的DNA序列為SEQ ID NO1所示的第一序列。所述第一序列由SEQ ID NO2所示的第二序列改造而成，所述改造序列(對應第二序列的1501-3215，1-2150)，其中1501-3215片段的第1909個核苷酸由T突變為C、第1912個核苷酸由C突變為T、第2248個核苷酸由T突變為C，在改造序列的兩端均加入序列GATATC得到所述第一序列。根據本發明HBV1.2x基因組構建重組質粒pcDNA3.1(+)/HBV，然后轉入肝腫瘤細胞系HepG2細胞，培養上清中檢測到HBV特異性抗原HBe Ag和HBs Ag，從而能夠實現HBV特異性抗原的表達。
文檔編號C12Q1/70GK102994519SQ20111027375
公開日2013年3月27日 申請日期2011年9月15日 優先權日2011年9月15日
發明者蔡志明, 韓永華, 唐愛發, 劉宇辰, 段永剛, 楊銳林, 葉藝旺 申請人:蔡志明, 韓永華, 唐愛發, 劉宇辰, 段永剛, 楊銳林, 葉藝旺