專利名稱：一種機械法分離培養豬精原干細胞的方法
技術領域：
本發明涉及細胞分離培養領域，具體涉及一種機械法分離培養豬精原干細胞的方法。
背景技術：
精原干細胞(Spermatogonial stem cells, SSCs)是位于雄性動物睪丸曲細精管基膜上既能自我更新維持自身群體數量恒定，又能定向分化，最終產生精子的一類未分化的A型精原細胞，也是成體內唯一可復制的多潛能雙倍體細胞。體外分離SSCs的方法主要集中在機械法和酶消化法相結合的方法，現在主要通過酶消化的方式獲得SSCs，再通過各種純化手段最終得到單一的SSCs，是否純化后更有利于 SSCs 增殖，也說法不一。而目前 PSSCs(Porcine spermatogonial stem cells, PSSCs) 增殖培養的方案還不成熟，其調節機制尚未清楚解析。PSSCs培養仍然存在著較大困難，更多的問題還有待更深入研究。胰蛋白酶作為常規的細胞消化試劑，是酶消化法中的主要用酶，廣泛應用于多種類型的組織和細胞消化，但是胰蛋白酶消化后，細胞表面的粘附分子或膜蛋白極易受到破壞，對于這類具有立體結構用以維持細胞增殖及自我更新的細胞來說，很難迅速恢復細胞狀態。往往伴隨著大范圍的細胞死亡/凋亡。早期通過使用胰蛋白酶消化成功獲得了小鼠胚胎干細胞(Embryonic stem cells, ES細胞)，但分離效率卻很低。神經干細胞(Neural stem cell，NSC)以及人胚胎干(hES)細胞在胰蛋白酶消化后，極容易死亡，很難獲得傳代培養，因而多用機械分割法進行傳代。組織塊培養法是一種常用細胞分離方法，最常見于一些成纖維組織細胞分離培養，其實驗操作簡單，成功率高，避免了酶消化對細胞影響。目前研究的純化方法主要有流式細胞分選法(Fluorescence activated cell sorting，FACS)、免疫磁珠細胞分選法(Magnetic-activated cell sorting，MACS)、自然重力沉降法、差速貼壁分選法和密度梯度分選法等。但各種方法都存在著不足。在現有研究背景下，我們使用的機械法分離PSSCs，避免了使用酶消化的方式，減少了酶對細胞損傷作用，更符合機體內環境條件，在已篩選的培養體系里較快和較早得到PSSCs的克隆。故機械法分離培養PSSCs的方法是一種簡單有效的分離方法。
發明內容
本發明的目的在于根據現有的細胞分離培養方法中存在的不足，提供一種分離容易、培養要求低、操作簡單、降低實驗成本的機械法分離培養PSSCs的方法。本發明上述目的通過以下技術方案予以實現
一種機械法分離培養豬精原干細胞的方法，包括如下步驟
(1)將仔豬的睪丸放入盛有PBS的容器中，用PBS洗滌2 3次，除去血污；
(2)去掉睪丸白膜和結締組織，將剩下的睪丸組織剪碎，轉移到離心管中；
(3)加入10倍體積的PBS，用吸管吸打，160C >600 rpm離心5 min，棄上清；(4)重復步驟(3)2^3次，得到豬睪丸曲細精管；
(5)將豬睪丸曲細精管接種到事先用0.1 %明膠包被的培養瓶，放入培養箱中進行無菌培養。作為一種優選方案，上述方法中，所述細胞培養箱的培養條件為37 5% CO2，飽和濕度。作為一種優選方案，上述方法中，所述細胞培養時所用的細胞培養液主要成分為 DMEM 83 %，L-谷氨酰胺1 %，非必需氨基酸1 %，β-巰基乙醇55 μ Μ，胎牛血清15 %。通過本實驗方法獲得大量PSSCs克隆團后，通過機械法挑取切割克隆團，后接種到新的飼養層上，進行傳代培養，可進行誘導分化，誘導IPS細胞和轉基因動物等方面的研與現有技術相比，本發明具有如下有益效果
目前SSCs分離方法要么程序復雜，要么就耗時長、對細胞活力影響較大、或者丟失目的細胞多、或者實驗成本很高。而且實驗成功率一般不高，一定程度上存在細胞增殖困難和獲得目的細胞難等問題。而我們通過直接培養曲細精管的方法，可以快速獲取大量的PSSCs 增殖。并通過機械法挑取克隆團，來純化PSSCs。這種方法操作簡單，步驟少，大大降低了實驗成本，而且成功率高，獲得細胞多，效果好，是一種新的有效的獲取PSSCs的實驗方法，這種方法不僅解決了現實中，PSSCs少，分離難，培養難，純化復雜的問題。但目前它主要的缺點是大量曲細精管較難被剪成理想片段，以及接種數目很難確定等問題，但是比起優點這種方法是可以獲得較好的實驗結果，很容易較快速的得到大量的PSSCs增殖的方法，所以比起常用的方法，它是一個創新的，高效的方法，可以應用于PSSCs的科學研究。
圖1接種曲細精管后，小段的曲細精管開始懸浮在培養瓶中；
圖2培養2 d時，曲細精管貼到了培養瓶底部，細胞開始向四周擴散孵出； 圖3培養3 d時，曲細精管形態消失，細胞開始快速向四周擴散增殖； 圖4培養4 d時，大量PSSCs克隆團產生看，邊緣整齊，折光性好； 圖5培養4 d時，低倍鏡下觀察獲得的PSSCs克隆團； 圖6堿性磷酸酶檢測為陽性結果圖； 圖7免疫熒光檢測前的原始圖片； 圖8免疫熒光檢測Hochest染細胞核圖； 圖9免疫熒光特異表達0ct4結果圖10 RT-PCR分子檢測，機械法培養得到PSSCs克隆團表達干細胞多能性基因。
具體實施例方式以下結合實施例來進一步解釋本發明，但實施例并不對本發明做任何形式的限定。實施例1豬精原細胞的獲取及培養
(1)在超凈臺上，將仔豬的睪丸放入盛有PBS的培養皿中，并用PBS洗滌2 次，除去血污；(2)去掉睪丸白膜，用尖鑷子去掉睪丸實質中的結締組織，將剩下的睪丸組織用虹膜剪剪碎碎，直到看不到微小組織塊為宜，轉移到15 ml離心管中；
(3)加入10倍體積的PBS，用吸管輕輕吸打，然后16°C,600 rpm離心5 min，棄掉上清。如此反復洗滌廣3次；
(4)調整曲細精管數量，接種到事先用0.1%明膠包被的25 cm2培養瓶，在37 ° C、5 % CO2、飽和濕度無菌培養箱條件下培養(圖廣5)。實施例2堿性磷酸酶(Alkaline Phosphatase, AP)陽性檢測
將待檢測的PSSCs，用PBS洗1遍；4 %多聚甲醛室溫下固定20 min, PBS洗三遍，每次 5 min ；加入1 mL堿性磷酸酶緩沖液，并且加入NBT 6. 6 μ L和BCIP (vector)各3. 3 μ ， 做個混合管，充分混勻；室溫下閉光孵育1(T15 min，用PBS清洗，及時終止反應，在顯微鏡下觀察并拍照(如圖6)。通過AP染色可以初步判斷一步酶法所得到的克隆團是PSSCs克隆。實施例3 PSSCs的免疫熒光鑒定檢測
(1)細胞爬片制作好以后，取出爬片用37V PBS洗滌3次，每次;Γ5 s ；
(2)用4%多聚甲醛固定1(T30 min ；PBS沖洗2次，每次5 min ；
(3)0. 5 % Triton穿孔破膜處理15 min ；PBS漂洗2次，每次5 min ；
(4)1 % BSA封閉30 min (封閉完不用洗)；
(5)加入1% BSA稀釋的一抗，于4 °C過夜；PBS漂洗2次，每次5 min ；
(6)加入1% BSA稀釋的二抗，于37 0C /1 h ；PBS漂洗2次，每次5 min ；
(7)10 μ g/mL Hochest染色5 min ；抗淬滅封片，拍照。通過免疫熒光檢測機械法所得到克隆團，它特異表達了 0ct4重要干細胞標志基因，證明它是PSSCs克隆團(圖9)。實施例4通過RT-PCR進行分子檢測鑒定SSCs
將收集到得PSSCs克隆團，用PBS清洗2次，離心收集細胞。1.總RNA提取(按照TIANGEN公司總RNA提取試劑盒說明書) 2總RNA樣本的檢測
(1)總RNA完整性通過普通瓊脂糖凝膠電泳檢測
制備1.5 %瓊脂糖凝膠稱取1.5 g瓊脂糖粉，溶于100 mL 1 XTAE中，微波爐內煮沸， 待溶液冷卻到5(T60 °C時加入ΕΒ，灌注凝膠，室溫放置30 min，使膠凝固；加樣電泳取約 4^5 PL總RNA，加入3 PL上樣緩沖液，混合后加入點樣孔內，5 V/cm電壓電泳15 20 min ； 電泳結束，觀察并拍照。(2)濃度及純度檢測
取總RNA樣品1 PL，稀釋50倍，用紫外分光光度計于沈0 11111和觀0 nm波長處測定OD值。3總RNA反轉錄方法參考(東洋紡的First strand cDNA合成試劑盒說明書) 4引物設計與合成
根據 NCBI 發表的關于基因 0ct4、Sox2、C_myc、Klf4、Nanog、Prdml4 和 β -actin 的序列，采用genetool軟件設計引物，并由上海生工生物技術有限公司合成，引物序列信息見表2。
權利要求
1.一種機械法分離培養豬精原干細胞的方法，其特征在于包括如下步驟(1)將仔豬的睪丸放入盛有PBS的容器中，用PBS洗滌2 3次，除去血污；(2)去掉睪丸白膜和結締組織，將剩下的睪丸組織剪碎，轉移到離心管中；(3)加入10倍體積的PBS，用吸管吸打，160C >600 rpm離心5 min，棄上清；(4)重復步驟(3)2^3次，得到豬睪丸曲細精管；(5)將豬睪丸曲細精管接種到事先用0.1 %明膠包被的培養瓶，放入培養箱中進行無菌培養。
2.根據權利要求1所述的機械法分離培養豬精原干細胞的方法，其特征在于所述細胞培養箱的培養條件為37 5 % CO2，飽和濕度。
3.根據權利要求1所述的機械法分離培養豬精原干細胞的方法，其特征在于所述細胞培養時所用的細胞培養液主要成分為=DMEM 83 %，L-谷氨酰胺1 %，非必需氨基酸1 %， β -巰基乙醇55 μ Μ,胎牛血清15 %。
全文摘要
本發明公開了一種機械法分離培養豬精原干細胞的方法。本發明所述方法是結合動物睪丸組織的特點，采用機械法分離后將組織塊進行培養，豐富了現有精原干細胞的分離純化方法。本發明所述方法不用通過酶消化就能獲得豬精原干細胞，細胞克隆快，狀態好，解決了精原干細胞分離難、數量少、培養條件要求高等問題，比起現有的分離技術，本發明方法操作簡單，降低了獲得細胞的難度，大大降低了實驗成本，提高了實驗成功率，應該在本領域進行推廣。
文檔編號C12N5/076GK102311941SQ201110272928
公開日2012年1月11日 申請日期2011年9月15日 優先權日2011年9月15日
發明者張守全, 白銀山 申請人:華南農業大學