添加劑預混料樣品中釀酒酵母的快速定性、定量測定方法

專利名稱：添加劑預混料樣品中釀酒酵母的快速定性、定量測定方法
技術領域：
本發明屬于飼料科學與飼料添加劑檢測技術領域，具體涉及一種添加劑預混料樣品中釀酒酵母的快速定性、定量測定方法。
背景技術：
微生態飼料添加劑因其豐富的營養價值和特殊的益生功效以及綠色環保特性而成為預混料領域人們關注的熱點。目前市場上的微生態飼料添加劑種類繁多，并且每年以高速度增長。盡管微生態飼料添加劑在畜牧養殖業上的應用日益廣泛，但尚未形成統一的質量標準和完善的管理機制，對其質量的監管和認證，尤其在定性、定量檢測方面缺乏科學、合理、快速的方法，究其原因是基礎研究薄弱，現有檢測技術或檢測周期長、或不能區分死菌活菌、或成本高，難以建立標準化檢測技術。傳統方法中對釀酒酵母菌的定性、定量檢測，仍采用生理生化反應和選擇性培養基純培養分離技術的方法。傳統方法易受外界環境因素和培養性能的影響，檢測結果缺乏穩定性和可靠性，且耗時耗力。現階段急需從生產實際出發，逐步建立起科學有效的、易于推廣的飼用菌種快速高效標準化檢測技術，促進微生態飼料添加劑行業的可持續發展。PCR技術一經出現就被廣泛應用于分子生物學和微生物學等領域。實時熒光定量 PCR(Real-time PCR)的出現更是實現了 PCR技術從定性到定量的飛躍，避免了傳統PCR定量鑒定中交叉污染的問題。具有特異性強、重復性好、準確、快速等優點，成為了分子生物學和微生物領域定量檢測的重要方法。

發明內容
要解決的技術問題本發明的目的在于提供一種添加劑預混料樣品中釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的快速定性測定方法。本發明的另一個目的是提供一種添加劑預混料樣品中釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的快速定量測定方法。本發明采用釀酒種屬特異性PCR和實時熒光定量PCR技術，建立簡便、快速、準確的添加劑預混料中釀酒酵母快速分子檢測方法，可簡化釀酒酵母的檢測程序、提高檢測效率。技術方案本發明是通過下述技術方案實現的本發明提供一種添加劑預混料樣品中釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的快速定性測定方法，該方法使用釀酒酵母的DNA為模板，以釀酒酵母的^s rDNA基因序列的種屬特異性引物進行種屬特異性PCR反應，擴增片度長度為134bp，進而快速定性釀酒酵母；所述的種屬特異性引物如下上游引物DZf 5 ’ -CGAGAGACCGATAGCGAACA-3 ’，下游引物 OZr5' -AAGGAGCAGAGGGCACAAA-3，。
進一步，該方法的步驟如下A.模板DNA的制備采用玻璃珠法制備飼料樣品模板DNA (1)取Ig含有釀酒酵母菌的預混料樣品于1. 5mL離心管中，加入500 μ LPBS懸浮樣品，2500 Xg離心3min ；(2)棄上清，加入適量酸洗過的玻璃珠，劇烈震蕩aiiin ；(3)加入400 μ L TE及等體積的Tris飽和酚，翻轉混勻，15000 Xg離心5min ；(4)轉移水相至一新離心管，加入等體積酚氯仿異戊醇=25 24 1的混合物，顛倒混勻，15000 Xg離心5min ；(5)吸上清至一新離心管，加入1/10體積3mol/L NaAc及2. 5倍體積95%冰乙醇，-20°C過夜；(6) 4"C 15000 Xg 離心 lOmin，棄上清；(7)加入 lmL70% 乙醇，15000Xg 離心 5min，棄上清；(8)37°C放置15min干燥沉淀，沉淀溶于60 μ L TE中，_20°C保存備用；B. PCR 擴增反應體系25. Ομ L :12. 5μ L 2XPCR_mix、各 1 μ L 10mmol/L 上、下游引物、1 μ L 50ng/ μ L DNA模板、二次蒸餾水補足至25. 0 μ L ；PCR 反應條件94°C預變性 5min，94°C 30s,60°C 45s，72°C 40s，進行；35 個循環， 72°C最終延伸7min，得到的PCR產物，在溫度4°C下保存；取5 μ LPCR產物，1 %瓊脂糖凝膠電泳進行檢測；C.結果及判斷檢測時設以目的擴增片度的膠回收產物作為模板為陽性對照，以滅菌水作為模板為陰性對照；根據在134bp處出現預期特征條帶，確定該預混料樣品中含有釀酒酵母，相反地則不合有釀酒酵母。本發明還提供一種添加劑預混料樣品中釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) 的快速定量測定方法，該方法以待測樣品cDNA和標準品的cDNA為模板，使用定性測定方法中所述的上游引物和下游引物，以相同的體系同時進行釀酒酵母26s rDNA D1/D2的基因片段的熒光定量PCR擴增；通過標準曲線和待測樣品的Ct值進行預混料樣品中釀酒酵母的快速定量檢測。進一步，該方法的步驟如下A.樣品總RNA的制備采用酶法破除釀酒酵母細胞壁，高純總RNA，快速提取試劑盒提取樣品總RNA 樣品0. 5-1. Og加入到1. 5mL離心管中，加入600 μ L山梨醇Buffer,加入50U Lyticase,充分混勻30°C處理30min，1500Xg離心IOmin后，棄上清，收集沉淀，提取樣品RNA，然后用 DNase I處理兩次，得到純化的RNA樣品，使用紫外分光光度儀測定濃度，采用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，然后將樣本保存于-80°C ；B.反轉錄擴增(1)在冰浴的無核酸酶的離心管中加入如下反應混合物1-5μ g 總 RNA、2y L Oligo (dT) 15,2 μ LdNTP (2. 5mM each)、補 RNase_freeddH20定容至14. 5μ L ；(2)70°C加熱5min后迅速在冰上冷卻2min，快速離心反應液后加入以下組分 4μ L 5XFirst-Strand Buffer(含有 DTT) ；0. 5μ L RNasin ；(3)加入 1 μ L (200U) TIANScript M-MLV,輕輕用移液器混勻；(4)42°〇溫浴50111士11;(5) 95°C加熱5min，終止反應，置冰上進行后續實驗或冷凍保存；(6)用RNase-free ddH20將反應體系稀釋到50 μ L。_20°C保存備用；C.熒光定量PCR反應體系25. 0μ L :12· 5μ L 2XSuperReal PreMix(含 STOR Green I)、各 0.75 μ L ΙΟμ θΙ/L 上下游引物 DZf和 DZr，2.0yL cDNA模板、0.5yL 50 X ROXReference Dye、補 RNase—free ddH20 M 25 μ L 體系；熒光定量PCR反應參數95°C預變性15min ；95°C變性10s，60°C退火32s，40個循環；4°C保存；每個樣品重復3次；D.外標準品的制備和標準曲線的繪制外標準品的制備利用分光光度計將過夜培養的釀酒酵母菌發酵液稀釋至10D， 按照上述提取總RNA步驟并通過反轉錄擴增獲得cDNA，進行10倍系列稀釋，梯度稀釋至 107-1個酵母cDNA/ μ L的濃度，以此作為外標準品進行熒光定量PCR反應；標準曲線的繪制以不同濃度的模板的對數為橫坐標，以PCR反應過程中到達熒光閾值的初始循環數(Ct)為縱坐標得到的釀酒酵母菌的標準曲線，作為待測樣品定量測定的參照標準；Ε.結果及判斷以待測樣品cDNA和標準品的cDNA為模板，用釀酒酵母菌的種特異性引物，以相同的體系同時進行釀酒酵母菌26s rDNA D1/D2的基因片段的熒光定量PCR擴增；通過標準曲線和待測樣品的Ct值進行飼料樣品中釀酒酵母菌的快速定量檢測。有益效果本發明的有益效果是本發明所提供的引物具有特異性強，擴增效率高的特點，可用于快速定性鑒定釀酒酵母菌。本發明利用cDNA的梯度稀釋物作為外標準品可以用于區別死活菌，更準確的檢測待測樣品中的活菌數。本發明可以在不進行釀酒酵母菌純培養的基礎上，簡便、快速、準確地定性、定量檢測預混料樣品中的釀酒酵母菌，整個過程對預混料樣品中釀酒酵母的檢測程序簡單、檢測效率高、準確性好，檢測周期短的優點；從而為微生態制劑產業的長遠發展提供技術保障。


圖1 經釀酒酵母菌的種屬特異性引物PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測結果。圖2 以DNA為模板的實時熒光定量檢測釀酒酵母的標準曲線。圖3 以cDNA為模板的實時熒光定量檢測釀酒酵母菌的標準曲線。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發明作進一步說明。實施例1 預混料樣品中釀酒酵母的快速定性檢測該實施例使用目的擴增片段的膠回收產物作為陽性對照；無菌水作陰性對照 ’另外使用從市場收集的兩份飼料樣品1#和姊、糞腸球菌、畢赤酵母菌作為樣品進行。A.模板DNA的制備采用玻璃珠法制備飼料樣品模板DNA，具體步驟如下(1)取Ig含有釀酒酵母菌的飼料樣品于1. 5mL離心管中，加入500 μ LPBS懸浮樣品，2500 Xg 離心 3min ；(2)棄上清，加入適量酸洗過的玻璃珠，劇烈震蕩aiiin ；(3)加入400 μ L TE及等體積的Tris飽和酚，翻轉混勻，15000 Xg離心5min ；(4)轉移水相至一新離心管，加入等體積酚氯仿異戊醇05 24 1)，顛倒混勻，15000 Xg 離心 5min ；(5)吸上清至一新離心管，加入1/10體積3mol/L NaAc及2. 5倍體積95%冰乙醇，-20°C過夜；(6) 4"C 15000 X g 離心 IOmin,棄上清；(7)加入 1!1^70%乙醇，15000\8離心51^11，棄上清；(8)37°C放置15min干燥沉淀，沉淀溶于60 μ L TE中，_20°C保存備用。B. PCR 擴增反應體系25. 0μ L :12. 5μ L 2XPCR_mix、各 1 μ L 10mmol/L 上下游弓| 物、 1 μ L50ng/ μ L DNA模板、二次蒸餾水補足至25. 0 μ L ；PCR 反應條件94°C預變性 5min，94°C 30s,60°C 45s，72°C 40s，進行；35 個循環， 72°C最終延伸7min，得到的PCR產物，在溫度4°C下保存；取5 μ LPCR產物使用1 %瓊脂糖凝膠中以5V/cm的電壓電泳20-30min，EB染色， 紫外拍照。C.目的片段的膠回收純化采用膠回收試劑盒對目的片段進行切膠、回收、純化，獲得純化的目的片段。D.結果及判斷經釀酒酵母菌的種屬特異性引物PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測結果見圖1。泳道 1以目的片段的純化PCR產物作為陽性對照，泳道2以滅菌水作為陰性對照。一般認為陽性特征在134bp處出現預期擴增條帶，說明此樣本中含有釀酒酵母菌；陰性對照無特征條帶。 泳道3-4為從市場中收集到的飼料樣品，結果為陽性性說明這2份飼料樣品中含有活的釀酒酵母菌。泳道5-6為釀酒酵母菌外的畢赤酵母和糞腸球菌，結果為陰性，說明引物特異性好，與預期結果一致。實施例2 預混料樣品中釀酒酵母的定量測定對實施例1中提到的不同樣品進行釀酒酵母菌的定量測定。其測定步驟如下A.樣品總DNA的制備采用酶法破除酵母細胞壁高純總DNA快速提取試劑盒(離心柱型)提取樣品總DNA 樣品0. 5-1. Og加Λ到1. 5mL離心管中，加入600 μ L山梨醇Buffer,加入50U Lyticase,充分混勻30°C處理30min，1500Xg離心IOmin后，棄上清，收集沉淀，按高純總DNA快速提取試劑盒說明書提取樣品DNA，使用紫外分光光度儀測定濃度，采用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性，然后將樣本保存于-20°C。B.熒光定量PCR反應體系25. 0μ L :12· 5μ L 2XSuperReal PreMix(含 STOR Green I)、各 0.75 μ L ΙΟμ θΙ/L 上下游引物 DZf 和 DZr，2.0yL DNA 模板、0.5yL 50 X ROXReference Dye、補 RNase—free ddH20 M 25 μ L 體系。熒光定量PCR反應參數95°C預變性15min ；95°C變性10s，60°C退火32s，40個循環；在溫度4°C保存；每個樣品重復3次。D.外標準品的制備和標準曲線的繪制外標準品的制備利用分光光度計將過夜培養的釀酒酵母菌發酵液稀釋至 IOD (約IO7ceIls)，按照上述步驟提取總DNA，進行10倍系列稀釋，梯度稀釋至IO7-I個酵母DNA/ μ L的濃度，以此作為外標準品進行熒光定量PCR反應。以不同濃度的模板為橫坐標，以PCR反應過程中到達熒光閾值的初始循環數(Ct)為縱坐標得到的釀酒酵母菌的標準曲線，見附圖2。Ε.結果及判斷由圖2可見，Ct值和不同梯度稀釋的模板濃度呈較好的線性關系，以不同濃度的模板為橫坐標，Ct值為縱坐標，繪制出的熒光定量PCR標準曲線方程Υ =-1. 802Χ+26. 115 (Y代表Ct值，X代表模板初始DNA濃度)，模板初始DNA的濃度與Ct值之間線性相關系數為0. 994，斜率為-1. 802，所建立的標準曲線符合Real-Time PCR定量的要求。以待測樣品的DNA和標準品DNA為模板，用實施例1描述的釀酒酵母菌的種特異性引物，以相同的體系同時進行釀酒酵母菌26s rDNA D1/D2的基因片段熒光定量PCR擴增。通過標準曲線和采用ABI公司的7500實時熒光定量PCR儀的計算機軟件software v2. 0. 1進行飼料樣品中釀酒酵母菌的快速定量檢測。這些樣品的測定結果與分析誤差結果一并列于下表1中。表1樣品的Real-time測定結果
權利要求
1.一種添加劑預混料樣品中釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的快速定性測定方法，其特征在于使用釀酒酵母的DNA為模板，以釀酒酵母的^s rDNA基因序列的種屬特異性引物進行種屬特異性PCR反應，擴增片度長度為134bp，進而快速定性釀酒酵母； 所述的種屬特異性引物如下上游引物DZf5’ -CGAGAGACCGATAGCGAACA-3’，下游引物DZ r 5， -AAGGAGCAGAGGGCACAAA-3，。
2.如權1所述的快速定性測定方法，其特征在于該方法的步驟如下A.模板DNA的制備采用玻璃珠法制備飼料樣品模板DNA (1)取Ig含有釀酒酵母菌的預混料樣品于1.5mL離心管中，加入500 μ L磷酸鹽緩沖液懸浮樣品，2500 Xg離心3min ；(2)棄上清，加入適量酸洗過的玻璃珠，劇烈震蕩aiiin；(3)加入400μ L TE緩沖液及等體積的Tris飽和酚，翻轉混勻，15000 Xg離心5min ；(4)轉移水相至一新離心管，加入等體積酚氯仿異戊醇=25 24 1的混合物， 顛倒混勻，15000 Xg離心5min ；(5)吸上清至一新離心管，加入1/10體積3mol/L醋酸鈉及2.5倍體積95 %冰乙醇，_20°C過夜；(6)40C 15000 Xg 離心 lOmin，棄上清；(7)加入lmL70%乙醇，15000Xg離心5min，棄上清；(8)37°C放置15!1^11干燥沉淀，沉淀溶于6(^1^TE緩沖液中，_20°C保存備用；B.PCR擴增反應體系 25. 0μ L :12. 5μ L 2XPCR-mix,# 1 μ L 10mmol/L 上、下游引物、1 μ L 50ng/ μ L DNA模板、二次蒸餾水補足至25. 0 μ L ；PCR 反應條件941預變性51^11，941 30s, 60°C 45s, 72°C 40s，進行 35 個循環，72°C最終延伸7min，得到的PCR產物，在溫度4°C下保存；取5 μ LPCR產物，1 %瓊脂糖凝膠電泳進行檢測；C.結果及判斷檢測時設以目的擴增片度的膠回收產物作為模板為陽性對照，以滅菌水作為模板為陰性對照；根據在134bp處出現預期特征條帶，確定該預混料樣品中含有釀酒酵母，相反地則不含有釀酒酵母。
3.一種添加劑預混料樣品中釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的快速定量測定方法，其特征在于以待測樣品cDNA和標準品的cDNA為模板，使用權利要求1中所述的上游引物和下游引物，以相同的體系同時進行釀酒酵母26s rDNADl/D2的基因片段的熒光定量 PCR擴增；通過標準曲線和待測樣品的Ct值進行預混料樣品中釀酒酵母的快速定量檢測。
4.如權3所述的快速定量測定方法，其特征在于該方法的步驟如下A.樣品總RNA的制備采用酶法破除釀酒酵母細胞壁，高純總RNA，快速提取試劑盒提取樣品總RNA 樣品 0. 5-1. Og加入到1. 5mL離心管中，加入600 μ L山梨醇Buffer,加入50U溶壁酶，充分混勻 30°C處理30min，1500Xg離心IOmin后，棄上清，收集沉淀，提取樣品RNA，然后用DNase I 處理兩次，得到純化的RNA樣品，使用紫外分光光度儀測定濃度，采用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，然后將樣本保存于-80°C ；B.反轉錄擴增(1)在冰浴的無核酸酶的離心管中加入如下反應混合物1-5 μ g 總 RNA、2 μ L Oligo (dT) 15、2 μ LdNTP、補 RNase-free ddH20 定容至 14. 5 μ L ；(2)70°C加熱5min后迅速在冰上冷卻2min，快速離心反應液后加入以下組分4yL 5 X First-Strand Buffer (含有 DTT) ；0. 5 μ L RNasin ；(3)加入1μ LTIANScript M-MLV，輕輕用移液器混勻；(4)42°〇溫浴50111士11；(5)95°C加熱5min，終止反應，置冰上進行后續實驗或冷凍保存；(6)用RNase-freeddH20將反應體系稀釋到50 μ L。_20°C保存備用；C.熒光定量PCR反應體系 25. Ομ L :12. 5μ L 2 X SuperReal PreMix、各 0. 75 μ L lOymol/L 上下游引物 DZf 和 DZr，2.0yL cDNA 模板、0.5yL 50XROX Reference Dye、補 RNase-free ddH20 至25 μ L體系；熒光定量PCR反應參數95°C預變性15min ；95°C變性10s，60°C退火32s，40個循環； 4°C保存；每個樣品重復3次；D.外標準品的制備和標準曲線的繪制外標準品的制備利用分光光度計將過夜培養的釀酒酵母菌發酵液稀釋至10D，按照上述提取總RNA步驟并通過反轉錄擴增獲得cDNA，進行10倍系列稀釋，梯度稀釋至IO7-I 個酵母cDNA/ μ L的濃度，以此作為外標準品進行熒光定量PCR反應；標準曲線的繪制以不同濃度的模板的對數為橫坐標，以PCR反應過程中到達熒光閾值的初始循環數為縱坐標得到的釀酒酵母菌的標準曲線，作為待測樣品定量測定的參照標準；Ε.結果及判斷以待測樣品cDNA和標準品的cDNA為模板，用釀酒酵母菌的種特異性引物，以相同的體系同時進行釀酒酵母菌26s rDNA D1/D2的基因片段的熒光定量PCR擴增；通過標準曲線和待測樣品的Ct值進行飼料樣品中釀酒酵母菌的快速定量檢測。
全文摘要
本發明屬于飼料科學與飼料添加劑檢測技術領域，具體涉及一種添加劑預混料樣品中釀酒酵母的快速定性、定量測定方法。本發明利用cDNA的梯度稀釋物作為外標準品可以用于區別死活菌，更準確的檢測待測樣品中的活菌數。本發明可以在不進行釀酒酵母菌純培養的基礎上，簡便、快速、準確地定性、定量檢測預混料樣品中的釀酒酵母，整個過程對預混料樣品中釀酒酵母的檢測程序簡單、檢測效率高、準確性好，檢測周期短；從而為微生態制劑產業的長遠發展提供技術保障。
文檔編號C12Q1/04GK102296117SQ20111026198
公開日2011年12月28日 申請日期2011年9月6日 優先權日2011年9月6日
發明者劉瀅, 劉鵬, 周娜, 彭子欣, 王安如 申請人:北京大北農科技集團股份有限公司, 哈爾濱大北農牧業科技有限公司, 漳州大北農農牧科技有限公司