通過敲除口蹄疫病毒受體整合素β6亞基基因獲得抗口蹄疫轉基因牛的方法

專利名稱：：通過敲除口蹄疫病毒受體整合素β6亞基基因獲得抗口蹄疫轉基因牛的方法
技術領域：
：本發明涉及一種動物轉基因技術，尤其涉及一種通過敲除口蹄疫病毒受體整合素(Integrin)β6亞基基因獲得抗口蹄疫轉基因牛的方法，屬于細胞工程領域。
背景技術：
：ΠSit^(Foot-and-mouthdisease,FMD)(Foot-and-mouthdiseasevirus,FMDV)引起的牛、羊、豬等偶蹄類動物發生的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，世界動物衛生組織將其列為A類烈性傳染病之首，一旦暴發，必須撲殺感染及接觸感染的動物。2001年英國暴發口蹄疫損失約90億英鎊，占其國內生產總值的1.1%；2005年我國部分地區暴發AsiaI型FMD，2009年初多個省區又發生了A型FMD，不僅造成了巨大的直接經濟損失，而且嚴重危害畜牧業的健康發展以及相關產品的對外貿易，對國家的政治、經濟具有深遠的影響。目前，大多數流行FMD的國家以計劃免疫為主的措施預防FMD。盡管新型疫苗不斷涌現，但傳統滅活疫苗仍是預防FMD的基礎。FMDV變異快，血清型多，且不同血清型疫苗之間沒有交叉保護，故通過疫苗免疫的單一手段很難控制和根除FMD。因此，科學家們在注重疫苗研發的同時，開始關注病毒與宿主之間的關系，尤其是病毒受體在病毒感染過程中的作用，期望通過敲除、沉默或封閉病毒的關鍵受體阻斷病毒的感染，進而達到控制和根除FMD的目的。病毒受體是能夠被病毒識別并與之結合，進而導致病毒感染的宿主細胞表面分子，是病毒宿主特異性和組織嗜性的關鍵因素。FMDV體外感染的受體包括整合素(Integrin)及硫酸乙酰肝素(HSPGs)。一些FMDV弱毒及細胞培養適應毒株可利用HSPGs感染體外培養的細胞(O'Dormell等，2008)，但HSPGs可能只作為一種附屬分子增強其它受體的效率，尚無證據表明其在FMDV野毒株感染細胞過程中起作用(Monaghan等，2005)。整合素αν亞家族成員中ανβ1、ανβ3、ανβ6及ανβ8是FMDV感染體外細■白勺(Gutierrez-Rivas^,2008；Berryman^,2005Jacksonφ,2000；Goodwin等，2009；Ruiz-Saenz等，2009Johns等，2009)，其中整合素受體β6亞基是啟動FMDV強毒自然感染的關鍵性β受體亞基，原因在于(I)FMDV主要經上呼吸道感染動物，在口咽或相關淋巴組織的上皮細胞起始復制后迅速擴散到口部和蹄部的上皮細胞。在4種整合素受體中，只有ανβ6僅限于FMDV組織嗜性的上皮細胞表面持續且高水平的表達(Berryman等，2005；Monaghan等，2005；Brown等，2006)，感染病毒的上皮細胞可同時檢測出ανβ6和病毒抗原(0'Dormell等，2009)。(2)體外合成的ανβ6可與所有血清型的FMDV結合(Ferris等，2005)，并且親和力最強(Burman等，2006)，這不僅提高了FMDV的感染率(DiCara等，2008；Duque等，2004)，而且也使β6亞基成為FMDV整合素受體中利用率最高的β亞基(Duque等，2003)。(3)不僅FMDV非敏感細胞轉染β6亞基基因后可被病毒感染(Jackson等，2000)，而且抗β6抗體可抑制受體與病毒間的結合并阻斷病毒感染(Νεζ等，2007Jackson等，2000)。轉基因動物的制作方法主要有逆轉錄病毒法、受精卵原核顯微注射法、精子載體法、ES細胞技術和轉基因體細胞核移植技術等。其中受精卵原核顯微注射法和轉基因體細胞克隆是目前世界各國科學家比較常用的家畜轉基因技術，前者最早由美國人Gordon發明，是經典的制作轉基因動物的方法。Hammer等利用該方法成功地制作了轉基因兔、綿羊和豬，這些研究被認為是動物轉基因研究歷程上的里程碑。總體上看顯微注射法生產轉基因動物的效率較低，后代嵌合體比例較高，尤其是大動物，受體需要量大，維持大量動物的飼養成本與試驗成本昂貴，研發成本高，風險大。轉基因體細胞克隆技術是基因組修飾技術與動物體細胞核移植技術有機結合而產生的一種新的轉基因動物制作技術，它部分地克服了傳統轉基因動物外源基因整合率低、大動物生產成本高的技術瓶頸，代表當前轉基因動物制作的主流方向。在該方法中，核供體細胞在核移植前要經過轉染、篩選和鑒定等環節，提高了轉基因動物的陽性率。Schnieke等(1997)用新霉素抗性基因neo和用于治療血友病的人凝血因子IX共轉染綿羊胎兒成纖維細胞，以隨機整合的轉基因細胞為核供體生產出轉基因綿羊，凝血因子IX在乳中的表達量達到125μg/mL，這一研究成果為利用克隆技術迅速擴大轉基因動物開辟了一條新的途徑。隨后，轉基因克隆牛、山羊、豬等相繼誕生。外源基因隨機整合的缺點主要是容易引起被插入基因的突變、易受到插入位點臨近基因的影響而表達水平不穩定、胎胚發育及出生后生長不正常等，為克服上述部分缺點，基因打革巴(genetargeting)技術應運而生。基因打靶是在胚胎干細胞和同源重組技術基礎上產生的，是改變生物體遺傳信息的轉基因技術，包括通過同源重組將外源基因/修飾的自身基因定點整合到受體細胞基因組(knockin)及將宿主細胞特定基因區段敲除(knockout)。該技術在小鼠轉基因中被廣泛應用，但是，由于大動物沒有公認的家畜ES干細胞系而無法在ES干細胞水平上進行基因打靶，1997年多莉羊的誕生為體細胞基因打靶制備轉基因動物開辟了新的途徑。用體細胞介導的基因打靶技術制備轉基因動物突出的優點是(1)可以避開復雜的ES細胞技術；(2)可以不經過嵌合體中間步驟；(3)可以控制轉基因動物性別；(4)能夠在體細胞體外培養水平進行整合篩選和基因打靶，因而可以顯著降低制備轉基因動物，特別是轉基因家畜的成本，在生物
技術領域：
具廣闊前景。盡管體細胞體外培養傳代的有限性是體細胞基因打靶研究的難點并且成功率低，但是近年來體細胞基因打靶研究也獲得了一些突破性進展。2000年，McCreath等首次將α-抗胰蛋白酶(AAT)基因定位整合到綿羊胎兒成纖維細胞的al原膠原基因座上，獲得了AAT較高表達水平的轉基因克隆綿羊。隨后，國內外科學家相繼利用體細胞克隆和基因打靶手段研制出不同的轉基因動物。Yu等(2006)報道利用基因打靶技術獲得敲除了朊病毒一個PrP基因位點的體細胞克隆山羊，經過3個月觀察這些基因敲除羊沒有異常表現。Richt等(2007)利用基因打靶技術滅活牛的PRNP基因，獲得生長發育正常、存活2年以上的轉基因牛，它們能夠很好地抵抗瘋牛病的傳染。參考文獻1.BerrymanS,ClarkS,MonaghanP,JacksonΤ.EarlyEventsinIntegrinαVβ6-MediatedCellEntryofFoot-and—MouthDiseaseVirus,JVirol.,2005,79(13)8519-34.2.BurmanA，ClarkS，AbresciaNGiFryEE,StuartDI,JacksonΤ.SpecificityoftheVPlGHloopofFoot—and—MouthDiseasevirusforalphavintegrins，JVirol.，2006，80(19):9798_810.3.BrownJK,McAleeseSM,ThorntonEM,PateJA,SchockA，MacraeAl，ScottPR，MillerHR,CollieDD.(2006).Integrin_alphavbeta6，aputativereceptorforfoot-and-mouthdiseasevirus,isconstitutivelyexpressedinruminantairways,JHistochemCytochem.，54(7):807_16·4.DicaraD,BurmanA,ClarkS,BerrymanS,HowardMJ,HartIR,MarshallJF,JacksonT..Foot-and-mouthdiseasevirusformsahighlystable，EDTA—resistantcomplexwithitsprincipalreceptor，integrinalphavbeta6!implicationsforinfectiousness，JVirol.，2008，82(3)1537-46.5.DuqueHandBaxtB.Foot-and-mouthdiseasevirusreceptors-comparisonofbovinealpha(V)integrinutilizationbytypeAand0viruses,JVirol.，2003，77(4):2500-ll.6.DuqueH，LaRoccoM，GoldeWT,BaxtB.Interactionsoffoot-and-mouthdiseaseviruswithsolublebovinealphaVbeta3andalphaVbeta6integrins,JVirol.，2004，78(18):9773_81·7.FerrisNP,AbresciaNG,StuartDI,JacksonT，BurmanA，KingDP，PatonDJ.Utilityofrecombinantintegrinalphaνbeta6asacapturereagentinimmunoassaysforthediagnosisoffoot-and-mouthdisease，JVirolMethods.，2005，127(1):69-79.8.GoodwinS，TuthillTJ，AriasA，KillingtonRA，andRowlandsDJ.Foot-and-mouthdiseasevirusassembly!processingofrecombinantcapsidprecursorbyexogenousproteaseinducesself-assemblyofpentamersinvitroinamyristoyIation-dependentmanner.JVirol.，2009，83(21):11275_82.9.Gutierrez-RivasMiPulidoMR，BaranowskiE,SobrinoF,SaizM.Tolerancetomutatiohsinthefoot-and-mouthdiseasevirusintegrin-bindingRGDregionisdifferentinculturedcellsandinvivoanddependsonthecapsidsequencecontext,JGenVirol.，2008，89(10):2531_9·10.JacksonT，SheppardD，DenyerM，BlakemoreW,KingAM.Theepithelialintegrinalphavbeta6isareceptorforfoot-and-mouthdiseasevirus,JVirol.，2000,74(11)4949-56.11.JohnsHL,BerrymanS，MonaghanP，BelshamGJ,JacksonT.Adominant-negativemutantofrab5inhibitsinfectionofcellsbyfoot-and-mouthdiseasevirusamplicationsforvirusentry,JVirol·，2009，83(12):6247_56·12.MonaghanP，GoldS,SimpsonJ,ZhangZ,WeinrebPH,VioletteSM,AlexandersenS，JacksonTTheaVβ6integrinreceptorforFoot-and-mouthdiseasevirusisexpressedconstitutivelyontheepithelialcellstargetedincattle，JGenVirol.,2005,86(Pt10):2769_80.13.NiifiezJI,MolinaN,BaranowskiΕ,DomingoΕ,ClarkS,BurmanA,BerrymanS,JacksonΤ,SobrinoF.Guineapig-adaptedfoot-and-mouthdiseaseviruswithalteredreceptorrecognitioncanproductivelyinfectanaturalhost,JVirol.,2007,81(16):8497-506.14.0'Donne11V,LaroccoM,BaxtB.Heparansulfate-bindingfoot-and-mouthdiseasevirusenterscellsviacaveola-mediatedendocytosis,JVirol.,2008,82(18):9075_85.15.0'DonnellV,PachecoJM,GreggD,BaxtB.Analysisoffoot-and-mouthdiseasevirusintegrinreceptorexpressionintissuesfromnaiveandinfectedcattle,JCompPathol.，2009，141(2-3):98_112.16.RichtJA,KasinathanP,HamirAN,CastillaJ,SathiyaseelanT,VargasF,SathiyaseelanJ,WuH,MatsushitaH,KosterJ,KatoS,IshidaI,SotoC,RoblJM,KuroiwaY.Productionofcattlelackingprionprotein,NatBiotechnol,2007,25(1):132-138.17.Ruiz-SaenzJ,GoezY,TabaresW,Lopez-HerreraA.Cellularreceptorsforfootandmouthdiseasevirus,Intervirology,2009,52(4)-.201-12.18.SchniekeAE,KindAJ,RitchieWA,MycockK,ScottAR,RitchieM,WilmutI,ColmanA,CampbellKH(1997).HumanfactorIXtransgenicsheepproducedbytransferofnucleifromtransfectedfetalfibroblasts,Science,278(5346)2130-2133.19.YuGH,ChenJQ,YuHQ,LiuSG,ChenJ,XuXJ,ShaHY,ZhangXF,WuGX,XuSFandChengGX(2006).Functionaldisruptionoftheprionproteingeneinclonedgoats(J).JournalofGeneralVirology,87:10191027.
發明內容針對上述現有技術，本發明的發明人進行了研究，研究表明，整合素β6亞基基因被替換或敲除的雜合子或純合子轉基因牛低表達或不表達口蹄疫病毒受體β6亞基，使FMDV感染率明顯下降，具備了抗FMD的能力。因此，通過敲除整聯蛋白β6亞基的方法是獲得抗FMD的轉基因牛的最佳方法之一。本發明的目的是提供一種通過敲除口蹄疫病毒受體整合素β6亞基基因獲得抗口蹄疫轉基因牛的方法。通過本發明的方法獲得的轉基因牛低表達(雜合子)或不表達(純合子)口蹄疫病毒受體整合素β6亞基，其FMDV感染率明顯下降。本發明是通過以下技術方案實現的一種通過敲除口蹄疫病毒受體整合素β6亞基基因獲得抗口蹄疫轉基因牛的方法，是將堿基序列如序列表中序列1所示的線性化的攜帶有報告基因的突變的整合素β6亞基基因的打靶載體轉染正常牛的牛胎兒成纖維細胞，通過同源重組獲得替換整合素β6亞基基因的核供體細胞，將核供體細胞核導入牛的去核卵母細胞中得到重構胚，再將重構胚移入代孕牛子宮中，得到的子代即為整合素β6亞基基因被敲除的雜合子轉基因牛。還包括以下方法雜合子轉基因牛經二次打靶和體細胞克隆獲得純合子轉基因牛；或雜合子轉基因公牛和雜合子轉基因母牛正常交配繁殖而獲得純合子轉基因牛。所述牛為奶牛或肉牛。所述牛胎兒成纖維細胞為45150日齡胎兒不同組織來源的胎兒成纖維細胞，包括耳成纖維細胞、皮膚成纖維細胞、輸卵管上皮細胞或卵丘細胞，優選皮膚成纖維細胞。所述將線性化的攜帶有報告基因的突變的整合素β6亞基基因的打靶載體轉染牛胎兒成纖維細胞方法為電轉染法、脂質體轉染法、病毒載體法或磷酸鈣沉淀法，優選脂質體轉染法。所述脂質體轉染法的條件為線性化的載體DNA濃度不低于lyg/yL，DNA脂質體LTX=1:3。所述將線性化的攜帶有報告基因的突變的整合素β6亞基基因的核供體細胞核導入牛的去核卵母細胞的方法為顯微注射法。所述去核卵母細胞不帶有第一極體。本發明利用同源重組和體細胞克隆的方法將線性化的攜帶有突變的整合素β6亞基基因的第一次打靶載體轉染牛胎兒成纖維細胞，獲得整合素β6亞基基因敲除的核供體細胞，將其細胞核導入牛的去核卵母細胞中得到重構胚，再將重構胚移入代孕牛子宮中，得到的子代即為整合素β6亞基基因敲除的雜合子轉基因牛。雜合子轉基因牛經二次打靶和體細胞克隆獲得純合子轉基因牛。用本方法獲得的轉基因牛低表達(雜合子)或不表達(純合子)口蹄疫病毒受體整合素β6亞基基因，使FMDV感染率明顯下降，具備了抗FMD的能力。本發明打破了傳統的通過免疫學手段預防FMD的思維模式，為控制和消滅牛FMD開辟了新的途徑，具有較高的實用價值和廣闊的市場前景。圖1為體細胞克隆整合素β6亞基基因被敲除的轉基因牛的生產流程圖。圖2為整合素β6亞基基因打靶載體的構建示意圖。圖3為整合素β6亞基基因左側同源臂重組克隆質粒酶切鑒定結果，其中，Μ:DLmarkerlO,000；1:NotI/SalI酶切pMD19-Left載體；2:NotI/SalI酶切pMD19對照。圖4為整合素β6亞基基因右側同源臂重組克隆質粒酶切鑒定結果，其中，Μ:DLmarkerlO,000；1:pMD19_T空載體；2:XhoI/EcoRI酶切pMD19_Right載體。圖5為整合素β6亞基基因第一次打靶載體的質粒酶切鑒定結果，其中，M:DLmarkerlO,OOO；1:XhoI/EcoRI酶切pRui-β61001;2:NotI/Sall酶切pRui-β61001。圖6為打靶載體與牛細胞整合素β6亞基基因發生同源重組后β6基因敲除結構示意，pRui-β61001第一次打靶后，Integinbeta6基因的第三外顯子至第十二外顯子被PGK-neo基因所替換；pRui-GFP-β6第二次打靶后，另一條染色體上的Integinbeta6基因的第三外顯子至第十二外顯子被PGK-neo基因所替換。圖7為用于β6基因發生第一次同源重組PCR鑒定方法中陽性模板質粒的酶切鑒定結果，其中，M:DLmarker10,000；1.NotI和Sail酶切鑒定pRui-ko-model；2:I.NotI和SalI酶切pRui對照。圖8為轉基因奶牛雜合子胎兒成纖維細胞PCR鑒定結果，pRui-β61001打靶奶牛成纖維細胞后形成的單克隆，在跨Left小臂的引物P1，P2的引導下，PCR擴增3236bp的片段。圖9為β6基因敲除雜合子奶牛胎兒的Southern雜交鑒定結果，其中，1.普通荷斯坦奶牛胎兒，2、3為轉基因奶牛胎兒。圖10為轉基因雜合子奶牛β6基因mRNA的Real-timeRT-PCR檢測結果，正常及轉基因荷斯坦奶牛各6頭，以正常荷斯坦奶牛β6基因mRNA表達量的平均值為標準，計算轉基因牛mRNA的相對表達量。其中，1.正常荷斯坦奶牛，2為轉基因奶牛。圖11為接種病毒后奶牛出現臨床體癥時間的比較結果，接種病毒的正常奶牛組奶牛全部發病(3/3)，發病率100%，而接種病毒的轉基因奶牛組中抗病毒感染的奶牛(抗FMD奶牛)1頭，發病奶牛2頭(2/3)，發病率66.7%；接種病毒后，與正常奶牛比較，發病的轉基因奶牛出現臨床體癥時間明顯的滯后。其中，1.正常荷斯坦奶牛，2為轉基因奶牛。圖12為整合素β6亞基基因第二次打靶載體的質粒酶切鑒定結果，其中，M:DLmarker10，000；1:ClaI酶切pRui—GFP—β6；2:ClaΙ/ΚρηI酶切pRui—GFP—β6。圖13為用于β6基因發生第二次同源重組PCR鑒定方法中陽性模板質粒pRui-ko-model-2的酶切鑒定結果，其中，M:DLmarker15,000；1=NotI酶切pRui-ko-model-2；2:NotI/SalIpRui_ko_model_2。圖14為β6基因敲除雜合子黃牛胎兒的Southern雜交鑒定結果，其中，1.魯西黃牛胎兒，2、3為轉基因黃牛胎兒。具體實施例方式下面結合實施例及附圖對本發明作進一步的說明。下述實施例中無特別說明均為常規方法，所用試劑及藥品如無特別說明均購自Sigma公司。實施例1體細胞克隆整合素β6亞基基因敲除的雜合子轉基因奶牛的生產及分子生物學檢測體細胞克隆整合素β6亞基基因敲除的雜合子轉基因奶牛的生產流程如圖1所示，具體過程包括如下步驟1.整合素β6亞基基因敲除的第一次打靶載體的構建整合素β6亞基基因敲除第一次打靶載體的構建如圖2所示，具體方法如下以荷斯坦奶牛胎兒成纖維細胞的基因組DNA為模板，在引物pLeftupper5，-ATAAGAATGCGGCCGCGCGAGAACTGAAACGGATG-3’(帶下劃線的堿基為限制性內切酶NotI的識別位點)禾口弓丨物pLeftlower5，-ACGCGTCGACGGGCACTTTGTTAGACTGA-3，(帶下劃線的堿基為限制性內切酶SalI的識別位點)引導下，PCR克隆片段為2021bp片段，反應條件為94°C30s-MV20s55°C20s68°C2min,25個循環；68°C5min。反應結束后對PCR產物進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收2021bp片段，TA克隆至pMD19-T(Takara公司)載體上，轉化至E.coliDH5α感受態細胞，經藍白斑篩選后搖菌，提取質粒。酶切鑒定出含有Left片段的菌落命名為pMD19-Left(圖3)，將pMD19_Left用NotI和SalI酶切后回收Left片段與經相同酶切的載體PRui連接，然后將連接產物轉化E.coliDH5α，挑取單菌落搖菌、提質粒，并進行酶切和測序鑒定，得到含有目的片段的重組載體，命名為PRui-β6-Left,該載體含有Integinbeta6基因啟動子區和第一、第二外顯子區與第一、第二內含子區。以荷斯坦奶牛胎兒成纖維細胞的基因組DNA為模板，在引物pRightupper5，-CCGCTCGAGGGCCAGCGATCTGACGAGGAC-3，(帶下劃線的堿基為限制性內切酶xhoI的識別位點)禾口弓I物pRightlower5，-CCGGAATTCATGGCCGCTTCTAATAGGT-3‘(帶下劃線的堿基為限制性內切酶EcoRI的識別位點)引導下，PCR克隆片段為4323bp片段，反應條件為94°C30s；94°C20s55°C20s68°C3min,25個循環；68°C7min。反應結束后對PCR產物進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收4323bp片段，TA克隆至pMD19-T(Takara公司)載體上，轉化至E.coliDH5α感受態細胞，經藍白斑篩選后搖菌，提取質粒，酶切鑒定出含有Right片段的菌落命名為pMD19-Right(圖4)，將pMD19-Right用XhoI和EcoRI酶切后回收Right片段與經相同酶切的載體PRUI-β6-Left連接，然后將連接產物轉化E.coliDH5α，挑取單菌落搖菌、提質粒，并進行酶切和測序鑒定，得到含有目的片段的重組載體，命名為pRui-β61001，pRui-β61001的Right片段含有部分第十二內含子、第十三外顯子和部分第十三內含子。通過XhoI和EcoRI、NotI和SalI分別雙酶切pRui-061OOl，檢測結果顯示Left同源臂與Right同源臂片段均已插入pRui-β61001中(圖5)。pRui_i361001經序列分析表明，載體上的Integinbeta6開放閱讀框獲得了插入突變(序列1)。將載體pRui-β61001經過限制性內切酶NotI線性化，用TaKaRaDNAFragmentPurificationKitVer.2.O(TaKaRa公司)回收濃縮純化13700bp的線性片段，將其溶解在滅菌的超純水中，_20°C保存。該片段自5，端第7-2001位DNA序列為Integinbeta6基因啟動子區和第一、第二外顯子區與第一、第二內含子區’第2002-2035位DNA序列為Loxp位點；第2036-3855位DNA序列為PGK-Neo序列；第3856-3889位DNA序列為Loxp位點；第3896-8200位DNA序列為Integinbeta6基因部分第十二內含子、第十三外顯子和部分第十三內含子；第8201-10526位DNA序列為PGK-TK序列，見序列表1。pRui-β61001打靶后，Integinbeta6基因的第三外顯子至第十二外顯子將被PGK-neo基因所替換，如圖6所示。2.牛胎兒皮膚成纖維細胞系的建立選用2月齡的荷斯坦奶牛胎兒(購自山東奧克斯生物技術有限公司)，用70%酒精清洗包被奶牛胎兒的羊膜數次后，刺穿羊膜，取出奶牛胚胎，于PBS液中洗數遍，取胎兒皮膚組織，剪碎成小塊(體積小于Imm3)，再用PBS洗2遍后，加入IOmL的膠原酶和胰蛋白酶混合液37°C消化20-40min后，加入20mL含10%胎牛血清的DMEMF12營養液分散，IOOOrpmIOmin,再加入10%胎牛血清的DMEM:F12營養液重新懸浮，細胞計數，按3.OXIO5的細胞量接種于IOOmm的培養皿中，37°C、5%CO2的培養箱中培養2_3d，待細胞生長至單層后，用0.25%胰蛋白酶消化傳代1次，液氮保存(凍存液成分為80%DMEM:F12，10%FBS和10%DMS0)，獲得牛胎兒皮膚成纖維細胞系。3.牛胎兒皮膚成纖維細胞的脂質體轉染和篩選處于對數生長期的牛胎兒皮膚成纖維細胞，用Opti-MEM洗1次細胞，將載體DNA線性化后，濃縮濃度不低于1μg/μL，經脂質體LTX轉染細胞(DNA脂質體LTX=1:3)，24h后加入700μg/mLG418和8μΜGancvilor作為篩選壓力進行篩選，每3d換液1次，IOd后用0.25%胰蛋白酶消化形成的克隆細胞，培養2-3代，期間取部分細胞進行鑒定，其余細胞液氮保存、備用。4.卵母細胞的成熟培養將取自周邊地區屠宰場的成年奶牛和黃牛的卵巢，用37°C的PBS液清洗3遍后，用直徑為0.7mm的針頭抽取直徑為2-8mm的卵泡，回收形態均勻、結構致密的卵丘_卵母細胞-復合體，將其用成熟液(M199培養液中添加10%FBS,0.01U/mLbFSH，0.01U/mLbLH和1μg/mL雌二醇)洗滌兩遍，然后將卵丘-卵母細胞-復合體按50-60枚/孔放入含成熟液的四孔板，置于38.55%CO2的培養箱中培養約20h，將成熟的卵母細胞放入含0.透明質酸酶的管內振蕩2-3min后，用玻璃管輕輕吹打，使卵丘細胞和卵母細胞完全脫離，選擇形態完整，細胞質均勻，并排出第一極體的卵母細胞為胞質受體。5.核移植和克隆胚胎的體外培養將步驟3獲得的第一極體的卵母細胞移入操作液(M199培養液中添加10%FBS,7.5μg/mL細胞松弛素B)中，在200倍顯微鏡下用玻璃針于極體上方的透明帶切一小口，再用內徑20μm的玻璃管將第一極體及其下方的卵母細胞的染色體一并吸除，再用含20%的FBS的M199液體培養基洗3遍，置于38.5°C,5%CO2的培養箱中備用。將步驟2獲得的轉基因細胞活化至長滿單層，用0.25%胰蛋白酶消化，懸浮細胞，離心，再加微量的營養液懸浮，用玻璃針選擇直徑為10-12μm的胎兒皮膚成纖維細胞的細胞核，用20μm的玻璃管將其移入去核的卵母細胞的透明帶內，然后將其放入0.3M甘露醇、0.15mmol/LCa2+和0.15mmol/LMg2+的溶液中，3-5min后放入融合槽內，轉動卵母細胞使供體細胞核與卵母細胞接觸面與電場垂直，同時在直流脈沖的場強為2.5KV/cm、脈沖時間為10μs、脈沖次數為2次、脈沖間隔Is的條件下融合(融合儀為BTX公司的ECM-2001)后，迅速將重構胚移入添加10%FBS的M199培養液中，放置0.5h后觀察融合率，挑選融合胚進行下一步的激活處理，將重構胚放入5μmol/L離子霉素液中，4min后移至1.9mmol/L的6-DMAP液中，4h后再移入含5%FBS的CRIaa液中，在38.5°C,5%CO2的培養箱中培養，分別在2d和7d后觀察胚胎的發育狀況。6.胚胎移植與妊娠檢測將形態優良的第7d的克隆囊胚移入已同期的受體牛的子宮角內。在移植后的第30d對受體母牛進行B超檢測以確定受胎情況，并在移植后的第60d和90d進行直腸檢測以確定妊娠率。共移植受體牛48頭，移植60d后的直腸檢測表明，其中22頭懷孕。手術取2個胎兒進行鑒定，均為轉基因陽性，制備成纖維細胞，一部分用于體細胞克隆制備雜合子轉基因牛，一部分用于二次打靶和體細胞克隆制備純合子轉基因牛。7.轉基因雜合子陽性細胞、胎兒及克隆牛的分子生物學鑒定(I)PCR鑒定1)用于PCR鑒定的β6基因發生第一次同源重組的陽性模板質粒的構建克隆Integinbeta6基因Left片段5，上游-1817至+2231[NC_007300.4(37，386,594..37，390，642)]片段，以荷斯坦奶牛胎兒成纖維細胞的基因組DNA為模板，在引物pLeftupper-18175，-ATAAGAATGCGGCCGCGATCAGAGAGGCTGCGACTG-3，(帶下劃線的堿基為限制性內切酶NotI的識別位點)與引物pLeftlower5，ACGCGTCGACGGGCACTTTGTTAGACTGA-3，的引導下，PCR克隆片段為4049bp片段，反應條件為94V30s；94V20s55°C20s68°C3min，25個循環；68°C7min。反應結束后對PCR產物進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收目的片段。將該片段用NotI和SalI酶切后回收與經相同酶切的載體pRui連接，然后將連接產物轉化E.coliDH5α，挑取單菌落搖菌、提質粒，并進行酶切和測序鑒定，得到含有目的片段的重組載體，命名為pRui-ko-model(圖7)，該質粒包含第一次打靶質粒pRui-β61001的左側同源臂和報告基因neo，在pRui-ko-model:base1443-1455位點設計上游引物Pl:5，-TTCCCTAGCCTGCCTTCTATTAT-3，，在PGK-neo開放閱讀框，pRui-ko-modelbase4668-4647上設計下游引物P25，-CTTCCTCGTGCTTTACGGTATC-3，，PCR擴增產物為3236bp，可做pRui-β61001打靶后發生同源重組的細胞/胎兒/轉基因牛跨越式PCR鑒定的模板。2)發生同源重組的跨越式PCR鑒定以經pRui-β61001打靶獲得的牛胎兒成纖維neo抗性克隆、轉基因克隆胎兒或轉基因牛的基因組DNA為模板，在用于PCR鑒定的β6基因發生同源重組的陽性模板質粒的構建中的引物Pl，Ρ2的引導下，PCR擴增3236bp的片段為同源重組陽性。PCR反應條件940C30s；94°C20s55°C20s68°C3min，35個循環；68°C7min。轉基因牛胎兒成纖維細胞鑒定結果如圖8所示，M:DLmarker10，000(Takara公司)，第1泳道為發生同源重組的陽性模板質粒pRui-ko-model，第24泳道為以非轉基因奶牛成纖維細胞DNA為模板的陰性對照，第2-23泳道為單克隆細胞基因組DNA，其中第5、14、16和23泳道為同源重組陽性轉基因細胞，將其依次命名為Tβ50L、Tβ65L、Tβ67L禾口Tβ82L，其余均為陰性。(2)Southern雜交鑒定取約IOyg轉基因克隆牛胎兒或新生犢牛耳部組織的基因組DNA，用限制性內切酶Eco065I酶切消化，30V低壓電泳，轉膜后，進行Southern雜交。雜交所用探針為利用rediprimerIIrandomprimerlabelingsystem(amersham)、由[α-32P]dCTP同位素標記的、經限制性內切酶Sail和XhoI酶切消化的pRUI載體neo基因(報告基因)回收產物，以普通荷斯坦奶牛胎兒或新生犢牛的基因組DNA作為陰性對照，雜交陽性信號為6.5kb片段，結果如圖9所示(泳道1為普通荷斯坦奶牛，泳道2、3為轉基因奶牛胎兒，轉基因結果為陽性)。上述結果表明，在整合素β6亞基基因座位上發生了預期的同源重組。(3)Real-timeRT-PCR鑒定利用Trizol(Invitrogen)提取正常和轉基因牛胎兒或新生犢牛的甲狀腺或舌上皮組織總RNA，按TaKaRAaRNAPCRKit(AMV)Verf.0反轉錄試劑盒說明書操作步驟反轉錄，得到cDNA模板。反轉錄體系為:MgC122.0μ1,10XRTBuffer1.0μl,dNTPMixture1.0μ1,RNAseInhibitor0.25μ1,RNAseFreedH203.75μ1,AMVReverseTranscriptase0.5μ1，提取RNA1.Ομ1，01igo(dT)0.5μ1，總體系10.Ομ1。在上游弓|物Ρ55‘-GTTGGGGGTTTCGCTGGCTATTC-3‘和下游引物Ρ65‘-CAGTGGATTGGTTCCCGTTTG-3‘的引導下，RealTimePCR擴增β6片段為148bp；在上游引物P35'-GCACAATGAAGATCAAGATCATC-3‘和下游引物P4:5'-CTAACAGTCCGCCTAGAAGCA-3‘的引導下，RealTimePCR擴增β-actin片段173bp。RealTimePCR反應條件是95°C30s；95°C5S，60°C31S，40個循環。根據其擴增曲線和融解曲線，制作PCR定量標準曲線，通過求其平均值可以分析出轉基因胎兒或新生犢牛β6基因表達的變化，圖10顯示了6頭轉基因牛的β6基因mRNA的表達量明顯下降。8.轉基因牛的FMDV攻毒實驗(1)牛半數感染量(ID5tl)的測定選取未接種FMD疫苗、無FMDV中和抗體、6月齡荷斯坦奶牛12頭，分成4組，每組3頭，分別在舌上表面皮內接種兩個點(每點接種0.ImL)，病毒接種劑量分別為0、IO5UO6和IO7TCID5tl，觀察8天，未接種病毒的對照組不發病，接種病毒的實驗組病牛表現為蹄、口腔及其周圍和母畜的乳頭等部位出現水泡。統計發病牛的數量，按照Reed-Muench方法計算ID5tl，該組織培養毒的ID5tl為4X106。(2)轉基因牛的FMDV攻毒實驗選取未接種FMD疫苗、無FMDV中和抗體、6月齡左右正常及轉基因荷斯坦奶牛各6頭，分為4組，每組3頭。正常及轉基因牛中，各有一組不接種病毒，另一組分別在舌上表面皮內接種兩個點(每點接種0.ImL)，病毒接種劑量為IOOID5tl，觀察8天。未接種病毒的對照組不發病，接種病毒的正常奶牛組奶牛全部發病(3/3)，發病率100%，而接種病毒的轉基因奶牛組中抗病毒感染的奶牛(抗FMD奶牛)1頭，發病奶牛2頭(2/3)，發病率66.7%；接種病毒后，與正常奶牛比較，發病的轉基因奶牛出現臨床體癥時間明顯的滯后，見圖11。實施例2體細胞克隆整合素β6亞基基因敲除的純合子轉基因奶牛的生產及分子生物學檢測體細胞克隆整合素β6亞基基因敲除的純合子轉基因奶牛的生產流程如圖1所示，具體過程包括如下步驟1.整合素β6亞基基因敲除的二次打靶載體的構建在整合素β6亞基基因敲除第一次打靶載體的基礎上用報告基因GFP替換neo，獲得第二次打靶載體。具體方法如下以pRui為模板，在引物pGKlupper5，-CggggTACCctcgagataacttcgtatagcatac-S，(帶下劃線的堿基為限制性內切酶Kpnl的識別位點)與引物pGKllower5，-TGAACAGCTCCTCGCCCTTGCTCACCATATTGGCTGCAGGTCGAAAG-3，(帶下劃線的堿基為GFP基因5’序列)的引導下，PCR克隆片段為556bp的pGK啟動子片段；以pEGFP_Nl為模板，在引物pGFPupper5，-CCGGGCCTTTCGACCTGCAGCCAATATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGT-3，(帶下劃線的堿基為PGK啟動子3’序列)與引物pGFPlower5，TTCTGCAGACTTACAGCGGATCCCCTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3，(帶下劃線的堿基為pGK終止子5’序列)，PCR克隆片段為700bp的GPF基因片段；以pRui為模板，在引物pGK2upper5，-CGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAAGGGGATCCGCTGTAAGTCTGCAG-3，與引物pGK2lower5，-CCCATCGATCTCGACGGTATCGAGCTTCTGATGG-3，(帶下劃線的堿基為限制性內切酶ClaI的識別位點)PCR克隆片段為513bp的pGK終止子片段。將純化的556bpPCR產物與700bpPCR產物混合作為兩步法PCR反應的拼接模板，在引物pGKlupper與引物pGFPlower的引導下，獲得1231bp的PCR產物。反應條件為94°C30s；94°C20s56°C20s68°Clmin，25個循環；68°C5min。反應結束后對PCR產物進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收1231bp片段；以純化的1231bpPCR產物與513bpPCR產物混合作為兩步法PCR反應的拼接模板，在引物pGKlupper與引物pGK21ower的引導下，PCR克隆1736bp片段，將該片段用KpnI和ClaI酶切后回收該片段與經相同酶切的載體pRui_i361001回收11946bp片段連接，然后將連接產物轉化E.ColiDH5a，挑取單菌落搖菌、提質粒，并進行酶切(圖12)和測序鑒定，得到含有目的片段的重組載體，命名為pRui-GFP-β6(序列2)。2.雜合子轉基因奶牛胎兒皮膚成纖維細胞系的建立選取2月齡的實施例1中獲得的雜合子轉基因胎兒，其胎兒皮膚成纖維細胞系的制備方法與實施例1奶牛胎兒皮膚成纖維細胞系的制備方法相同。3.雜合子轉基因奶牛胎兒皮膚成纖維細胞的脂質體轉染和篩選處于對數生長期的雜合子轉基因牛胎兒皮膚成纖維細胞，用Opti-MEM洗1次細胞，將二次打靶載體pRui-GFP-β6DNA線性化后，濃縮濃度不低于1μg/μL，經脂質體LTX轉染大量細胞，24h后培養液中含有700yg/mLG418和8μΜGancvilor，每3d換液1次，96h后用0.25%胰蛋白酶消化細胞并進行流式細胞分選，含有GFP的細胞接種于細胞培養皿中，100個細胞/培養皿，用700μg/mLG418和8μΜGancvilor繼續進行正負篩選，培養IOd后，在熒光倒置顯微鏡下挑選有綠色熒光的細胞克隆(具備G418和Gancvilor抗性且產生綠色熒光的細胞可能是β6基因敲除的純合子細胞)，擴繁2-3代，期間取部分細胞進行鑒定，其余細胞液氮保存、備用。4.卵母細胞的成熟培養、去核與實施例1卵母細胞的成熟培養、去核方法相同。5.核移植和克隆胚胎的體外培養與實施例1核移植和克隆胚胎的體外培養方法相同。6.胚胎移植與妊娠檢測將形態優良的第7d的克隆囊胚移入已同期的受體牛的子宮角內。在移植后的第30d對受體母牛進行B超檢測以確定受胎情況，并在移植后的第60d和90d進行直腸檢測以確定妊娠率。共移植受體牛36頭，移植后的第60d直腸檢測表明，其中17頭懷孕。7.轉基因純合子陽性細胞及克隆牛的分子生物學鑒定(I)PCR鑒定1)用于PCR鑒定的第二條染色體β6基因發生同源重組的陽性模板質粒的構建以荷斯坦奶牛胎兒成纖維細胞的基因組DNA為模板，在引物pLeftupper-18175，-ATAAGAATGCGGCCGCGATCAGAGAGGCTGCGACTG-3，(帶下劃線的堿基為限制性內切酶NotI的識別位點)與弓丨物pLeftlower5，ACGCGTCGACGGGCACTTTGTTAGACTGA-3‘的引導下，PCR克隆片段為4049bp片段，反應條件為94V30s；94V20s55°C20s68°C3min,25個循環；68°C7min。反應結束后對PCR產物進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收目的片段。將該片段用NotI和SalI酶切后回收與經相同酶切的載體pRui連接，然后將連接產物轉化E.coliDH5α，挑取單菌落搖菌、提質粒，并進行酶切和測序鑒定，得到含有目的片段的重組載體，命名為pRui-ko-model-2(圖13)，在pRui-ko-model-2base1433-1455設計上游弓丨物Pl:5，-TTCCCTAGCCTGCCTTCTATTAT-3，(同pRui-ko-model)，在pGK_GFP開放閱讀框上base5125-5106設計下游引物P45，-AGTTCACCTTGATGCCGTTC-3，，可做二次打靶載體pRui_GFP_β6打靶后發生同源重組的細胞/轉基因牛跨越式PCR鑒定的模板。2)β6基因敲除純合子的跨越式PCR鑒定以二次打靶獲得的牛胎兒成纖維neo抗性及綠色熒光克隆或轉基因牛的基因組DNA為模板，跨越式PCR鑒定引物Pl和P2及Pl和P4的分別引導下，PCR擴增3236bp及3693bp的片段分別為第一次和第二次同源重組陽性。PCR反應條件94°C30s；94°C20s55°C20s68°C3min，35個循環；68°C7min。(2)Southern雜交鑒定取約10μg轉基因克隆牛胎兒組織或轉基因牛耳部組織的基因組DNA，以普通荷斯坦奶牛或魯西黃牛的基因組DNA作為陰性對照，用限制性內切酶Eco065I酶切消化，30V低壓電泳，轉膜后，進行Southern雜交。雜交所用探針分別為利用rediprimerIIrandomprimerlabelingsystem(amersham)、由[α-32P]dCTP同位素標記的、經限制性內切酶SalI和XhoI酶切消化的pRUI載體neo基因或pRui-GFP-β6載體GFP基因回收產物，第一次打靶(β6被neo基因替換)的雜交陽性信號為6.5kb片段，第二次打靶(β6被GFP基因替換)的雜交陽性信號為6.4kb片段。(3)Real-timeRT-PCR鑒定與實施例IReal-timeRT-PCR方法相同。8.轉基因牛的FMDV攻毒實驗與實施例1轉基因牛的FMDV攻毒實驗方法相同。實施例3體細胞克隆整合素β6亞基基因敲除的雜合子轉基因黃牛的生產及分子生物學檢測體細胞克隆整合素β6亞基基因敲除的雜合子轉基因黃牛的生產流程如圖1所示，具體過程包括如下步驟1.整合素β6亞基基因敲除的打靶載體魯西黃牛和荷斯坦奶牛β6基因同源性很高，故本研究中使用了實施例1中所用的奶牛打靶載體。2.魯西黃牛胎兒皮膚成纖維細胞系的建立選取2月齡的魯西黃牛胎兒(購自山東省魯西黃牛原種場)，其胎兒皮膚成纖維細胞系的制備方法與實施例1奶牛胎兒皮膚成纖維細胞系的制備方法相同。3.魯西黃牛胎兒皮膚成纖維細胞的脂質體轉染和篩選與實施例1奶牛胎兒皮膚成纖維細胞的脂質體轉染和正負篩選方法相同。4.卵母細胞的成熟培養、去核與實施例1卵母細胞的成熟培養、去核方法相同。5.核移植和克隆胚胎的體外培養與實施例1核移植和克隆胚胎的體外培養方法相同。6.胚胎移植與妊娠檢測將形態優良的第7d的克隆囊胚移入已同期的受體牛的子宮角內。在移植后的第30d對受體母牛進行B超檢測以確定受胎情況，并在移植后的第60d和90d進行直腸檢測以確定妊娠率。共移植受體牛討頭，移植后的第60d直腸檢測表明，其中沈頭懷孕。手術取2個胎兒進行鑒定，均為轉基因陽性(圖14)，制備成纖維細胞，一部分用于體細胞克隆制備雜合子轉基因牛，一部分用于二次打靶和體細胞克隆制備純合子轉基因牛。7.轉基因雜合子陽性細胞、胎兒及克隆牛的分子生物學鑒定(I)PCR鑒定具體方法同實施例1。(2)Southern雜交鑒定具體方法同實施例1。(3)Real-timeRT-PCR鑒定具體方法同實施例1。8.轉基因牛的FMDV攻毒實驗具體方法同實施例1。實施例4體細胞克隆整合素β6亞基基因敲除的純合子轉基因黃牛的生產及分子生物學檢測體細胞克隆整合素β6亞基基因敲除的純合子轉基因黃牛的生產流程如圖1所示，具體過程包括如下步驟1.整合素β6亞基基因敲除的二次打靶載體魯西黃牛整合素β6亞基基因敲除的二次打靶載體同實施例2中所用的奶牛打靶載體。2.魯西黃牛轉基因雜合子胎兒皮膚成纖維細胞系的建立選取2月齡的魯西黃牛轉基因雜合子胎兒(由實施例3獲得)，其胎兒皮膚成纖維細胞系的制備方法與實施例2轉基因奶牛胎兒皮膚成纖維細胞系的制備方法相同。3.魯西黃牛轉基因雜合子胎兒皮膚成纖維細胞的脂質體轉染和篩選與實施例2轉基因雜合子奶牛胎兒皮膚成纖維細胞的脂質體轉染和正負篩選方法相同。4.卵母細胞的成熟培養、去核與實施例1卵母細胞的成熟培養、去核方法相同。5.核移植和克隆胚胎的體外培養與實施例1核移植和克隆胚胎的體外培養方法相同。6.胚胎移植與妊娠檢測將形態優良的第7d的克隆囊胚移入已同期的受體牛的子宮角內。在移植后的第30d對受體母牛進行B超檢測以確定受胎情況，并在移植后的第60d和90d進行直腸檢測以確定妊娠率。共移植受體牛M頭，移植60d后直腸檢測表明，其中沈頭懷孕。7.轉基因純合子陽性細胞、胎兒及克隆牛的分子生物學鑒定(I)PCR鑒定具體方法同實施例2。(2)Southern雜交鑒定具體方法同實施例2。(3)Real-timeRT-PCR鑒定具體方法同實施例1。8.轉基因牛的FMDV攻毒實驗具體方法同實施例1。權利要求1.一種通過敲除口蹄疫病毒受體整合素β6亞基基因獲得抗口蹄疫轉基因牛的方法，其特征在于是將堿基序列如序列表中序列1所示的線性化的攜帶有報告基因的突變的整合素β6亞基基因的打靶載體轉染正常牛的牛胎兒成纖維細胞，通過同源重組獲得替換整合素β6亞基基因的核供體細胞，將核供體細胞核導入牛的去核卵母細胞中得到重構胚，再將重構胚移入代孕牛子宮中，得到的子代即為整合素β6亞基基因被敲除的雜合子轉基因牛。2.根據權利要求1所述的通過敲除口蹄疫病毒受體整合素β6亞基基因獲得抗口蹄疫轉基因牛的方法，其特征在于，還包括以下方法雜合子轉基因牛經二次打靶和體細胞克隆獲得純合子轉基因牛；或雜合子轉基因公牛和雜合子轉基因母牛正常交配繁殖而獲得純合子轉基因牛。3.根據權利要求1或2所述的通過敲除口蹄疫病毒受體整合素β6亞基基因獲得抗口蹄疫轉基因牛的方法，其特征在于所述牛為奶牛或肉牛。4.根據權利要求1或2所述的通過敲除口蹄疫病毒受體整合素β6亞基基因獲得抗口蹄疫轉基因牛的方法，其特征在于所述牛胎兒成纖維細胞為45150日齡胎兒不同組織來源的成纖維細胞。5.根據權利要求1或2所述的通過敲除口蹄疫病毒受體整合素β6亞基基因獲得抗口蹄疫轉基因牛的方法，其特征在于所述牛胎兒成纖維細胞為耳成纖維細胞、皮膚成纖維細胞、輸卵管上皮細胞或卵丘細胞。6.根據權利要求1或2所述的通過敲除口蹄疫病毒受體整合素β6亞基基因獲得抗口蹄疫轉基因牛的方法，其特征在于所述將線性化的攜帶有報告基因的突變的整合素β6亞基基因的打靶載體轉染牛胎兒成纖維細胞方法為電轉染法、脂質體轉染法、病毒載體法或磷酸鈣沉淀法。7.根據權利要求6所述的通過敲除口蹄疫病毒受體整合素β6亞基基因獲得抗口蹄疫轉基因牛的方法，其特征在于所述將線性化的攜帶有報告基因的突變的整合素β6亞基基因的打靶載體轉染牛胎兒成纖維細胞方法為脂質體轉染法。8.根據權利要求7所述的通過敲除口蹄疫病毒受體整合素β6亞基基因獲得抗口蹄疫轉基因牛的方法，其特征在于所述脂質體轉染法的條件為線性化的載體DNA濃度不低于1μg/μL,DNA月旨質體LTX=13。9.根據權利要求1或2所述的通過敲除口蹄疫病毒受體整合素β6亞基基因獲得抗口蹄疫轉基因牛的方法，其特征在于所述將線性化的攜帶有報告基因的突變的整合素β6亞基基因的核供體細胞核導入牛的去核卵母細胞的方法為顯微注射法。10.根據權利要求1或2所述的通過敲除口蹄疫病毒受體整合素β6亞基基因獲得抗口蹄疫轉基因牛的方法，其特征在于所述去核卵母細胞不帶有第一極體。全文摘要本發明公開了一種通過敲除口蹄疫病毒受體整合素β6亞基基因獲得抗口蹄疫轉基因牛的方法，是將線性化的攜帶有報告基因的突變的整合素β6亞基基因的打靶載體轉染牛體細胞，通過同源重組獲得替換整合素β6亞基基因的核供體細胞，將核供體細胞核導入牛的去核卵母細胞中得到重構胚，再將重構胚移入代孕牛子宮中，得到的子代即為整合素β6亞基基因被敲除的雜合子轉基因牛。雜合子轉基因牛經二次打靶和體細胞克隆獲得純合子轉基因牛。用本方法獲得的轉基因牛低表達或不表達口蹄疫病毒受體整合素β6亞基，使FMDV感染率明顯下降，其具備了抗FMD的能力。該發明打破了傳統的通過免疫學手段預防FMD的思維模式，為控制和消滅牛FMD開辟了新的途徑。文檔編號C12N15/877GK102321609SQ20111026168公開日2012年1月18日申請日期2011年9月6日優先權日2010年9月9日發明者仲躋峰,何洪彬,劉曉,武建明,王洪梅,陳莉莉,高運東申請人:山東省農業科學院奶牛研究中心