專利名稱：女性生殖器癌癥相關snp位點多重檢測方法的建立的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術應用領域，涉及正常體檢人群的全血和口腔拭子等標本的6個女性生殖器癌癥相關 SNP 位點(包括 rs4784227、rsl2196489、rs3803662、rs889312、rs750749 和 rs749292)的同時檢測和分型。具體在 http: IIwm. ncbi. nlm. nih. gov/snp/ 下載 SNP 位點 rs4784227 (C > T)、rsl2196489 (G > A)、rs3803662 (T > C)、rs889312 (C > A)、rs750749 (T > C)和rs749292 (G > A)側翼的核苷酸序列，設計各位點適用于T-ARMS-PCR技術的內外特異性引物，對6個SNP位點進行單管多重PCR分型。本專利通過多重嵌合引物PCR技術和毛細管電泳兩項改進，克服了常規單管四引物擴增受阻突變體系PCR不能多重檢測的缺點，其高通量、簡易快速的特點為女性生殖器癌癥相關SNP位點的快速分型提供了新的手段，對研究我國女性生殖器癌癥相關SNP位點的基因型分布和女性生殖器癌癥的預防有重要意義。
背景技術：
在人類基因組序列中，單核苷酸多態性(single nucleotide polymerphisms,SNPs)是最常見的變異。已有研究表明，SNP位點rs4784227(C > T)、rsl2196489 (G > A)、rs3803662(T > C)和rs889312(C > A)與亞裔女性的乳腺癌易感性相關，rs750749 (T >C)是子宮頸癌易感性相關位點，rs749292(G > A)是卵巢癌易感性相關位點。對這6個位點快速準確的分型有助于女性生殖器癌癥的預防。在近年來發展出的多種SNP檢測技術中，四引物擴增受阻突變體系PCR(tetra-primer amplification refractory mutation system PCR, T-ARMS-PCR),或兩對交叉引物 PCR(PCR with confronting two-pair primers, PCR-CTPP)因其操作簡便、分型快速、費用低廉已被廣泛應用。其原理為針對已知的突變，在突變點的兩側分別設計一對外引物和一對特異性內引物，特異性內引物用來檢測突變是否發生，外引物在PCR反應中和特異性內引物分別配對有選擇性地擴增突變型與野生型個體基因；通過使外引物距突變點長度不同可以得到不同長度的特異性擴增片段，根據電泳圖譜中片段大小和有無，可以判斷突變是否發生以及個體的基因型。目前，T-ARMS-PCR仍以單重檢測為主，少數實驗室也能實現多重檢測(Multiplex-T-ARMS-PCR, M-T-ARMS-PCR)，但其可同時檢測的位點數量難以進一步提高，主要受到兩個限制多重擴增的偏向性及瓊脂糖電泳的分辨率。本實驗通過引入多重嵌合引物PCR技術對T-ARMS-PCR進行了改進，在擴增初期使用特異性嵌合引物(即在特異性引物5’端引入通用序列)擴增，而擴增末期由通用引物引發擴增，從而在保證反應特異性的同時，降低了多重PCR的偏向性。此外應用分辨率較高的毛細管電泳(capillaryelectrophoresis, CE)替代瓊脂糖電泳，建立了單管多重PCR同時檢測女性生殖器癌癥相關位點 rs4784227 (OT), rsl2196489 (G > A)、rs3803662 (T > C)、rs889312 (C > A)、rs750749 (T > C)和rs749292 (G > A)的六位點檢測方法
發明內容
I.在 http: //www. ncbi. nlm. nih. gov/snp/ 下載 SNP 位點 rs4784227 (C > T)、rsl2196489 (G > A)、rs3803662 (T > C)、rs889312 (C > A)、rs750749 (T > C)和 rs749292 (G
>A)側翼的核苷酸序列，設計適用于T-ARMS-PCR技術的引物。在內引物的3 ’端倒數第二位(-2位)引入一個人為錯配堿基來提高延伸反應的特異性，并在全部正向引物和反向引物的5’端分別加入一段非同源性序列作為通用引物(Tag-F和Tag-R)。使用Primer Premier5.0設計的引物序列如表I :表I表I多重T-ARMS-PCR分型所使用的引物信息
觸齡弓丨物名稱_序歹U (5，-3，)_IT￡
rs47S4 .77 Forward mner Pnmer (T 型〉ArTGTGACACTATArTAATAAAAAGTCCCAATTTGTAGTGTTTGaT50322
rs4784227-476T-2A-tagF -
tagR^) GTACGACTCACTATAGGGAATGGGAGTATTTACATCACAATAATgG30297
Forward outer primer:AGGTGACACTATAGAAIACTGACCCCTTTAGACACGG5
rs4784227-268-tagF-
Reverse outer primer:GTACGACTCACTATAGGGAGGGCTTCAACACAGTCAGTTC9
rs4784227-760-tagR-
rs 17.19648 Forward inner pnmer (G 型〕OTACGACTCACTATAGGGACACGCCTATTTTACTTGACACAaG50 269
rsl219648-278G-2A-tagR-4---
Reverse mneT pnmer (A^);GTACGACTCACTATAOGGACCArGCTCCATCCTTOAAGAaT40197
rs 1219648-321 T-2A-tagR-
F^^d uierPnm7,erGTACGACTCACTATAGGGACACAATGGCGCAGAATTA7
rsl219648-l62-tagR-*--
Revere outer primer:GTACG^CTCACTATAGGGACTGGACAGGTCArTGTGGTG7.5
rs!219648-509-tagR-
r^S0^662 Forward inner Primertc 型):AGGTGACACTATAGAAIACTCTCCTTAATGCCTCTATAGCTGTaC30259
rs3803662-275C-2A-tagF-
Reverse inner primer (T 型)AGGTGACACTATAGAATACCACAGTTTTAITCl I CGl I AacA75357
rs3803662-324A-2C-tagF-
Forw^d. ut_er prImerAGGTGACACTATAGAAI'AGTCCTTGGCTGTTCTGTGA10
rs3803662o-tagF--
Reverrse 0utfrr pnm^rAGGTGACACTATArrAATATCCCCAAGGAGACAAAGGTA7
rs3 803662-496-tagF-
rs889312 Forward inner Pnmer 巧型)AGGTGACACTATAGAATATGCCCCTGCTGGAGAAAGtA60213
rs889312-382A-2T_tagl
Reverse innerPnmer CC 型〕:GTACGACTCACTATAGGGATGATTTGTAGTCTCTTAATTTGCACAaG85340
rs889312^28G-2A-tagR-
Forward outer primer:AGGTGACACTATAGAATACCIGGGTCCTTAGCATTCC13
rs8 89312-126-tagF-
Reverse outer pnmerGTACGACTCACTATAGGGAATCTGTGCCCTGAAGTGAGTAG9
rs889312-557-tagR-
r=；7S0749 Forward inner primer CC 型)aOGTGACACTATAGAATAGAGGCTGAGAACTAATAATAATTTTcC50371
rs750749-275C-2C-tagF-
Reverse inner primer (T 型)CjTACGACTCACTATAGGGACTTCAGATGAAAACTGCTGTGTAAria、75226
rs750749-327A-2A-tagR-
pnTer:AGGTGACACTATA(]AATACCCACAGAGTTGGAATGCTT12
rs750749-139-tagF-
Reverse outer pnmer:GTACGACTCACTATAGGGATGCATAAAGTGGGTCCTGC7.5
rs750749-608-tagR--
rs749 .97 Forward mner pnmer (G 型)AGGTGACACTATAGAATACCTTCTTCAAACCTCGGAGTaG3 5282
rs749292-429G-2A-tagF-
Reverse inner primer (AM)OTACGACTCACTATAGGGAGATAGAAATTGTGCAGGAATCCaT25330
rs749292-472T-2A-tagR-
Fo^Hr pn^ier:AGGTGACACTATAGAATATCCACGGACAGAGCAGG4.5
rs749292-180-tagF-
^749292°673 亡__GTACGACTCACTATAGGGAGATTAGGGGACCTCCGTGA_7_注下劃線處為通用引物標簽序列(Tag);陰影部分的是為保證擴增特異性而特別設計的喊基，3’末端是多態位點，~2位是人為錯配。2.建立了如下的檢測過程，詳見如下(I)合成引物特異性嵌合引物及上下游通用引物標簽(Tag-F和Tag-R)由北京六合華大基因科技股份公司合成，PAGE純化。(2)外周靜脈血標本，采用血液基因組DNA提取試劑盒(天根生化)提取；口腔拭子DNA，采用口腔拭子基因組DNA提取試劑盒(天根生化)提取。(3)建立同時檢測6個SNP位點的多重T-ARMS-PCR反應體系，并對其特異性進行驗證。
具體實施例方式實施方案I :多重PCR擴增使用Multiplex PCR Kit(QIAGEN)試劑盒。PCR反應體系為20 yl，其中全血DNA模板0. 5 ill，口腔拭子DNA模板2 ill，通用引物500nM，其余引物濃度見表I。PCR反應分6步擴增目的片段第I步95°C預變性IOmin ;第2步95°C變性30s，60°C復性30s，72°C延伸45s，循環3次；第3步95°C變性30s，58°C復性30s，72°C延伸45s，循環10次；第4步95°C變性 30s，68°C 復性 30s，72°C延伸 45s，循環 20 次；第 5 步95°C變性 30s, 55°CM 性30s，72°C延伸45s，循環12次；第6步72°C延伸5min，4°C保存。每份標本做2個重復。實施方案2 :毛細管電泳分離米用QIAxcel system(Qiagen)毛細管電泳系統，QIAxcel DNA high-resolutioncartridge (Qiagen)及 0H700 方法作為分離條件，與 QX Alignment Marker 15bp/500bp、QXDNA Size Marker 25_450bp 配合使用，經 Biocalculator software (Qiagen)軟件分析，以對應長度的產物是否存在進行SNP分型。實施方案3 :測序驗證PCR反應體系25 u I，其中全血DNA模板0. 5 iU，口腔拭子DNA模板2 iU，PremixEx Taq Version 2. 0 (TakKaRa) 12. 5 U 1，各位點取不帶 Tag 的外引物各 500nM。PCR 反應為95°C預變性 5min ;95°C變性 30s，58°C復性 30s，72°C延伸 45s，循環 45 次；72°C延伸 5min，4°C保存。將產物進行測序，并將測序結果與M-T-ARMS-PCR電泳結果進行對照。
權利要求
1.一種用于同時檢測女性生殖器官癌癥相關SNP位點rs4784227 (C>T),rsl2196489 (G > A)、rs3803662 (T > C)、rs889312 (C > A)、rs750749 (T > C)和 rs749292 (G>A)的多重PCR技術，其中包括用于檢測的rs4784227(C > T)、rsl2196489 (G > A)、rs3803662 (T > C)、rs889312 (C > A)、rs750749 (T > C)和 rs749292 (G > A)的型特異性內、外引物。
2.權力要求I所述的多重PCR技術的引物和通用引物包括表I所列的基因序列及其每種序列的互補序列或變體。
3.權力要求I所述的多重PCR檢測技術用于檢測包括女性生殖器官癌癥相關SNP位點rs4784227(C > T)、rsl2196489(G > A)、rs3803662(T > C)、rs889312(C > A)、rs750749(T>C)和 rs749292 (G > A)。
4.權力要求3所述的本發明的應用范圍包括正常體檢人群的全血和口腔拭子等標本的6個女性生殖器癌癥相關SNP位點(包括rs4784227、rsl2196489、rs3803662、rs889312、rs750749和rs749292)的同時檢測和分型。
5.權力要求I所述的同時檢測女性生殖器官癌癥相關SNP位點rs4784227(C> T)、rsl2196489 (G > A)、rs3803662 (T > C)、rs889312 (C > A)、rs750749 (T > C)和 rs749292 (G>A)的多重PCR技術的反應程序和檢測程序。
全文摘要
本發明屬于生物技術應用領域，涉及正常體檢人群的全血和口腔拭子等標本的6個女性生殖器癌癥相關SNP位點(包括rs4784227、rs12196489、rs3803662、rs889312、rs750749和rs749292)的同時檢測和分型。具體在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/下載SNP位點rs4784227(C＞T)、rs12196489(G＞A)、rs3803662(T＞C)、rs889312(C＞A)、rs750749(T＞C)和rs749292(G＞A)側翼的核苷酸序列，設計各位點適用于T-ARMS-PCR技術的內外特異性引物，對6個SNP位點進行單管多重PCR分型。本發明通過多重嵌合引物PCR技術和毛細管電泳兩項改進，克服了常規單管四引物擴增受阻突變體系PCR不能多重檢測的缺點，其高通量、簡易快速的特點為女性生殖器癌癥相關SNP位點的快速分型提供了新的手段，對研究我國女性生殖器癌癥相關SNP位點的基因型分布和女性生殖器癌癥的預防有重要意義。
文檔編號C12N15/11GK102965427SQ20111025778
公開日2013年3月13日 申請日期2011年9月2日 優先權日2011年9月2日
發明者馬學軍, 劉穎, 張晨 申請人:中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所