專利名稱：化學與酶協同水解制革下腳料生產工業蛋白粉的方法
技術領域：
本發明涉及一種化學與酶協同水解制革下腳料生產工業蛋白粉的方法，屬于工業蛋白粉的制備領域。
背景技術：
制革生產中由于修邊、片皮和削勻等操作工序會產生大量的邊角余料，俗稱制革下腳料。據統計，我國制革行業中每年產生的下腳料達140萬噸。如果將這類下腳料直接排放到環境中，不僅是資源的巨大浪費，而且會造成嚴重的環境污染。因此，對這些制革下腳料進行回收再利用對制革工業的可持續發展具有重要意義。制革下腳料中一部分為含鉻下腳料，約占60% ；而另一部分為不含鉻下腳料，約占40%。隨著白濕皮技術在制革行業中的推廣應用，不含鉻制革下腳料的數量呈現增加的趨勢。制革下腳料的主要成分為膠原蛋白，約占總量的80 90%，是寶貴的蛋白資源。 在過去，制革下腳料主要用作生產飼料添加劑，但由于存在基因病的風險(G. J. Piazza, R. A. Garcia. Proteins and peptides as renewable flocculants, Bioresource Technology, 2010，101 :5759-5766)，近年來歐美及我國已禁止使用制革下腳料生產飼料添加劑。另一方面，由于蛋白類助劑(蛋白類表面活性劑、蛋白類膠粘劑等)具有獨特的功能特性和良好的生物降解性，因此可從制革下腳料中提取工業蛋白并以此生產各種助劑。但是，此類工業蛋白的分子量及其分布對下游產品的性能將產生重大影響(蔣挺大.膠原與膠原蛋白.化學工業出版社，2006，1-7)。例如，在制備浮選劑、絮凝劑、水凝膠和膠粘劑等產品時，一般應選擇高分子量的工業蛋白作為原料，因為大分子的蛋白在氫鍵和疏水鍵的作用下更易形成分子間的三維網狀結構，從而具有更大的比表面積和更多的作用位點，進而賦予產品良好的吸附性、持水性和粘結性；在開發滲透劑、乳化劑等產品時，一般選擇中、 小分子量的工業蛋白作為原料，因為中、小分子的膠原蛋白具有更優的溶解性和親水性，進而賦予下游產品更優的性能；在與其它高分子共混制備復合材料時，所采用工業蛋白的分子量性質也將對復合材料的性能產生顯著影響。然而，我國以制革下腳料為原料制備工業蛋白粉的傳統工藝為酸法或堿法(劉忠.用皮革下腳料生產蛋白粉的方法.ZL95117460. 6 ； 張小燕，楊德玉，高全昌等.皮革下腳料提取蛋白的方法.ZL01106725. X)，上述方法雖然工藝簡單、生產成本較低，但膠原蛋白在被提取的過程中自身結構受到嚴重的破壞，所得到蛋白粉的分子量及其分布難以控制，無法滿足生產具有高性能的下游產品的要求，而以制革下腳料為原料制備具有特定分子量工業蛋白粉的方法鮮有報道。
發明內容
本發明的目的是針對現有技術的不足而提供一種化學與酶協同水解制革下腳料生產工業蛋白粉的方法，其特點是克服傳統生產工藝上的局限性，而建立一套以制革下腳料生產具有特定分子量及其分布的工業蛋白粉的方法，為生產具有高性能的工業蛋白產品提供必要的原料。
本發明的目的由以下技術措施實現，其中所述原料份數除特殊說明外，均為重量份數。本發明者在考察以制革下腳料為原料制備得到的工業蛋白粉的性質時發現，化學與酶協同工藝對水解制革下腳料中的膠原蛋白具有高效的靶向性和特異性，它可以選擇性地破壞膠原分子間的作用力和膠原分子內的特定位置的化學鍵，進而得到具有特定分子量及其分布的膠原蛋白粉。化學與酶協同水解制革下腳料生產工業蛋白粉的方法包括以下步驟(1)將100份制革下腳料粉碎到粒度0. 1 0. 5mm,加入到400 800份水中，于溫度40 60°C浸泡0. 5 4. Oh,加入1 5份化學試劑，于溫度40 60°C攪拌反應0. 5 4. Oh,再加入0. 2 0. 8份蛋白酶，于溫度40 70°C攪拌反應2 6h，然后調節溶液pH至 6-8 ；(2)對步驟(1)反應后的物料進行酶滅活處理，然后過濾；(3)將步驟⑵中濾液進行干燥，獲得工業蛋白粉產品；得到的產品分別為具有平均分子量1 5kDa，10 50kDa或100 300kDa的工業蛋白粉。制革下腳料為未經鉻鞣制的邊角余料，包括牛皮、羊皮和豬皮。化學試劑為氫氧化鈉、氫氧化鈣、碳酸鈉、碳酸氫鈉、硫酸銨、鹽酸或硫酸中的任一種。蛋白酶為1398蛋白酶、2709蛋白酶、Alcalase、菠蘿蛋白酶、胰蛋白酶、Neutral、 537蛋白酶、木瓜蛋白酶、無花果蛋白酶、蛋白酶K、鏈酶蛋白酶或胃蛋白酶中的任一種。酶滅活處理為在溫度100°C攪拌5 IOmin或加入0. 01 0. 5份過氧化氫在溫度30 60°C攪拌5 IOmin。干燥方式為噴霧干燥、熱風干燥或冷凍干燥中的任一種。性能測試1.平均分子量的測定采用水相凝膠色譜法，凝膠色譜儀型號WaterS1515，測試范圍1 IOOOkDa02.氨基含量的測定采用甲醛滴定法(遲原龍等.膠原水解度的測定.中國皮革， 2010,39 13 16)。3.等電點的測定采用Zeta電位法，Zeta電位儀型號MalvernNano S90。4.基團分析利用傅里葉紅外光譜儀，紅外光譜儀型號Thermofisher Nicdet is 10，測定范圍500 4000cm-1 ο5.分子量分布測定采用SDS-PAGE電泳法，電泳儀型號=Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra System，測定范圍3kDa 220kDa。本發明具有如下優點1.采用本發明方法可以選擇性地制備得到具有特定性質的工業蛋白粉，如分子量分布、等電點、氨基和羧基含量、氨基酸組成等，進而賦予蛋白粉不同的結構特征、物化性質和功能特性等，為制備具有高性能的工業蛋白產品提供必要的原料。2.本發明方法生產過程簡單，操作性強，易于推廣，且所得產品有較高的附加值， 具有良好的市場前景。
3.本發明方法以皮革廢棄物為原料，對制革工業的節能減排和生物質資源的再利用具有積極作用。并且本發明方法采用化學與酶協同工藝，生產過程對環境污染小，屬于綠色清潔化技術。
圖1(a)、(b)和(c)分別為本發明實施例2、5、9中制備的工業蛋白粉的紅外圖譜， 圖中1653CHT1和1541CHT1為酰胺鍵的特征吸收峰，1457cm"1為亞甲基的特征吸收峰，以上特征峰值可以表征蛋白粉的基團特征和蛋白降解程度。圖2為本發明實施例5中制備的工業蛋白粉的SDS-PAGE電泳譜帶，圖中M代表電泳測定標準樣品。圖3為本發明實施例9中制備的工業蛋白粉的SDS-PAGE電泳譜帶，圖中M代表電泳測定標準樣品。
具體實施例方式下面通過實施例對本發明進行具體的描述，有必要在此指出的是本實施例只用于對本發明進行進一步說明，不能理解為對本發明保護范圍的限制，該領域的技術熟練人員可以根據上述本發明的內容作出一些非本質的改進和調整。實施例1將100份豬皮下腳料粉碎至粒度0. 1 0. 5mm,加入到400份水中，于溫度40°C浸泡4h，加入5份碳酸鈉，于溫度40°C攪拌反應4h，再加入0. 3份菠蘿蛋白酶，于溫度50°C攪拌反應他，然后調節溶液pH至7. 4 ；升溫至100°C，滅酶活5min，冷卻至常溫后以200目紗布進行過濾，將濾液于進口溫度180°C，出口溫度100°C下進行噴霧干燥，獲得工業蛋白粉產品。其平均分子量為4800Da，氨基含量為0. 85mmol氨基/g蛋白粉，等電位為3. 3。實施例2將100份牛皮下腳料粉碎至粒度0. 1 0. 5mm,加入到500份水中，于溫度50°C浸泡lh，加入2份氫氧化鈣，于溫度50°C攪拌反應2h，再加入0. 4份1398蛋白酶，于溫度60°C 攪拌反應4h，然后調節溶液pH至7 ；升溫至100°C，滅酶活7min，冷卻至常溫后以200目紗布進行過濾，將濾液于進口溫度180°C，出口溫度100°C下進行噴霧干燥，獲得工業蛋白粉產品。其平均分子量為4000Da，氨基含量為0. 95mmol氨基/g蛋白粉，等電位為3. 0。所制備的蛋白粉的紅外圖譜如1 (a)所示。實施例3將100份羊皮下腳料粉碎至粒度0. 1 0. 5mm,加入到600份水中，于溫度50°C浸泡3h，加入1份碳酸氫鈉，于溫度50°C攪拌反應3h，再加入0. 6份Alcalase，于溫度50°C攪拌反應池，然后調節溶液PH至7. 8 ；升溫至100°C，滅酶活lOmin，冷卻至常溫后以200目紗布進行過濾，將濾液于進口溫度180°C，出口溫度100°C下進行噴霧干燥，獲得工業蛋白粉產品。其平均分子量為3300Da，氨基含量為1. 20mmol氨基/g蛋白粉，等電位為2. 3。實施例4將100份豬皮下腳料粉碎至粒度0. 1 0. 5mm,加入到700份水中，于溫度60°C浸泡2h，加入3份氫氧化鈉，于溫度60°C攪拌反應2h，再加入0. 3份2709蛋白酶，于溫度60°C攪拌反應池，然后調節溶液PH至8 ；升溫至100°C，滅酶活lOmin，冷卻至常溫后以200目紗布進行過濾，將濾液于進口溫度180°C，出口溫度100°C下進行噴霧干燥，獲得工業蛋白粉產品。其平均分子量為2400Da，氨基含量為1. 40mmol氨基/g蛋白粉，等電位為1. 9。實施例5將100份牛皮下腳料粉碎至粒度0. 1 0. 5mm，加入到450份水中，于溫度40°C浸泡4h，加入1份碳酸鈉，于溫度40°C攪拌反應池，再加入0. 2份胰蛋白酶，于溫度45°C攪拌反應4h，然后調節溶液pH至7. 5 ；升溫至100°C，滅酶活5min，冷卻至45 55°C時以200目紗布進行過濾，將濾液于進口溫度180°C，出口溫度100°C下進行噴霧干燥，獲得工業蛋白粉產品。其平均分子量為141^^，氨基含量為0.75!1111101氨基/^蛋白粉，等電位為3.9。所制備的蛋白粉的紅外圖譜如1 (b)所示，電泳譜帶如圖2所示。實施例6將100份羊皮下腳料粉碎至粒度0. 1 0. 5mm,加入到500份水中，于溫度45°C 浸泡4h，加入3份氫氧化鈣，于溫度45°C攪拌反應4h，再加入0. 4份Neutral ，于溫度55°C 攪拌反應池，然后調節溶液PH至7. O ；升溫至100°C，滅酶活5min，冷卻至45 55°C時以 200目紗布進行過濾，將濾液于進口溫度180°C，出口溫度100°C下進行噴霧干燥，獲得工業蛋白粉產品。其平均分子量為26kDa，氨基含量為0. 6mmol氨基/g蛋白粉，等電位為4. 4。實施例7將100份豬皮下腳料粉碎至粒度0. 1 0. 5mm,加入到600份水中，于溫度50°C浸泡2h，加入2份硫酸銨，于溫度50°C攪拌反應3h，再加入0. 5份537蛋白酶，于溫度50°C 攪拌反應3h，然后調節溶液pH至6. 5 ；升溫至100°C，滅酶活5min，冷卻至45 55°C時以 200目紗布進行過濾，將濾液先50°C熱風干燥6h，再升溫至80°C干燥12h，產物粉碎至粒度 0. 1 0. 15mm，獲得工業蛋白粉產品。其平均分子量為34kDa，氨基含量為0. 52mmol氨基/ g蛋白粉，等電位為5.0。實施例8將100份豬皮下腳料粉碎至粒度0. 1 0. 5mm,加入到800份水中，于溫度60°C浸泡lh，加入1份硫酸，于溫度60°C攪拌反應lh，再加入0. 8份木瓜蛋白酶，于溫度60°C攪拌反應4h，然后調節溶液pH至7. O ；升溫至100°C，滅酶活5min，冷卻至45 55°C時以200目紗布進行過濾，將濾液先50°C熱風干燥8h，再升溫至80°C干燥12h，產物粉碎至粒度0. 1 0. 15mm，獲得工業蛋白粉產品。其平均分子量為44kDa，氨基含量為0. 38mmol氨基/g蛋白粉，等電位為5.4。實施例9將100份牛皮下腳料粉碎至粒度0. 1 0. 5mm,加入到700份水中，于溫度40°C浸泡3h，加入1. 2份硫酸，于溫度40°C攪拌反應2h，再加入0. 3份胃蛋白酶，于溫度60°C攪拌反應池，然后調節溶液PH至6 ；加入0. 5份過氧化氫滅酶活，然后以200目紗布進行過濾， 將濾液于進口溫度180°C，出口溫度100°C下進行噴霧干燥，再粉碎至粒度0. 1 0. 2mm，獲得工業蛋白粉產品。其平均分子量為120kDa，氨基含量為0. 33mmol氨基/g蛋白粉，等電位為 6. O。所制備的蛋白粉的紅外圖譜如1 (c)所示，電泳譜帶如圖3所示。實施例10
將100份羊皮下腳料粉碎至粒度0. 1 0. 5mm,加入到400份水中，于溫度50°C浸泡0. 5h，加入5份氫氧化鈣，于溫度50°C攪拌反應4h，再加入0. 8份無花果蛋白酶，于溫度 60°C攪拌反應池，然后調節溶液pH至6. 4 ；加入0. 05份過氧化氫滅酶活，再以200目紗布進行過濾，將濾液于進口溫度180°C，出口溫度100°C下進行噴霧干燥，再粉碎至粒度0. 1 0.2mm，獲得工業蛋白粉產品。其平均分子量為180kDa，氨基含量為0.24mmol氨基/g蛋白粉，等電位為6. 5。實施例11將100份豬皮下腳料粉碎至粒度0. 1 0. 5mm,加入到600份水中，于溫度40°C 浸泡3.證，加入1. 5份鹽酸，于溫度40°C攪拌反應2. 5h，再加入0. 6份鏈酶蛋白酶，于溫度 45°C攪拌反應他，然后調節溶液pH至6 ；加入0.2份過氧化氫滅酶活，然后以200目紗布進行過濾，將濾液于-60°C進行冷凍干燥^h，再粉碎至粒度0. 1 0. 2mm，獲得工業蛋白粉產品。其平均分子量為250kDa，氨基含量為0. IOmmol氨基/g蛋白粉，等電位為7. 2。實施例12將100份牛皮下腳料粉碎至粒度0. 1 0. 5mm,加入到800份水中，于溫度40°C浸泡池，加入3份硫酸銨，于溫度40°C攪拌反應4h，再加入0. 2份鏈蛋白酶K，于溫度40°C攪拌反應證，然后調節溶液pH至6. 6 ；加入0. 3份過氧化氫滅酶活，再以200目紗布進行過濾，將濾液于-60°C進行冷凍干燥36h，再粉碎至粒度0. 1 0. 2mm，獲得工業蛋白粉產品。 其平均分子量為280kDa，氨基含量為0. OSmmol氨基/g蛋白粉，等電位為7. 5。
權利要求
1.化學與酶協同水解制革下腳料生產工業蛋白粉的方法，其特征在于該方法包括以下步驟，并按重量份數計為(1)將100份制革下腳料粉碎到粒度0.1 0. 5mm,加入到400 800份水中，于溫度40 60°C浸泡0. 5 4. Oh,加入1 5份化學試劑，于溫度40 60°C攪拌反應0. 5 4. Oh,再加入0. 2 0. 8份蛋白酶，于溫度40 70°C攪拌反應2 6h，然后調節溶液pH至 6-8 ；(2)對步驟(1)反應后的物料進行酶滅活處理，然后過濾；(3)將步驟O)中濾液進行干燥，獲得工業蛋白粉產品；得到的產品分別為具有平均分子量1 5kDa，10 50kDa或100 300kDa的工業蛋白粉。
2.根據權利要求1所述化學與酶協同水解制革下腳料生產工業蛋白粉的方法，其特征在于所述制革下腳料為未經鉻鞣制的邊角余料，包括牛皮、羊皮和豬皮。
3.根據權利要求1所述化學與酶協同水解制革下腳料生產工業蛋白粉的方法，其特征在于所述化學試劑為氫氧化鈉、氫氧化鈣、碳酸鈉、碳酸氫鈉、硫酸銨、鹽酸或硫酸中的任一種。
4.根據權利要求1所述化學與酶協同水解制革下腳料生產工業蛋白粉的方法，其特征在于所述蛋白酶為1398蛋白酶、2709蛋白酶、Alcalase、菠蘿蛋白酶、胰蛋白酶、Neutral, 537蛋白酶、木瓜蛋白酶、無花果蛋白酶、蛋白酶K、鏈酶蛋白酶或胃蛋白酶中的任一種。
5.根據權利要求1所述化學與酶協同水解制革下腳料生產工業蛋白粉的方法，其特征在于所述酶滅活處理為在溫度100°C攪拌5 IOmin或加入0. 01 0. 5份過氧化氫在溫度30 60°C攪拌5 IOmin。
6.根據權利要求1所述化學與酶協同水解制革下腳料生產工業蛋白粉的方法，其特征在于所述干燥方式為噴霧干燥、熱風干燥或冷凍干燥中的任一種。
全文摘要
本發明公開了化學與酶協同水解制革下腳料生產工業蛋白粉的方法，其特點是該方法包括以下步驟步驟1)將100重量份制革下腳料粉碎到粒度0.1～0.5mm，加入到400～800重量份水中，于溫度40～60℃浸泡0.5～4.0h，加入1～5重量份化學試劑，于溫度40～60℃攪拌反應0.5～4.0h，再加入0.2～0.8重量份蛋白酶，于溫度40～70℃攪拌反應2～6h，然后調節溶液pH至6-8；2)對步驟1)反應后的物料進行酶滅活處理，酶滅活處理為在溫度100℃攪拌5～10min或加入0.01～0.5份過氧化氫在溫度30～60℃攪拌5～10min，然后過濾；3)將步驟2)中濾液進行干燥，獲得工業蛋白粉產品；得到的產品分別為具有平均分子量1～5kDa，10～50kDa或100～300kDa的工業蛋白粉。
文檔編號C12P21/06GK102321718SQ201110257618
公開日2012年1月18日 申請日期2011年9月2日 優先權日2011年9月2日
發明者崔敏, 廖學品, 張文華, 石碧, 遲原龍 申請人:四川大學