一種與藥源性肝損傷相關(guān)的微小核糖核酸標(biāo)志物及其檢測試劑盒的制作方法

專利名稱：一種與藥源性肝損傷相關(guān)的微小核糖核酸標(biāo)志物及其檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)和制藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種與藥源性肝損傷相關(guān)的血清/血漿微小核糖核酸標(biāo)志物及其檢測試劑盒在藥源性肝損傷的早期檢測，以及在藥物肝臟毒性安全性評價方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隨著各種新藥的廣泛應(yīng)用以及聯(lián)合用藥的增多，藥源性肝損傷(Drug-induced Liver Injury,DILI)已成了醫(yī)療衛(wèi)生工作者、制藥工業(yè)和藥品管理部門共同面對的重要問題。據(jù)報道，藥源性肝損害占藥物不良反應(yīng)10% _15%，臨床上實際發(fā)生的藥源性肝損傷的案例遠(yuǎn)較報道數(shù)要多。DILI是藥物從市場上撤回的最常見的原因。在過去的數(shù)年，由于具有較高的肝損傷發(fā)病率和死亡率，美國食品與藥品管理局已經(jīng)從市場上撤回了較多藥物， 包括溴芬酸、乙溴替丁、曲格列酮等，其他諸如氟烷、氯丙嗪、他克林等藥物均因為肝毒性而限制了其治療應(yīng)用。近年來，中草藥引發(fā)的肝損傷問題也受到越來越多的關(guān)注。臨床上報道的引發(fā)DILI的中草藥有黃藥子、雷公藤、千里光、復(fù)方制劑有壯骨關(guān)節(jié)丸、疳積散、小柴胡湯等。目前臨床上以及實驗室研究中所應(yīng)用的藥源性肝損傷診斷指標(biāo)為肝功能相關(guān)血液生物化學(xué)指標(biāo)。主要有谷丙轉(zhuǎn)氨酶(Alanine transaminase，ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶 (Aspartate transaminase, AST)、堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase, ALP)、總膽紅素 (Total bilirubin，TBIL)、直接膽紅素(Direct bilirubin，DBIL)、間接膽紅素(Indirect bilirubin, IBIL)、膽汁酸(Total bile acid, TBA)等指標(biāo)。然而即便是作為臨床診斷肝損傷金標(biāo)準(zhǔn)的血清ALT和/或AST也不能滿足藥源性肝損傷診斷的需要，其主要原因有三方面首先，存在檢測特異性的問題血清AST活性的增高與心肌和骨骼肌損傷相關(guān)；同時血清ALT活性也和肌肉壞死存在聯(lián)系。所以容易導(dǎo)致檢測值出現(xiàn)誤差。其次，包括ALT和 AST在內(nèi)的這一系列血液生物化學(xué)指標(biāo)對檢測樣本的保存要求較高，因為它們多為具有活性的蛋白質(zhì)，臨床樣本保存條件不當(dāng)或者保存時間過長常導(dǎo)致這些蛋白質(zhì)活性的喪失，檢測值也會隨之下降。最后，臨床診斷中，在觀測血清ALT和/或AST值的同時還會參考上述其他指標(biāo)，但其他指標(biāo)的敏感性和特異性遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到作為中藥藥源性肝損傷早期診斷標(biāo)志物的要求。所以，優(yōu)于或等同于血清ALT和/或AST值診斷價值的標(biāo)志物亟待開發(fā)。尋找在藥源性肝損傷早期診斷方面有指示作用的，同時能夠彌補(bǔ)現(xiàn)有標(biāo)志物缺陷的新型分子標(biāo)志物的研究和開發(fā)工作一直在不懈的探索中，目前已發(fā)現(xiàn)的新型分子標(biāo)志物的代表有蘋果酸脫氫酶(Malate dehydrogenase，MDH)，嘌呤核苷磷酸化酶(Purine nucleoside phosphorlyase，PNP)，對氧磷酶1 (Paraoxonase_l，P0Nl)等。然而，它們和臨床中正在使用的標(biāo)志物一樣，都是容易失去活性的蛋白質(zhì)，而且它們的檢測敏感性和特異性還有待進(jìn)一步考證，進(jìn)而限制了其臨床上的開發(fā)應(yīng)用。近年來，作為新的研究切入點，microRNA為癌癥的診斷與治療開辟了一條新途徑。microRNA,簡稱miRNA，是一類由動物、植物和病毒基因組所編碼的長約19-23個核苷酸的小分子單鏈RNA，它們不具有開放閱讀框，不編碼蛋白質(zhì)，但卻參與機(jī)體的各種重要的生理和病理過程。miRNA廣泛存在于血清、血漿、唾液、痰、尿液、乳汁、羊水、精液、胸腹水、腦脊液、汗液等各種各樣的體液中，其特異性的表達(dá)譜可以作為識別多種疾病的生物標(biāo)志物， 應(yīng)用前景廣闊。而所有這些標(biāo)志物之中，最引人矚目的、應(yīng)用潛力最大的自然是血清/血漿miRNA在癌癥的診斷中的應(yīng)用。血清/血漿miRNA作為腫瘤標(biāo)志物的優(yōu)越性在于(1) 已有的對正常人和不同癌癥病人的血清/血漿miRNA的檢測結(jié)果表明，miRNA分子廣泛存在于正常人和不同癌癥病人的血清/血漿中，并且隨著生理狀況、腫瘤的種類和病程的不同，miRNA分子在血清/血漿中存在的種類和數(shù)量將發(fā)生顯著變化，該結(jié)果提示血清/血漿 miRNA作為癌癥診斷和預(yù)后的標(biāo)志物具有靈敏度高、特異性好的特點，可改進(jìn)癌癥診斷、分類、預(yù)后估計、療效預(yù)測的精度；(2)血清/血漿miRNA是一種新型生物標(biāo)志物，區(qū)別于傳統(tǒng)生物標(biāo)志物，不僅穩(wěn)定、微創(chuàng)、易于檢測，而且定量精確，該類小分子RNA生物標(biāo)志物的成功開發(fā)是對以蛋白為主的傳統(tǒng)生物標(biāo)志物的改進(jìn)，將為癌癥的防治開創(chuàng)全新局面；(3)血清/血漿miRNA監(jiān)測系統(tǒng)是一種實時、全面的診斷方法，能夠明確癌癥進(jìn)展情況，全面的反映患者的疾病狀態(tài)，避免既往繁雜檢測，節(jié)約了成本和時間，為臨床醫(yī)生快速準(zhǔn)確的掌握患者病情、及時采取個性化的防治方案提供支持；(4)血清/血漿miRNA指紋圖譜的篩選采用嚴(yán)密、多階段的驗證和評價體系，規(guī)范化的程序和策略的應(yīng)用保證了血清/ 血漿miRNA生物標(biāo)志物在臨床上應(yīng)用的準(zhǔn)確性，也為包括藥源性肝損傷在內(nèi)的其他疾病生物標(biāo)志物的研制提供方法和策略上的借鑒。目前，已有研究表明miRNA和肝臟疾病也存在著千絲萬縷的聯(lián)系。在肝細(xì)胞性肝癌的研究中發(fā)現(xiàn)miR-122、miR-21、miR-195、miR-18、miR-199a等的異常表達(dá)與之有關(guān)；在肝纖維化研究中發(fā)現(xiàn)miR-29、miR-15b、miR-16均與其相關(guān)。miRNA作為生物標(biāo)志物的研究也隨之涌現(xiàn)。已有研究證明血清miR-21、miR-122、miR-223、miR-25、miR-375和let_7f是肝細(xì)胞性肝癌和慢性肝炎的新型標(biāo)志物；血漿miR-122可以作為病毒性、酒精性和化學(xué)性肝臟疾病的標(biāo)志物；血漿miR-885-5p也是具有潛力的指征肝臟疾病進(jìn)展的標(biāo)志物；在小鼠對乙酰氨基酚肝損傷模型中發(fā)現(xiàn)一些在血清中高表達(dá)的miRNA，如miR-122在小鼠血清中持續(xù)高表達(dá)，這些血清中的miRNA在肝損傷早期就可以檢測出來。將上述miRNA開發(fā)為肝臟疾病的的診斷標(biāo)志物，還有待進(jìn)一步深入研究。然而miR-122在各種肝臟疾病的血清中都高表達(dá)，為了區(qū)分不同的肝臟疾病，同時開發(fā)出多個針對特定肝臟疾病的miRNA將起到良好的區(qū)分作用。目前尚未有檢測血液標(biāo)本的藥源性肝損傷特異性miRNA標(biāo)志物組合及其檢測試劑盒的報道。本發(fā)明致力于研究并開發(fā)出基于血液miRNA的藥源性肝損傷早期檢測新型分子標(biāo)志物，其成果有潛力應(yīng)用到臨床前實驗室以及全國各級醫(yī)院的臨床診斷，為千千萬萬的患者帶來福音；同時也為制藥工業(yè)和藥品管理部門在新藥開發(fā)過程中肝臟毒性的安全性評價提供有力參考依據(jù)，最大限度地提高新藥肝臟毒性的檢出率，更好地實現(xiàn)早期評價、早期淘汰的目標(biāo)，將會產(chǎn)生巨大的社會經(jīng)濟(jì)效益。

發(fā)明內(nèi)容
目前，在DILI檢測與藥物肝臟毒性安全性評價研究領(lǐng)域中，相關(guān)的標(biāo)志物僅僅局限于血液生化學(xué)的各種蛋白類指標(biāo)，尚未有關(guān)于血清/血漿miRNA應(yīng)用于DILI檢測和與藥物肝臟毒性安全性評價的相關(guān)報道。基于血清/血漿miRNA已為癌癥的診斷開辟了一條新途徑，以及為了克服傳統(tǒng)的以及開發(fā)中的用于DILI檢測的蛋白類標(biāo)志物的上述缺陷，尋找一種具有DILI特異性、敏感性、非侵入性和穩(wěn)定性的新型標(biāo)志物，本發(fā)明將研究切入點瞄準(zhǔn)向具有重大應(yīng)用前景的外周血液中的miRNA。本發(fā)明通過平行建立具有典型肝臟毒性的化學(xué)類藥物(對乙酰氨基酚)和中草藥 (黃藥子)所致的肝損傷大鼠的動物模型，分離和研究正常大鼠、對乙酰氨基酚所致DILI大鼠和黃藥子所致DILI大鼠的血清和肝臟組織中的miRNA，尋找一類可用于DILI早期檢測的DILI特異性的血清/血漿miRNA。并研制出便于臨床應(yīng)用與藥物肝臟毒性安全性評價的 DILI早期檢測試劑盒，為DILI早期檢測和篩查提供參考依據(jù)。本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題包括(1)提供DILI相關(guān)的血清/血漿miRNA標(biāo)志物組合；(2)提供檢測DILI相關(guān)的血清/血漿miRNA標(biāo)志物組合的探針/引物組合；(3)提供 DILI檢測試劑盒和相應(yīng)試劑。本發(fā)明采取以下技術(shù)方案來解決上述技術(shù)問題。一種DILI相關(guān)的血清/血漿miRNA標(biāo)志物組合miR_101a、miR-101b、 miR-1188-5p, miR-122, miR-183, miR-183*. miR-187, miR-192, miR-193, miR-200a, miR-200c*> miR-214> miR-22*> miR-292-3p> miR-322> miR-323> miR-327> miR-33*> miR-342-3p、miR-380、miR-455*、miR-543*和miR-878，所述標(biāo)志物組合包括以上在血清 /血漿中穩(wěn)定存在且可檢測的miRNA成熟體中的一種或一種以上，例如2、3、4、5、6、7、8、9、 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22 或 23 種。優(yōu)選地，所述標(biāo)志物組合為包括以下在血清/血漿中穩(wěn)定存在且可檢測的miRNA 成熟體中的任意一種或多種miR-122、miR-192和miR-193。所述血清/血漿miRNA標(biāo)志物組合在制備DILI檢測試劑盒中的應(yīng)用。所述血清/血漿miRNA標(biāo)志物組合的探針，這些探針為miR-122的探針是SEQ ID No. 1 ；miR-192 的探針是 SEQ ID No. 2 ；miR-193 的探針是 SEQ ID No. 3 (見表 1)。上述任意一種或多種血清/血漿miRNA標(biāo)志物的探針在制備DILI檢測試劑盒中的應(yīng)用。所述血清/血漿miRNA標(biāo)志物組合的引物，這些引物為miR_122引物是SEQ ID No. 4 和 SEQ ID No. 5 ;miR-192 引物是 SEQ ID No. 6 和 SEQ ID No. 7 ;miR_193 引物是 SEQ ID No. 8 和 SEQ ID No. 9 (見表 2)。上述任意一對或多對血清/血漿miRNA標(biāo)志物的引物在制備DILI檢測試劑盒中的應(yīng)用。一種DILI檢測試劑盒，該試劑盒包含血清/血漿微小核糖核酸中miR-122、 miR-192和miR-193的探針/引物組合。所述檢測試劑盒，該試劑盒包含下列任意一種或多種探針/引物組合miR_122 的探針是 SEQ ID No. 1 ；miR-192 的探針是 SEQ ID No. 2 ；miR-193 的探針是 SEQ ID No. 3 ； miR-122 的引物是 SEQ ID No. 4 和 SEQID No. 5 ；miR-192 的引物是 SEQ ID No. 6 和 SEQ ID No. 7 ；miR-193 的引物是 SEQ ID No. 8 和 SEQ ID No. 9 (見表 1 和表 2)。所述檢測試劑盒，該試劑盒還可以包括PCR反應(yīng)常用試劑，如逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq酶、緩沖液、dNTPs,MgCl2和DEPC H2O等；還可以包括標(biāo)準(zhǔn)品和/或?qū)φ掌?見

圖1)。表1 標(biāo)志物的探針序列
權(quán)利要求
1.一種與藥源性肝損傷相關(guān)的血清/血漿微小核糖核酸標(biāo)志物組合，其特征在于該標(biāo)志物組合包括以下微小核糖核酸中的一種或多種miR-122、miR-192和miR-193。
2.權(quán)利要求1所述標(biāo)志物組合在制備藥源性肝損傷檢測試劑盒中的應(yīng)用。
3.一種用于檢測權(quán)利要求1所述標(biāo)志物的探針組合，其特征在于該探針組合包括以下探針中的一種或多種:miR-122的探針是SEQ ID No. 1 ；miR-192的探針是SEQ ID No. 2 ； miR-193 的探針是 SEQ ID No. 3。
4.權(quán)利要求3所述探針組合在制備藥源性肝損傷檢測試劑盒中的應(yīng)用。
5.一種用于檢測權(quán)利要求1所述標(biāo)志物的引物組合，其特征在于該引物組合包括以下引物中的一對或多對miR-122的引物是SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 5 ;miR_192的引物是 SEQ ID No. 6 和 SEQ ID No. 7 ；miR-193 的引物是 SEQ ID No. 8 和 SEQ ID No. 9。
6.權(quán)利要求5所述引物組合在制備藥源性肝損傷檢測試劑盒中的應(yīng)用。
7.一種藥源性肝損傷檢測試劑盒，其特征在于該試劑盒包括血清/血漿微小核糖核酸中miR-122、miR-192和miR-193的探針/引物組合。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述檢測試劑盒，其特征在于該試劑盒含有權(quán)利要求3所述的探針組合和/或權(quán)利要求5所述的引物組合。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述檢測試劑盒，其特征在于該試劑盒還可以包括PCR技術(shù)的常規(guī)試劑、標(biāo)準(zhǔn)品和域?qū)φ掌贰?br> 全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)和制藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種與藥源性肝損傷相關(guān)的血清/血漿微小核糖核酸標(biāo)志物及其檢測試劑盒在藥源性肝損傷的早期檢測，以及在藥物肝臟毒性安全性評價等方面的應(yīng)用。該標(biāo)志物為miR-122、miR-192和miR-193中的一種或多種，其檢測試劑盒有助于藥源性肝損傷的早期發(fā)現(xiàn)，比傳統(tǒng)血液生化學(xué)指標(biāo)更具有早期敏感性，有潛力應(yīng)用到臨床前實驗室以及全國各級醫(yī)院的臨床診斷，同時也為新藥開發(fā)過程中的肝臟毒性安全性評價提供有力參考依據(jù)，更大限度地提高藥物肝臟毒性的檢出率。
文檔編號C12Q1/68GK102433375SQ20111025601
公開日2012年5月2日 申請日期2011年9月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月1日
發(fā)明者張辰宇, 張陸勇, 江振洲, 蘇鈺文, 陳熹 申請人:中國藥科大學(xué)