專利名稱：三角褐指藻的雙層平板固體培養方法
技術領域：
本發明涉及三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum, PT)的培養，尤其是涉及一種三角褐指藻的雙層平板固體培養方法，以獲得三角褐指藻的固體藻平板。
背景技術：
溶藻微生物，諸如溶藻的細菌、放線菌、病毒、真菌和原生動物的不斷發現，為赤潮的微生物防治開拓了廣闊的前景，而溶藻微生物的分離是赤潮微生物防治的基礎。溶藻微生物的分離和篩選通常有兩種途徑一種是通過液體感染的方式，另一種是通過固體感染的方式。液體感染的方法是通過監測藻的生長是否受抑制來判斷體系中是否存在溶藻微生物，包括用普通光學顯微鏡觀察藻細胞是否發生裂解(l.Takao，Y.， K. Nagasaki, K. Mise, Τ.Okuno, D. Honda, Isolation and characterization of a novel single-stranded RNA virus infectious to a marine fungoid protist，Schizochytrium sp(Thraustochytriaceae, labyrinthulea). Applied and Environmental Microbiology, 2005. 71 (8) :4516-4522.)，或通過肉眼觀察藻液顏色是否發生變化(2. Tomaru, Y.，Y. Shirai, H. Suzuki, Τ. Nagumo, K. Nagasaki, Isolation and characterization of a new single-stranded DNA virus infecting the cosmopolitan marine diatom Chaetoceros dehilis. Aquatic Microbial Ecology,2008. 50(2) :103-112 ；3. Imamura, N.，I. Motoike, N. Shimada, Μ. Nishikori, H. Morisaki, H. Fukami, An efficient screening approach for anti-Microcystis compounds based on knowledge of aquatic microbial ecosystem. Journal of Antibiotics，2001. 54(7) :582-587.)，或檢測藻熒光值是否下降(4. Bettarel, Y.，J.Kan，K. Wang, K. Ε. Williamson, S. Cooney, S. Ribblett, F. Chen, K. Ε. Wommack, D. W. Coats, Isolation and preliminary characterisation of a small nuclear inclusion virus infecting the diatom Chaetoceros cf.gracilis. Aquatic Microbial Ecology, 2005. 40(2) :103-114 ；5. Su, J. Q. ， X. R. Yang, T. L. Zheng, Y. Tian, N. Z. Jiao,L. Z. Cai,H. S. Hong, Isolation and characterization of a marine algicidal bacterium against the toxic dinoflagellate Alexandrium tamarense. Harmful Algae, 2007. 6 (6) :799-810.)，來判斷是否存在溶藻微生物，該方法適用于各種大小的藻類溶藻微生物的分離和篩選。但該方法存在很多缺點例如，有時需要每天通過顯微鏡觀察對照組和處理組的藻細胞是否裂解，工作量大，且有些藻類的細胞較小在光學顯微鏡下不容易判斷是否裂解；有時一些非生物因素也會導致藻細胞裂解或生長受抑制，易產生假陽性結果；有時雖然體系中存在溶藻微生物但并不能明顯的抑制藻的生長，易產生假陰性結果。固體感染的方法是通過肉眼觀察藻平板上是否出現空斑來判斷體系中是否存在溶藻微生物(6. Bellec, L，N. Grimsley, Y. Desdevises, Isolation of Prasinoviruses of the Green Unicellular Algae Ostreococcus spp. on a Worldwide Geographical Scale. Applied and Environmental Microbiology,2010.76 (1) :96-101 ；7. Kim, J. D.， J. Y. Kim, J.K.Park,C. G. Lee,Selective Control of the Prorocentrum minimum HarmfulAlgal Blooms by a Novel Algal-Lytic Bacterium Pseudoalteromonas haloplanktis AFMB-008041. Marine Biotechnology, 2009. 11(4) :463-472.)，僅適合能在固體培養基上生長的藻類的溶藻微生物的分離和篩選，但其相對液體感染的方法更簡單、直觀。
發明內容
本發明的目的是提供一種三角褐指藻的雙層平板固體培養方法。本發明所述三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum, PT)的雙層平板固體培養方法，包括以下步驟1)將f/2培養基倒入平板中，自然凝固，用作下層培養基；2)將f/2培養基裝入離心管中，自然凝固，使用時將其煮沸融化，用作上層培養基；3)取生長至對數期的三角褐指藻藻液10 20mL，離心，棄上清，f/2培養基重懸藻細胞，得濃縮藻液；4)將步驟幻所得上層培養基倒入步驟幻所得的濃縮藻液中，再鋪于步驟1)所得的下層培養基上，自然凝固；5)將平板倒置，光照下培養。 在步驟1)中，所述f/2培養基的量可為20mL，所述f/2培養基含1 %瓊脂，所述平板可采用直徑為9cm平板。在步驟2)中，所述f/2培養基的量可為3. 5mL，所述f/2培養基含0. 7%瓊脂，所述離心管可為IOmL離心管；所述使用時將其煮沸融化并置于50°C水浴。在步驟3)中，所述三角褐指藻藻液的藻密度可為3\106 10\106沈118/!^，所述離心可6000rpm離心5min ；所述f/2培養基重懸藻細胞，可用ImL f/2培養基重懸藻細胞。在步驟4)中，所述上層培養基的溫度可為50°C。在步驟5)中，所述光照下培養可于20°C光照下培養。所述三角褐指藻的雙層平板固體培養方法可應用于三角褐指藻溶藻微生物的分離。所述三角褐指藻的雙層平板固體培養方法可應用于三角褐指藻溶藻微生物的溶藻活性檢測。用于制備三角褐指藻雙層平板的最適藻量范圍可為10 20mL。本發明涉及的目標藻三角褐指藻，是一種細胞相對比較小的單細胞藻類，具有卵形、梭形和三出放射形三種不同的形態，這三種形態在不同的環境條件下可以轉變。如在正常的液體培養的條件下，多是三出放射形細胞和少量的梭形細胞，這兩種形態都沒有硅質的細胞壁。三出放射形細胞長度約為10 18μπι(兩臂間垂直距離)，梭形細胞長22μπι， 中部寬5 μ m，兩臂末端較鈍，卵形細胞長8 μ m，寬3 μ m，有一個硅質殼面，缺少另一個殼面。 生長至對數期的三角褐指藻藻液(按10 %接種，培養2周后的新鮮藻液，藻密度為3 X IO6 10X106cells/mL)濃縮10 20倍后與上層培養基混合倒平板，可直接用于后續實驗；制備較高藻含量的雙層平板會加大工作量，且平板上藻之間的營養競爭和空間競爭壓力大，不利于實驗；而較低濃度的藻在平板上不能生長，或者需要較長時間才能達到實驗需要的藻密度，但這時的藻已經不新鮮，不適合用于實驗。
圖1為含藻量40mL的三角褐指藻雙層平板。圖2為含藻量30mL的三角褐指藻雙層平板。圖3為含藻量20mL的三角褐指藻雙層平板。圖4為含藻量IOmL的三角褐指藻雙層平板。圖5為含藻量5mL的三角褐指藻雙層平板。圖6為不含三角褐指藻的雙層平板空白對照。圖7為溶藻微生物裂解三角褐指藻形成的空斑結果。圖8為雙層平板-最大可能數法檢測溶藻微生物活性的結果。
具體實施例方式本發明的三角褐指藻雙層平板參見圖1 5，它們分別為401^、301^、201^、101^和 5mL對數期的藻液(藻密度5.0X106cellS/mL)濃縮至ImL后制備的雙層平板的結果。圖 1和圖2藻平板呈較深的黃褐色，含藻量大，需要用IOmL離心管進行多次離心，操作較繁瑣； 圖3和圖4藻平板呈淡黃褐色，用肉眼能清楚的觀察藻的生長狀況，且藻量適中，用IOmL離心管離心1至2次即可；圖5藻平板的顏色太淡，用肉眼較難觀察藻的生長狀況，且由于含藻量太低，藻的生長狀況不穩定，有時藻甚至會死掉，因此不適合用于后續實驗。三角褐指藻可以在雙層平板上存活1個多月(隨著時間延長，平板變干，藻就死亡了)。溶藻微生物裂解三角褐指藻形成的空斑見圖7，在圖7中，A代表藻，P代表空斑， 結果說明通過雙層平板固體感染法可以成功的分離到三角褐指藻的溶藻微生物。利用雙層平板-最大可能數法檢測溶藻微生物活性，結果見圖8，黑點為滴加溶藻微生物的位置，可以看到培養2周后有些藍點位置出現了空斑，即呈陽性，記錄陽性的稀釋度和相應的重復數，查最大可能數表，得出溶藻微生物的濃度為4600CellS/mL。這里注意要用新鮮制備的藻平板O天之內)，否則實驗結果會不太好。實驗結果表明可以利用固體雙層平板培養三角褐指藻，并通過雙層平板固體感染法成功的分離到三角褐指藻的溶藻微生物，且可以用藻雙層平板檢測三角褐指藻溶藻微生物的活性。本發明涉及雙層培養基，它們由f/2藻培養基添加一定比例的瓊脂配制而成，下層培養基較厚，瓊脂濃度較高，為藻的生長提供營養和基質，上層培養基為薄薄的一層，瓊脂濃度較低，藻在這層培養基中生長。以下具體實施例是對本發明的進一步說明，但本發明不限于下述實施例。實施例1 用于制備三角褐指藻雙層平板的藻量確定(l)20mL f/2培養基(含瓊脂)倒平板(直徑為9cm)，自然凝固，用作下層培
養基；(2)3. 5mL f/2培養基(含0.7%瓊脂)裝到IOmL離心管中，自然凝固，使用時將其煮沸融化，并置于50°C水浴，用作上層培養基；(3)取生長至對數期的三角褐指藻藻液(藻密度5.0XlO6ceIlsAiL) 5 40mL， 6000rpm離心5min，棄去上清，用ImL f/2培養基重懸藻細胞；
(4)將50°C的上層培養基倒入上述濃縮的藻液中，迅速混勻并均勻地鋪于下層培養基上，自然凝固，ImL f/2培養基與上層培養基倒平板作為空白對照；(5)將平板倒置，于20°C光照下培養；(6)用于制備三角褐指藻雙層平板的最適藻量范圍10 20mL。含不同藻量的雙層平板見圖1 6。實施例2 利用雙層平板法分離三角褐指藻的溶藻微生物(1)采集廈門海域表層海水，保存于4°C，立即用于溶藻微生物的分離；(2)20mL f/2培養基(含瓊脂)倒平板(直徑為9em)，自然凝固，用作下層培
養基；(3)3. 5mL f/2培養基(含0.7%瓊脂)裝到IOmL離心管中，自然凝固，使用時將其煮沸融化，并置于50°C水浴，用作上層培養基；(4)取生長至對數期的三角褐指藻藻液(藻密度6. 0 X 106cells/mL) IOmL, 6000rpm離心5min，棄去上清，ImL海水樣品重懸藻細胞，做3個重復；(5)將50°C的上層培養基倒入上述濃縮的藻液中，迅速混勻并均勻地鋪于下層培養基上，自然凝固；(6)將平板倒置，于20°C光照下培養2周，觀察藻板上是否出現空斑；(7)實驗結果見圖7。實施例3 雙層平板-最大可能數法檢測溶藻微生物活性(l)20mL f/2培養基(含瓊脂)倒平板(直徑為9em)，自然凝固，用作下層培
養基；(2)3. 5mL f/2培養基(含0.7%瓊脂)裝到IOmL離心管中，自然凝固，使用時將其煮沸融化，并置于50°C水浴，用作上層培養基；(3)取生長至對數期的三角褐指藻藻液(藻密度4. 8XlO6ceIlsAiL) 10mL， 6000rpm離心5min，棄去上清，ImL f/2培養基重懸藻細胞；(4)將50°C的上層培養基倒入上述濃縮的藻液中，迅速混勻并均勻地鋪于下層培養基上，自然凝固；(5)溶藻微生物樣品用f/2培養基稀釋10倍和100倍，分別取10 μ L原液和稀釋液滴于藻平板上，每個濃度3個重復，待液體被藻平板吸收后，將平板倒置，于20°C光照培養2周；(6) 2周后，記錄出現空斑的稀釋度及相應的重復數，查最大可能數表，得出溶藻微生物的濃度為4600cells/mL。結果見圖8。
權利要求
1.三角褐指藻的雙層平板固體培養方法，其特征在于包括以下步驟1)將f/2培養基倒入平板中，自然凝固，用作下層培養基；2)將f/2培養基裝入離心管中，自然凝固，使用時將其煮沸融化，用作上層培養基；3)取生長至對數期的三角褐指藻藻液10 20mL，離心，棄上清，f/2培養基重懸藻細胞，得濃縮藻液；4)將步驟幻所得上層培養基倒入步驟幻所得的濃縮藻液中，再鋪于步驟1)所得的下層培養基上，自然凝固；5)將平板倒置，光照下培養。
2.如權利要求1所述的三角褐指藻的雙層平板固體培養方法，其特征在于在步驟1) 中，所述f72培養基的量為20mL。
3.如權利要求1或2所述的三角褐指藻的雙層平板固體培養方法，其特征在于在步驟1)中，所述f/2培養基含瓊脂。
4.如權利要求1所述的三角褐指藻的雙層平板固體培養方法，其特征在于在步驟1) 中，所述平板采用直徑為9cm平板。
5.如權利要求1所述的三角褐指藻的雙層平板固體培養方法，其特征在于在步驟2) 中，所述f/2培養基的量為3. 5mL。
6.如權利要求1或5所述的三角褐指藻的雙層平板固體培養方法，其特征在于在步驟2)中，所述f/2培養基含0.7%瓊脂。
7.如權利要求1所述的三角褐指藻的雙層平板固體培養方法，其特征在于在步驟2) 中，所述使用時將其煮沸融化并置于50°C水浴。
8.如權利要求1所述的三角褐指藻的雙層平板固體培養方法，其特征在于在步驟3) 中，所述三角褐指藻藻液的藻密度為3 X IO6 10 X 106cells/mL,所述離心是6000rpm離心 5min ；所述f72培養基重懸藻細胞，是用ImL f/2培養基重懸藻細胞。
9.如權利要求1所述的三角褐指藻的雙層平板固體培養方法，其特征在于在步驟4) 中，所述上層培養基的溫度為50°C。
10.如權利要求1所述的三角褐指藻的雙層平板固體培養方法，其特征在于在步驟5) 中，所述光照下培養于20°C光照下培養。
全文摘要
三角褐指藻的雙層平板固體培養方法，涉及三角褐指藻的培養。將f/2培養基倒入平板中，自然凝固，用作下層培養基；將f/2培養基裝入離心管中，自然凝固，使用時將其煮沸融化，用作上層培養基；取生長至對數期的三角褐指藻藻液10～20mL，離心，棄上清，f/2培養基重懸藻細胞，得濃縮藻液；將所得上層培養基倒入濃縮藻液中，再鋪于下層培養基上，自然凝固；將平板倒置，光照下培養。
文檔編號C12R1/89GK102296031SQ20111025068
公開日2011年12月28日 申請日期2011年8月29日 優先權日2011年8月29日
發明者張幫周, 鄭天凌, 鄭小偉, 黃麗萍 申請人:廈門大學