專利名稱：與植物抗蚜蟲能力相關的蛋白及其編碼基因與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及與植物抗蚜蟲能力相關的蛋白及其編碼基因與應用。
背景技術：
蚜蟲為同翅目蚜科，是一種破壞力極強的農業害蟲，它的特點為個頭小，身子軟，繁殖能力特強，多寄主，能進行孤雌生殖和有性生殖。由于蚜蟲具有適應能力強，食譜廣，繁殖率極強等特點，如何有效地對它進行有效防治成為許多科學工作者多年來一直致力研究的難題。植物基因工程的發展為蚜蟲防治開辟了新的途徑。目前研究者已克隆得到了多個與抗蚜相關的基因。從抗蚜蟲廣譜性上來分，這些基因主要分為兩類一個是特異性抗蟲牙基因如Nr基因(Nasonovia ribisnigr):該基因從一種野生型的萵苣中獲得,只針對Nasonovia ribisnigr (屬于姆蟲的一個種)起作用；Vat基因法國的一個研究小組從朝鮮的一個甜瓜品種中發現的，該基因可抑制蚜蟲在植物器官上繁殖，又可以防止蚜蟲傳播病毒；sdl基因只針對于蘋果紅圓尾姆(Dysaphis devecta)生物I型和II型起作用，目前該基因已經被繪制了精密的物理圖譜，為克隆該基因奠定了基礎；Mi_l，2基因該基因來源于茄科植物番茄中，全長14. 7kb，編碼由1257個氨基酸組成的蛋白，該基因屬于nucleotide-binding leucine rich repeat (NBLRR)家族，即富含亮氨酸的核苷酸結合家族，后來Rossi等(1998)進行了進一步研究，發現其位于番茄的第6號染色體上，并且該基因具有高度的種屬特異性，對轉該基因的馬鈴薯分析發現，轉基因馬鈴薯只對Wu3型的蚜蟲起作用，將該基因轉入茄子發現，轉基因茄子只針對于線蟲起作用，而對蚜蟲不起作用(Rossi, Μ. , Goggin, F. L. , Milligan, S. B. ,Kaloshian, I. ,UlIman,D.Ε.,and Williamson,V. Μ. , The nematode resistance gene Mi of tomato confers resistance against thepotato aphid. Proc Natl Acad Sci U S A 1998.95 :9750-9754)。另一種是廣譜性的抗蚜基因如細胞分裂素基因=Smigocki等(1993)將細胞分裂素基因ipt (異戊烯基轉移酶細胞分裂素合成的關鍵酶)基因轉化煙草，發現陽性植株能夠抑制綠桃姆(Myzuspersicae)的發育，經后續試驗證發現是植物激素的過量表達從而干擾了昆蟲正常的生理代謝而使桃蟲牙的發育受到抑制(Smigocki, A.，Neal, J. ff.，Jr.，McCanna, I.，and Douglass, L.，Cytokinin-mediated insect resistance in Nicotiana plants transformed with theipt gene. Plant Mol Biol 1993. 23 =325-335);蛋白酶抑制劑基因由于同翅目昆蟲體內缺乏蛋白酶，因而目前常見的蛋白酶抑制劑基因抑制蚜蟲的效果，但是一些小的蛋白酶抑制齊U，如胃蛋白酶抑制劑(pepstain)和抑糜酶素(chymostain)對蟲牙蟲有致死作用；凝集素基因具有對多種單糖和寡聚糖專一性結合的能力，因而使這類基因在抗蚜基因工程育種方面具有很大的潛力，該基因也是迄今為止研究最為深入、廣泛的抑制蚜蟲發育、繁殖比較明顯的基因(郭洪年，侯漢娜，歐陽青，吳家和，抗蚜基因及其轉基因植物.中國生物工程雜志 2008. 28 :118-124)。植物凝集素是一種存在于許多植物的種子和營養器官中具有一個或多個能夠與單糖或寡聚糖特異可逆結合的非免疫蛋白。到目前為止，已對雪花蓮、石蒜(Zhao，X.，Yao，J., Sun,X. , and Tang,K. ,Molecular cloning and characterization of a novel lectingene from Lycoris radiata. DNA Seq 2003. 14 :223-226)、觀音蓮、紅豆杉、掌葉半夏、小麥、扁豆等植物凝集素基因進行了克隆、序列及功能分析。按照植物凝集素亞基結構特征的不同，將其分為四種類型部分凝集素(merolectins):部分凝集素是具有單一的糖結合結構域的一種小分子蛋白，它不具有凝集細胞或沉淀糖綴合物的能力。目前發現僅有很少的凝集素屬于該類型，如克隆自橡膠樹的幾丁質結合橡膠素和蘭科的單子葉甘露糖結合凝集素；全凝集素(hololectins)全凝集素是至少具有兩個糖結合結構域的一種植物蛋白，這些糖結合結構域相同或高度同源，該類型的凝集素具有凝集細胞或沉淀糖綴合物的能力，目前發現的大部分植物凝集素屬于該類型，如抗蚜效果明顯的單子葉甘露糖凝集素就屬于該類；嵌合凝集素(chimerolectins):嵌合凝集素是具有至少一個單一糖結合結構域和另一種結構域組成的一種融合蛋白質，后一結構域一般具有催化等生物活性，該區域功能的發揮 與糖結合結構域結合糖功能的發揮是相對獨立的，兩個功能域功能的發揮互不影響；超凝集素(superlectins):超凝集素是由兩個在結構和糖結合種類上都不一樣的糖結合結構域組成的融合蛋白，兩個糖結合結構域相互獨立，超凝集素也可看做一類特殊的嵌合凝集素。按照氨基酸序列相似性及其在進化上關系的不同，可將其分為7個家族豆科凝集素家族、木菠蘿素家族、葫蘆科韌皮部凝集素、莧科凝集素、幾丁質結合凝集素家族、單子葉甘露糖結合凝集素和II型核糖體失活蛋白。目前用于抗蚜蟲研究的主要是單子葉植物甘露糖結合的凝集素，對于單子葉植物甘露糖特異結合的植物凝集素，利用基于結構注解的序列分析可以看到，它們的同源性非常高。它們形成了一個共同的識別糖環的不連續表位，即Gln-X-Asp-X-Asn-X-X-X-Tyr (QDNY結構域)，該區域為凝集素作用位點。凝集素在植物的防御體系中起著非常重要的地位，目前已經有多種證據證明了凝集素在植物保護方面起到的地位，一個重要的證據即是植物凝集素具有單糖或寡聚糖特異可逆結合的能力，尤其是對于在植物中不常見或壓根不存在的寡糖具有更高的親和性(Lam, S.K. , and Ng, Τ.B. , Lectins !production and practical applications. ApplMicrobiol Biotechnol 2011.89:45-55)。例如，幾丁質結合凝集素能夠識別并結合真菌細胞壁成分中的幾丁質或無脊椎動物外骨骼成分中的寡糖，從而防止真菌對植物的感染或害蟲對植物的蠶食；另外植物凝集素的保護作用可以從提取的植物蛋白人工飼喂蚜蟲及轉凝集素基因的植物具有良好的抗蚜蟲效果方面得到了充分的證明，下面幾個直接證據進一步說明植物凝集素的防御作用(1)植物凝集素的抗細菌活性。豆科凝集素中的幾種同細菌肽聚糖的組成成分N-乙酰氨基葡糖，N-乙酰胞壁酸及胞壁酰二肽能強烈作用，防止細菌對植物的侵害。(2)植物凝集素抗真菌性。幾丁質結合凝集素可結合真菌細胞壁，體外研究表明麥胚凝集素可抑制某些真菌孢子的出芽及綠色木霉菌的生長，蕁麻凝集素可以通過牽連真菌的內生菌絲從而控制核糖體的定位，繼而導致菌體結構形態發生改變，并且Chrispeels (1991)通過研究表明蕁麻凝集素具有抑制灰霉病菌生長的作用(Chrispeels,M. J.，and Raikhelb, N. V.，Lectins，Lectin Genes，and Their Role in Plant Defense.The Plant Cell 1991.3:1-9)。(3)植物凝集素對高等動物抗性。II型核糖體失活蛋白對所有真核生物具有普遍毒性。原則上，II型核糖體失活蛋白到達胞質后對所有真核生物有極毒性，II型核糖體失活蛋白由A鏈和B鏈組成，B鏈可以結合到細胞的受體上，然后促進A鏈的進入，A鏈能夠切割核糖體RNA的單一腺苷殘基，最后核糖體的失活，因此，該蛋白可保護植物免受動物或昆蟲的蠶食。(4)植物凝集素對昆蟲的抗性作用。某些凝集素可以識別并結合到昆蟲消化道上皮細胞的糖蛋白上，從而對昆蟲產生局部或系統的影響，繼而對昆蟲的生長繁殖產生抑制作用，使昆蟲的蟲口密度下降，例如單子葉甘露糖凝集素對蚜蟲的抗性；而且某些凝集素(如Mi-L 2基因)表現出了抗植物病原性線蟲活性。(5)植物凝集素的抗病毒性。很多單子葉甘露糖凝集素對動物(包括人類)的反轉錄病毒具有有效的抑制作用，如蘭科植物單子葉甘露糖凝集素可抑制HIV靶細胞的結合過程；許多凝集素具有間接防治病毒作用，例如，單子葉甘露糖凝集素防治蚜蟲從而防止病毒的傳播；并且II型核糖體失活蛋白具有對植物病毒的抑制活性，但其機理正在進一步研究之中。
發明內容
本發明的一個目的是提供與植物抗蚜蟲能力相關的蛋白及其編碼基因。本發明所提供的與植物抗蚜蟲能力相關的蛋白，名稱為AmLec，來源于海芋 (Alocasia macrorrhiza),是如下(a)或(b)的蛋白質(a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列表中序列I的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗蚜蟲相關的由(a)衍生的蛋白質。序列表中的序列I由270個氨基酸殘基組成。所述與植物抗蚜蟲能力相關蛋白的編碼基因也屬于本發明的保護范圍。所述與植物抗蚜蟲能力相關蛋白的編碼基因為如下1)-4)中任一所述的基因I)序列表中序列2自5'末端起第39位-第851位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中序列2所示的DNA分子；3)在嚴格條件下與I)或2)所示的DNA分子雜交且編碼所述蛋白的基因；4)與I)或2)或3)的基因具有90%以上的同源性且編碼所述蛋白的基因。上述嚴格條件可為用6XSSC，0. 5% SDS的溶液，在65°C下雜交，然后用2XSSC，O. I % SDS 和 I X SSC, O. I % SDS 各洗膜一次。序列表中的序列2由1093個堿基組成，自5'末端起第39位-第851位為其編碼序列，編碼具有序列表中序列I所不的氣基酸殘基序列的蛋白質。含有所述與植物抗姆蟲能力相關蛋白的編碼基因的表達盒、重組表達載體、轉基因細胞系或重組菌也屬于本發明的保護范圍。所述重組表達載體是在載體p2300-35S的多克隆位點間插入所述編碼基因得到的重組表達載體；所述載體p2300-35S是通過包括如下步驟的方法得到的(I)將pCAMBIA2300載體經過EcoRI和HindIII雙酶切，回收8. 7kb的載體大片段；(2)將pBI121載體經過EcoRI和HindIII雙酶切，回收3kb的片段；(3)將步驟(I)中回收8. 7kb的載體大片段與步驟(2)中回收的3kb的片段連接，得到重組載體P2300-35S。所述pCAMBIA2300載體購自澳大利亞CAMBIA公司；所述pBI 121載體購自Biovector Co.，LTD。擴增所述與植物抗蚜蟲能力相關蛋白的編碼基因全長或其任一片段的引物對也屬于本發明的保護范圍；所述引物對中，一條引物序列如序列表中序列3所示，另一條引物序列如序列表中序列4所示。本發明的另一個目的是提供一種培育轉基因植物的方法。本發明所提供的培育轉基因植物的方法，是將所述與植物抗蚜蟲能力相關蛋白的編碼基因導入目的植物中，得到與所述目的植物相比抗蚜蟲能力增強的轉基因植物。所述與植物抗蚜蟲能力相關蛋白的編碼基因是通過所述重組表達載體導入目的 植物中。所述目的植物為雙子葉植物或單子葉植物；所述雙子葉植物為煙草。本發明將包含Amlec基因的重組植物表達載體通過農桿菌介導法導入煙草，獲得了轉基因煙草，通過PCR檢測，結果表明目的基因已整合到煙草基因組中。對轉基因煙草進行蚜蟲抗性鑒定，發現轉基因煙草與對照煙草相比，對蚜蟲的抗性明顯提高，對蚜蟲種群的平均抑制率為35. 5%。Amlec基因能夠提高植物的抗蚜蟲能力，在植物抗蚜蟲基因工程中具有廣闊的應用前景。
圖I為植物表達載體p2300-35S_AmLec示意圖。圖2為轉p2300-35S_PtLec載體獲得的煙草無菌苗PCR檢測圖。圖3為轉基因陽性植株RT-PCR檢測圖。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。實施例I、與植物抗蚜蟲能力相關相關的蛋白及其編碼基因的獲得及功能驗證一、與植物抗蚜蟲能力相關的蛋白及其編碼基因的獲得I、Amlec基因片段的克隆利用RNA提取試劑盒(Andybio)提取海芋(Alocasia macrorrhiza)(購自大森林花卉市場)葉片RNA，同時根據已知lectin基因的保守序列設計簡并引物p-Fl (5，-CTTKRTCATGCAGGAHGACTGCA-3，)，p-Rl (5，-CCTGCATSACSAGCHKRTGGTT-3’ )，通過 PCR 擴增基因片段。PCR 反應條件為94°C變性 5min ;94°C 30sec，53°C 30sec，72°C lmin，35 個循環；72°C延伸 lOmin。將得到的目的片段克隆到PMD18-T載體，熱擊法轉化DH5 α，篩選鑒定陽性克隆，對陽性克隆進行測序，得到基因片段。2、Amlec基因cDNA 3’末端的獲得根據得到的基因片段設計特異引物primerF2(5’ -ACTGCAACGCCGTCCTGTACAATGG-3’)。利用RNA提取試劑盒(Andybio)提取海芋的葉片RNA。參考3’RACE(TaKaRa，Japan)試劑盒說明書，以 3Sites Adaptor Primer (5，GTTTTCCCAGTCACGAC 3，)和 p_F2 為引物，以海芋RNA反轉錄得到的cDNA為模板，PCR擴增得到Amlec3’末端產物。PCR反應條件為94°C 變性 5min ;94°C 30s, 55 °C 30s, 72 °C lmin，35 個循環；72°C 延伸 lOmin。將得到的目的片段克隆到PMD18-T載體，熱擊法轉化DH5 α，篩選鑒定陽性克隆，對陽性克隆進行測序，得到基因的3’端序列。3、Amlec基因cDNA 5’末端的獲得根據得到的基因序列設計并合成引物p_RT(5’ -CTTATGGTTCTTCGCGGTGAGC-3’ )、p-R2(5， -GTGAGCATGCCGTCTTCGTAG-3，)和 p-R3(5， -TGCCGTCTTCGTAGAGGACTTGTTC-3，)，根據 5，RACE 試劑盒(5，RACE Systemfor Rapid Amplification of cDNA Ends, Version
2.0, Invitrogen, USA)說明書，首先利用p_RT引物和反轉錄酶Superscript II RT對葉片RNA進行反轉錄，然后去除包含在cDNA中的蛋白、dNTPs、引物、DNA，在cDNA5’末端加上TdT，最后以 5’ RACE 引物(5，-GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG-3’ )和 p-R2(5’-GTGAGCATGCCGTCTTCGTAG-3’)，巢式引物(5，-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3’)和 p-R3 (5，-TG CCGTCTTCGTAGAGGACTTGTTC-3’ )進行嵌套PCR得到5’末端產物。PCR反應條件為94°C變性 4min;94°C 45s, 57°C 30s, 72°C lmin，32 個循環；72°C延伸 lOmin。RACE 得到的產物連接到pMD18T-VeCtor(TaKaRa，Japan)上，篩選鑒定陽性克隆，并進行序列測定，得到基因的5’端序列。4、Amlec基因全長cDNA的獲得用DNAMAN軟件分析組裝5’和3’序列獲得AmLec全長cDNA，其核苷酸序列如序列表中序列2所示，自5'末端起第39位-第851位為其編碼序列，編碼具有序列表中序列I所不的氣基酸殘基序列的蛋白質。序列表中序列I由270個氣基酸殘基組成。將該基因命名為AmLec，將其編碼的蛋白命名為AmLec。二、植物表達載體的構建根據獲得的Amlec基因全長cDNA序列，分別設計引物p_F3 (5’ -TCTAGAATGGCCAAGCTCCTCCTCTTC-3’ )和 p-R4(5’ -CCCGGGTTATTTCGCTTTCACCTTCTC-3，)。為方便載體構建，在p-F3的5’端和p-R4的3’端分別引入Xba I和SmaI酶切位點。以海芋葉片RNA反轉錄得到的第一鏈cDNA為模板進行PCR擴增，反應條件為94°C變性4min ；94°C 45s，58°C30s, 72°C lmin，35個循環；72°C延伸lOmin。目的基因片段連接到pMD18-T_Vector (購自Takara公司，產品目錄號為D101A)中，獲得Τ-AmLec,進行測序,保證AmLec蛋白cDNA的閱讀框及酶切位點的正確。用Xba I和SmaI酶切T-AmLec質粒，回收AmLec基因片段備用。將pBI121 載體(購自 Biovector Co. , LTD,產品目錄號為 Biovector008)經過EcoRI和HindIII雙酶切，回收3kb的片段；將pCAMBIA2300載體(購自CAMBIA公司)經過EcoRI和HindIII雙酶切，回收8. 7kb的載體大片段；將回收的8. 7kb的載體大片段與回收的3kb的片段連接，得到中間載體P2300-35S。用Xba I和Sma I酶切此中間載體p2300_35S，回收11. 7kb大小的條帶，與回收的AmLec基因片段重組成目的質粒。將目的質粒轉入大腸桿菌中，抗性篩選，挑取陽性克隆，將陽性克隆進行液體培養，提取陽性克隆質粒進行測序驗證，測序結果表明在載體P2300-35S的Xba I和SmaI酶切位點間插入了序列表中序列2第39到851位所示的AmLec基因片段，證明質粒構建正確，將重組載體命名為植物表達載體p2300-35S-AmLec。AmLec基因由CaMV35S啟動子驅動，3’末端為NOS終止子(見圖I ;圖中35S P =CaMV 35S啟動子；AmLec 海芋凝集素基因AUS β -葡萄糖苷酸酶；Nos 35S 35S的終止子；35S P =CaMV 35S啟動子；kan (R):卡那抗性基因；35S PloyA 35S的終止子；RB :T-DNA右邊界；LB :T-DNA左邊界)。三、農桿菌介導法獲得雙價轉基因煙草采用的煙草受體材料為煙草品種NC89(公眾可從中國農業科學院生物技術研究所獲得，記載過該材料的非專利文獻是姚斌，范云六，曾勤，趙榮敏.表達昆蟲特異性神經毒素AalT基因的轉基因煙草的抗蟲性.生物工程學報，1996，12 (2) :113-118)，農桿菌為LBA4404(北京鼎國生 物技術有限公司)，具體操作步驟如下I)根癌農桿菌LBA4404感受態的制備(I)從平板上挑取單菌落，接種到5ml YEB液體培養基(含鏈霉素Str印125mg/L)，28°C、250rpm振蕩培養過夜；(2)取 2ml 菌液，加入 50ml YEB 液體培養基(含 Str印l25mg/L)中，28°C、250rpm振蕩培養至OD6tltl約O. 6左右；(3)將菌液轉至50ml無菌離心管中，冰浴30min。5000rpm離心5min ；(4)棄上清，沉淀用2ml 20mM CaCl2重懸，每份100 μ I分裝到I. 5ml離心管中，液
氣中保存備用。 2)重組質粒DNA轉入農桿菌(I)將約 I μ g 的重組質粒 p2300-35S-AmLec DNA 加入到 100 μ I LBA4404 感受態細胞中，混勻，冰浴5min ；(2)將離心管置液氮中冷凍8min，迅速轉至37°C水浴中溫浴5min ；(3)加入Iml YEB液體培養基，在28°C搖床上250rpm復蘇4_5h ；(4)取適量菌液涂布到含Str印(鏈霉素)250_300mg/L、Rif (利福平)250_300mg/L和Kan (卡那霉素)100mg/L的YEB固體培養基上，置28°C培養24_48h。同時，按照上述方法，得到轉空載體P2300-35S對照的農桿菌菌液。3)葉盤法轉化煙草品種NC89(I)農桿菌的活化從平板上挑取農桿菌單菌落，接種到5ml YEB液體培養基中(Kan 100mg/L, Strep100mg/L，Rif 300mg/L)，振蕩培養過夜；取Iml菌液接種到50ml YEB液體培養基(Kan100mg/L，Strep 100mg/L, Rif 300mg/L)中，劇烈振蕩培養至 OD6tltl 為 0· 4_0· 5 (約 3_4h)；5，OOOrpm離心5min，菌體用MSO培養基(不含激素)重懸，使OD6tltl為O. 1-0. 2。(2)煙草的遺傳轉化a)侵染將煙草葉片切成Icm左右的小圓盤，在步驟(I)獲得的菌液中放置10分鐘，然后晾干。b)共培養將侵染過的葉塊擺放在鋪有2層濾紙的煙草芽分化培養基(MS+IAA
O.5mg/L+6-BA 2mg/L)上，25°C暗培養4天，得到經過共培養的煙草外植體。c)抗性芽的篩選將經過共培養的煙草外植體轉移到抗性芽篩選培養基(MS+IAAO. 5mg/L+6-BA 2mg/L+Kan 100mg/L+Cef (喔抱霉素)500mg/L)上，2 3 周后即可生芽。生根待抗性芽長到Icm左右時，將其轉移到生根培養基(MS+Kan IOOmg/L+Cef500mg/L)上，I 2周后即有不定根形成。同時，用上述方法得到轉空載體對照煙草植株。設未轉化的煙草NC89為野生型對照煙草。(3)轉基因煙草的PCR檢測通過CTAB 法提取轉基因煙草 DNA ，以 AmLec-F (ATGGCCAAGCTCCTCCTCTTC)和AmLec-R(TTATTTCGCTTTCACCTTCTC)為引物，進行PCR擴增；同時，設非轉基因煙草為陰性對照，質粒p2300-35S-AmLec DNA為陽性對照。結果如圖2所示(圖2中Marker為MarkerIII ；泳道I-泳道7為轉化獲得煙草苗；泳道8為陰性對照；泳道9為陽性對照)，從圖中可見，7株轉化煙草苗均擴增到813bp的目的片段)。利用Trizol提取PCR擴增陽性植株的RNA，同樣以 AmLec-F (ATGGCCAAGCTCCTCCTCTTC)和 AmLec-R (TTATTTCGCTTTCACCTTCTC)為引物，以煙草RNA為模板進行RT-PCR擴增；同時設非轉基因煙草為陰性對照，質粒p2300-35S-AmLeCDNA為陽性對照。結果如圖3所示(圖3中Marker為MarkerIII ;泳道I-泳道5為陽性煙草苗(從左向右為圖2中的2、3、4、6和7號煙草);泳道6為陰性對照；泳道7為陽性對照)，從圖中可見，陽性煙草苗均擴增得到813bp的目的基因片段。以上結果表明目的基因已整合到煙草基因組中。·(4)將PCR和RT-PCR均為陽性的轉基因煙草進行繼代繁殖，并進行編號，編號方式為母體號-1，-2，等依次類推，分別得到的轉基因煙草植株為2-1、2-2、3-1、3-2、3-3和6。同時，分別設野生型對照植株CK-UCK-2和CK-3和轉空載體對照植株K-I和K-2進行轉基因煙草的抗蚜蟲鑒定。四、轉基因煙草的抗蚜蟲鑒定本實驗委托河北省農林科學院植物保護研究所進行,測試煙姆(Myzus persicaeSulzer)(公眾可從中國農業科學院生物技術研究所獲得，記載過該材料的非專利文獻是尹翔宇；朱信寧；李鑫；馬麗；聞培俊；鄧小成.煙蚜及天敵種群動態的模糊聚類分析.中國煙草科學，2000，(I) 33-37)為河北省農林科學院植物保護研究所殺蟲劑組養蟲室內飼養在煙草上的煙蚜，飼養條件為溫度23-25°C，相對濕度50%-80%，光照周期L D =16 8。實驗過程為用毛筆將2頭煙蚜成蚜接于煙草植株頂部的嫩葉上，置于光周期L D=16 8、溫度23-25°C的養蟲室內，不同處理間罩上紗網相互隔離以避免煙蚜在不同處理的煙苗上轉移，待成蚜產下若蚜后，每株留下10頭若蚜，其余若蚜和成蚜抹去。然后每3天調查一次煙草上的蚜蟲數量，并統計11天后蚜蟲種群數量。以轉基因煙草對蚜蟲的種群抑制率作為指標，來評價各轉基因煙草對蚜蟲的毒力效果種群抑制率)=(野生型對照株存活蚜蟲數-轉基因煙草株存活蚜蟲數)/野生型對照株存活蚜蟲數*100% )。檢測結果如表I所示從表中可看出，2-1、2-2、3-1、3-2、3-3和6號轉Amlec基因煙草都表現出了蚜蟲抑制能力，平均抑制率為35. 5%，6號轉基因煙草抑制能力最強，達到了 48. 4%。而轉空載體對照煙草接蟲Ild每個株系平均頭數與野生型對照無顯著差異。表I陽性轉基因煙草對煙蚜繁殖的抑制率
權利要求
1.一種蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白質 (a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質； (b)將序列表中序列I的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗蚜蟲相關的由(a)衍生的蛋白質。
2.權利要求I所述蛋白的編碼基因。
3.根據權利要求2所述的編碼基因，其特征在于所述蛋白的編碼基因為如下1)-4)中任一所述的基因 1)序列表中序列2自5'末端起第39位-第851位核苷酸所示的DNA分子； 2)序列表中序列2所示的DNA分子； 3)在嚴格條件下與I)或2)所示的DNA分子雜交且編碼所述蛋白的基因； 4)與I)或2)或3)的基因具有90%以上的同源性且編碼所述蛋白的基因。
4.含有權利要求2或3所述編碼基因的表達盒、重組表達載體、轉基因細胞系或重組菌。
5.擴增權利要求2或3所述編碼基因全長或其任一片段的引物對，所述引物對中，一條引物序列如序列表中序列3所示，另一條引物序列如序列表中序列4所示。
6.一種培育轉基因植物的方法，是將權利要求2或3所述的編碼基因導入目的植物中，得到與所述目的植物相比抗蚜蟲能力增強的轉基因植物。
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于權利要求2或3所述的編碼基因是通過權利要求4所述的重組表達載體導入目的植物中。
8.根據權利要求6或7所述的方法，其特征在于所述目的植物為雙子葉植物或單子葉植物；所述雙子葉植物為煙草。
全文摘要
本發明公開了與植物抗蚜蟲能力相關的蛋白及其編碼基因與應用。本發明提供了一種與植物抗蚜蟲能力相關的蛋白。本發明所提供的與植物抗蚜蟲能力相關的蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白質(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列表中序列1的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與抗蚜蟲相關的由(a)衍生的蛋白質。本發明將包含Amlec基因的重組植物表達載體通過農桿菌介導法導入煙草，獲得了轉基因煙草對轉基因煙草進行蚜蟲抗性鑒定，發現轉基因煙草與對照煙草相比，對蚜蟲的抗性明顯提高，對蚜蟲種群的平均抑制率為35.5％。
文檔編號C12N1/21GK102952183SQ201110236588
公開日2013年3月6日 申請日期2011年8月17日 優先權日2011年8月17日
發明者王志興, 苗猛猛, 王旭靜, 唐巧玲 申請人:中國農業科學院生物技術研究所