用于檢測小鼠腺病毒的引物、探針及其方法

專利名稱：用于檢測小鼠腺病毒的引物、探針及其方法
技術領域：
本發明涉及生物檢測領域，特別是涉及一種用于檢測小鼠腺病毒的引物、探針及其方法。
背景技術：
自然感染實驗動物的病毒很多，根據對人類的危害性，可將其分為三類；一類為人獸共患病病毒，能夠感染人與靈長類動物；二類目前尚無跡象表明感染人，但能在體外培養的人、猿和猴源性細胞中進行復制，對人類有潛在危險性；三類病毒在自然條件下僅感染動物本身，目前尚無跡象表明能夠感染人，因此對人類威脅不大。現今，小鼠作為單克隆抗體、蛋白類藥物等生物制品的一個主要來源，具有潛在的病毒污染。在《中華人民共和國藥典O010年版)》三部中，規定了鼠源性生物制品需質檢的8種鼠源病毒，其中小鼠腺病毒屬于II類，目前尚無跡象表明感染人，但能在體外培養的人、猿和猴源性細胞中進行復制，對人類有潛在危險性。鼠源性病毒檢測標準的制定對客觀評價生物制品質量，確保人民健康必將起到積極的作用。小鼠腺病毒(Murine adenoviruses，簡稱MADV)在小鼠群中多呈隱性感染，但也可引起致死性疾病。這類病毒的帶毒期和排毒期均較長，嚴重影響小鼠健康。小鼠是小鼠腺病毒的自然宿主，實驗小鼠在籠內主要經糞便和尿液接觸傳播。不同毒株MADV，其毒力差異很大，MADV對不同年齡小鼠的易感性也不相同，臨床表現多種多樣。自然流行多由于感染 FL株引起，病鼠表現弓背、被毛粗糙、食欲下降等癥狀，新生乳鼠可死亡。K87株感染新生乳鼠和成年鼠均不發病，只是經糞便不斷向外排毒并產生高滴度的抗體。裸鼠也可自然發生 MADV感染，但株型未定。用FL株接種乳裸鼠，可造成十二指腸出血和致死性消耗性疾病。藥典規定的鼠源病毒檢測方法有細胞試驗、動物抗體產生實驗和雞胚感染實驗。 這些方法從生物效應角度來檢測鼠源病毒的潛在污染，檢測手段復雜費時，周期長，且對操作的實驗室有一定要求，不宜作為一種常規的指導生產的質控手段。而目前發展十分成熟的實時熒光定量PCR技術(Real-time Fluorence Quantitative Polymerase Chain Reaction Real Time PCR
便,且對實驗室要求也很低。Real Time PCR于1996年由美國Applied biosystems公司推出，是在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，使每一個循環變得“可見”，最后通過Ct值和標準曲線對樣品中的DNA(or cDNA)的起始濃度進行定量分析的方法。該方法自產生以來，不斷發展完善，特別是隨著Taqman熒光探針的廣泛應用，到目前為止該技術已經非常成熟。Taqman熒光探針的PCR檢測是指進行PCR擴增時， 在反應體系中加入一對引物的同時還加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸， 兩端分別標記一個報告熒光基因和一個淬滅熒光基團。當探針完整時，報告基因所發射的熒光信號被淬滅基因吸收，擴增時隨著Taq酶在鏈延伸過程中遇到與模板結合的探針，其 5’ _3’外切核酸酶活性將探針酶切降解，報告熒光基團與淬滅熒光基團分離，從而熒光檢測系統可以監測到熒光信號，模板每復制一次，就有一個探針被切斷伴隨一個熒光信號的釋放。由于被釋放的熒光基團數目和PCR產物數量是一對一關系，所以信號累積與PCR產物完全同步。整個反應結束后，便可得到一條擴增曲線，由已知濃度標準樣品的擴增曲線可以得到一條標準曲線，根據該標準曲線以及樣品中的擴增曲線可對樣品進行定量分析。實時熒光定量PCR技術不僅實現了對DNA/RNA模板的定量，而且具有靈敏度和特異性高、能實現多重反應、自動化程度高、無污染、實時和準確等特點，該已被廣泛用于免疫分析、細菌、病毒檢測等多個領域。迄今為止，實時熒光定量PCR技術檢測小鼠腺病毒方面還未見有報道，無疑有著很廣闊的發展空間。

發明內容
為了解決現有小鼠腺病毒檢測方法的不足，本發明提供了一種實時熒光定量PCR 檢測小鼠腺病毒的引物、探針及其方法，該方法簡單方便、靈敏度高且檢測時間短。本發明的一個目的是提供一對用于檢測小鼠腺病毒的引物。本發明提供的引物，是由具有序列表中的SEQ ID NO 1的上游引物與具有序列表中的SEQ ID NO :2的下游引物組成的一對寡核苷酸。序列表中的SEQ ID NO :1由21個堿基組成；序列表中的SEQ IDNO 2由17個堿
基組成。本發明人設計了多對PCR引物，經過長期大量的實驗從眾多引物對中篩選出了由上述上游引物和下游引物組成的引物對。其擴增片斷大小為131bp。該引物對小鼠腺病毒具有高度的保守性，且與小鼠基因組不具有顯著的同源性，使用該引物進行PCR擴增，可實現準確定性、定量檢測。本發明的另一個目的是提供一種用于檢測小鼠腺病毒的探針，所述探針具有序列表中的SEQ ID NO 3的核苷酸序列，所述探針5’端連接有熒光報告基團，3’端連接有熒光淬滅基團。所述探針中熒光報告基團可選自FAM、J0E、HEX中的任意一種，優選為FAM ；所述熒光淬滅基團選自TAMRA或Eclipse，優選為TAMRA。所述序列表中的SEQ ID NO 3由M個堿基組成。本發明的再一個目的是提供一種用于檢測小鼠腺病毒的方法，所述方法以樣品 DNA為模板，使用上述提及引物及探針進行實時熒光定量PCR檢測。優選地，所述實時熒光定量PCR的反應體系還包括腺病毒核酸PCR擴增試劑、陽性定量標準品、陰性質控品、空白對照。優選地，所述實時熒光定量PCR的退火溫度為60°C。優選地，所述實時熒光定量PCR的反應條件為50°C，2min ；95°C, IOmin ；95°C, 15s，60°C，lmin，共 40 個循環。優選地，所述方法還包括標準曲線的建立，方法為用含序列表中SEQ ID NO :4所示的堿基同源序列的PMD18-T重組質粒作為陽性定量標準品，將其十倍稀釋成不同濃度的陽性定量標準品，以所述陽性定量標準品作為模板進行實時熒光定量PCR檢測，得到用于檢測小鼠腺病毒的標準曲線。本發明的又一個目的是提供一種用于檢測小鼠腺病毒的試劑盒，所述試劑盒含上述提及的引物及探針。
優選地，所述試劑盒的反應體系還包括腺病毒核酸PCR擴增試劑、陽性定量標準品、陰性質控品、空白對照。優選地，所述PCR擴增試劑為2 X Taqman PCR Mix。優選地，所述陽性定量標準品為含序列表中SEQ ID NO :4所示的堿基同源序列的 PMD18-T重組質粒。本發明的還一個目的是提供上述提及的引物或探針在檢測鼠源生物制品中腺病毒殘留時的應用。與現有檢測方法相比，本發明提供的熒光定量PCR方法檢測小鼠腺病毒具有以下優點1、簡單快速現有的藥典小鼠腺病毒檢測方法為細胞試驗、動物抗體產生實驗和雞胚感染實驗，從生物學效應角度檢測生物制品中小鼠腺病毒的潛在感染，需時長(1-4 周時間)，而本發明從核酸角度對腺病毒進行檢測，只需要6小時左右即可出結果，且對操作實驗室環境要求不高，規避了以前抽檢產品可能產生的漏洞，可在企業實現批批檢測，進一步提高了生物制品質控質量。2、靈敏度高現有檢測方法是從生物學效應角度檢測生物制品中小鼠腺病毒的潛在感染，其中因制劑在制備過程中經過了多個工藝步驟的處理，殘留鼠源病毒的活病毒抗原及病毒抗體存在的可能性極小，而本發明從病毒核酸角度進行檢測，相對前述藥典規定方法而言，提高了檢測的靈敏度。利用本發明中的實時熒光定量PCR檢測鼠源生物制品中腺病毒時，可以準確定量，目標DNA在IO2-IO7濃度范圍內，都有很好的線性關系，靈敏度高可達至Ij IOOcopies/μ 1。3、重復性、準確性和特異性本發明中的引物和探針根據小鼠MADV-1、MADV-2、 MADV-3的同源性序列設計，且與小鼠基因組無同源性，檢測特異性強，重復性好；4、回收率高行業內通用標準要求檢測方法的回收率要達到50%以上，本發明實時熒光定量PCR方法回收率均達到了 80%以上，是一種理想的可替代現有藥典規定的檢測方法。


圖1為陽性定量標準品質粒的結構示意圖；圖2為實時熒光定量PCR定量曲線；圖3為實時熒光定量PCR標準曲線。
具體實施例方式以下所舉實施例只用于解釋本發明，并非用于限定本發明的保護范圍。下述實施例中所述試劑原料除特別注明來源外，均為市售的常見原料，試劑的配制采用常規方法。實施例中未詳述的方法均為本領域常規操作，詳見《分子克隆》第三版。實施例1小鼠腺病毒專用引物和探針的設計從genbank中查到MADV-1、MADV_2、MADV_3的全長基因組序列，它們的genbank號分別為 NC_000942/AC_000012、NC_014899/HM049560 和 NC_012584/EU835513。進行序列比對，找出具有其保守序列區的同源序列即SEQ ID NO :4所示核苷酸序列。
針對找出的保守的同源序列區域設計實時熒光定量PCR檢測專用引物和探針序列，擴增出的目的片段大小為131堿基。其中優選的引物、探針序列為上游引物5，-ACTTCCATCGTGTAGATTCGC-3，，即SEQ ID NO 1 所示核苷酸序列；下游引物5，-TTAGAGGGCAGCATTTG-3，，即SEQ ID NO 2 所示核苷酸序列；所述探針5，-ACCGGTTAGGCGAGCACAATCCAG-3，，即SEQ IDNO 3 所示核苷酸序列；所述探針的5’端用熒光報告基團FAM標記，3’端用熒光淬滅基團TAMRA標記。用設計的引物、探針進行同源性比對后發現其只對小鼠腺病毒具有高度保守型， 與小鼠基因組/EST、及其他近緣病毒不同源，其特異性較高。實施例2陽性定量標準品的制備合成SEQ ID NO 4所示核苷酸序列，并將其插入pMD18_T載體中制備而成(由 Invitrogen公司合成)，命名為pMD18T_MADVl，圖譜如圖1所示。pMD18T_MADVl質粒全長共 3318bp，分子量 2. 19X IO6Da0 計算可得，Iyg 質粒=2· 74X 10ncopies。。將含pMD18T-MADVl質粒的甘油菌Qnvitrogen公司提供)在LB培養基(含 100ng/ml Amp)中37 °C過夜震蕩培養后，用質粒小提試劑盒OjIAgen公司提供)提取 PMD18T-MADV1質粒，紫外吸光法定量并計算拷貝數，稀釋至IO8Copies/ μ 1作為陽性定量標準品，分裝保存于_80°C備用。實施例3實時熒光定量PCR擴增方法的建立1、實時熒光定量PCR模板制備——總DNA提取根據使用說明，分別用Trizol/Trizol LS試劑盒Gnvitrogen公司提供)提取樣品DNA，具體方法如下1)向樣品(如為組織需研磨勻漿)中加入適量TRIzoV/Trizol LS，混勻，室溫靜置 5min ；2)加入氯仿異戊醇04 1)溶液200ul，用vortex劇烈混勻10s。室溫放置 5min ；3) 40C 15000prm離心15min。盡量吸盡上清，棄上清；4)中間層和有機層加入0. 5mlDNA回收液，混勻，室溫靜置IOmin ；5) 40C 15000prm 離心 15min ；6)轉移上清，加入等體積苯酚氯仿異戊醇05 24 1)，震蕩混勻；7)轉移上清至新管，加入0. 8倍體積異丙醇，室溫靜置5min ；8) 40C 15000prm離心15min，棄上清，加入預冷的75%乙醇Iml洗DNA沉淀；9) 40C 15000prm 離心 IOmin ；10)用移液槍將上清盡量去除干凈，真空干燥5 IOmin ；11)用 IOOuITE 溶解沉淀。2、實時熒光定量PCR反應體系本發明人以陽性定量標準品pMD18T-MADVl為模板，對探針、引物的不同組合進行摸索，最終確定了探針和引物的最佳組合20μ 1反應體系中10μΜ探針0.4μ 1、10μΜ上下游引物各0.6 μ 1。具體地，進行樣品測定時，以總DNA為模板，進行實時熒光定量PCR，其中反應體系為
反應體系(20μ 1)
模板
上游引物(ΙΟμΜ) 下游引物(ΙΟμΜ) 探針(ΙΟμΜ) TaqmanPCRMix (2X ) ddH203、實時熒光定量PCR反應條件以上述反應體系進行實時熒光定量PCR，對反應程序中的退火溫度進行摸索，確定最佳退火溫度為60°C。具體反應條件為50°C,2min ；95°C,10min ；95°C，15s，60°C，lmin，共 40 個循環。每個循環結束后采
集數據，反應結束后根據擴增曲線判定結果。實施例4方法學驗證 1、標準曲線的建立及實時熒光定量PCR的靈敏度將實施例2 備用的 pMD18T-MADVl 稀釋至 IOUO2, ΙΟ3、ΙΟ4、105、IO6、IO7Copies/ μ 1 為模板，按照實施例3中的反應體系和反應條件進行實時熒光定量PCR反應，隨著PCR體系的每一個循環結束后測定吸光值，就得到了以循環數為橫坐標，吸光值為縱坐標的定量曲線和以標準品濃度的對數值為橫坐標，Ct為縱坐標的標準曲線。其中，Ct值的含義是每個反應管內的熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環數。本發明實時熒光定量PCR的檢測低限在40個循環內出現可信Ct值的稀釋低限， 當每差10倍模板量，Ct值相差3. 3的Ct值被認為是可信的Ct值，由圖2所示的定量曲線可得出，該實時熒光定量PCR的靈敏度可達到lOOcopies/μ 1。研究表明，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數的對數存在線性關系，起始拷貝數越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數的陽性定量標準品作出標準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數的對數，縱坐標代Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數。標準曲線如圖3所示，標準曲線R2 = 0. 996，線性相關性良好。2、實時熒光定量PCR的重復性、準確性和特異性將陽性定量標準品pMD18T-MADVl分別稀釋至濃度為ΙΟ6、104、IO2Copies/ μ 1作為為高中低值質控，以無病小鼠DNA為陰性對照即陰性質控品，以ddH20為空白對照，進行實時熒光定量PCR，測量結果如下表1 :表 1
2μ 1
0.6 U 1 0.6 U 1
0.4 μ 1 10μ 1
補足至20μ 1。
權利要求
1.用于檢測小鼠腺病毒的引物，其特征在于，所述引物是由具有序列表中的SEQID NO 1的上游引物與具有序列表中的SEQ ID NO 2的下游引物組成的一對寡核苷酸。
2.一種與權利要求1所述引物配合使用的探針，其特征在于，所述探針具有序列表中的SEQ ID NO 3的核苷酸序列。
3.根據權利要求2所述的探針，其特征在于，所述探針5’端連接有熒光報告基團，3’ 端連接有熒光淬滅基團。
4.根據權利要求2或3所述的探針，其特征在于，所述熒光報告基團選自FAM、J0E、HEX 中的任意一種，所述熒光淬滅基團選自TAMRA或Ecl ipse。
5.根據權利要求2-4任一所述的探針，其特征在于，所述熒光報告基團為FAM，所述熒光淬滅基團為TAMRA。
6.一種用于檢測小鼠腺病毒的方法，其特征在于，所述方法以樣品DNA為模板，使用權利要求1中所述的引物及權利要求2-4任一所述的探針進行的實時熒光定量PCR檢測方法。
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述實時熒光定量PCR的反應體系還包括腺病毒核酸PCR擴增試劑、陽性定量標準品、陰性質控品、空白對照。
8.根據權利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述實時熒光定量PCR的退火溫度為 60 "C。
9.根據權利要求6-8任一所述的方法，其特征在于，所述實時熒光定量PCR的反應條件為:50°C,2min ；95°C, IOmin ；95°C，15s，60°C，lmin，共 40 個循環。
10.根據權利要求6-9任一所述的方法，其特征在于，所述方法還包括標準曲線的建立，方法為用含序列表中SEQ ID N0:4所示的堿基同源序列的pMDIS-T重組質粒作為陽性定量標準品，將其十倍稀釋成不同濃度的陽性定量標準品，以所述陽性定量標準品作為模板進行實時熒光定量PCR檢測，得到檢測小鼠腺病毒的標準曲線。
11.一種檢測小鼠腺病毒的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒含有權利要求1中所述的引物及權利要求2-4任一所述的探針。
12.根據權利要求11所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒的反應體系還包括腺病毒核酸PCR擴增試劑、陽性定量標準品、陰性質控品、空白對照。
13.根據權利要求11或12所述的試劑盒，其特征在于，所述PCR擴增試劑為2XTaqman PCR Mix。
14.根據權利要求11-13任一所述的試劑盒，其特征在于，所述陽性定量標準品為含序列表中SEQ ID NO 4所示的堿基同源序列的pMD18-T重組質粒。
15.權利要求1中所述的引物或權利要求2-4任一所述的探針在檢測鼠源生物制品中腺病毒殘留時的應用。
全文摘要
本發明公開了一種用于檢測小鼠腺病毒的引物、探針及其方法，所述引物是由具有序列表中的SEQ ID NO1的上游引物與具有序列表中的SEQ ID NO2的下游引物組成的一對寡核苷酸，與所述引物配合使用的探針具有序列表中的SEQ ID NO3的核苷酸序列。用本發明的方法及試劑盒檢測小鼠腺病毒具有快速簡單、靈敏度高、特異性強且回收率高的優點，解決了現有檢測手段復雜費時，周期長，且對操作的實驗室有一定要求的不足，具有很好的應用前景。
文檔編號C12Q1/70GK102329890SQ20111023395
公開日2012年1月25日 申請日期2011年8月16日 優先權日2011年8月16日
發明者周志文, 李萃, 王剛, 范婷婷, 蔣立新, 譚淑萍 申請人:舒泰神(北京)生物制藥股份有限公司