專利名稱：一株東方伊薩酵母及其全細(xì)胞轉(zhuǎn)化產(chǎn)胞二磷膽堿的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一株東方伊薩酵母及其全細(xì)胞轉(zhuǎn)化產(chǎn)胞二磷膽堿的方法，涉及到胞二磷膽堿的制備，屬于生物制藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
胞二磷膽堿，又名胞磷膽堿，化學(xué)名稱是膽堿胞嘧啶_5’ - 二磷酸酯單納鹽，是卵磷脂生物合成的前體。補(bǔ)充外源性胞二磷膽堿即能激活卵磷脂的生物合成，刺激腦干網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的興奮，提高蘇醒閾值，恢復(fù)神經(jīng)組織機(jī)能，改善腦代謝和神經(jīng)傳導(dǎo)，提高患者的意識(shí)水平。此外，胞二磷膽堿還是一種重要的核酸藥物，能調(diào)節(jié)腦血管運(yùn)動(dòng)張力，改善大腦代謝功能。胞二磷膽堿作用的靶器官是肝臟和腦組織，臨床用以治療顱腦外傷及顱腦術(shù)后昏迷、 帕金森氏綜合癥、遲發(fā)性運(yùn)動(dòng)障礙、神經(jīng)性耳聾和耳鳴、腦血管疾病以及小腦與脊髓共濟(jì)失調(diào)。鑒于胞二磷膽堿的廣泛應(yīng)用，其制備技術(shù)成為較受關(guān)注的研究課題。胞二磷膽堿的生產(chǎn)方法有化學(xué)合成法、酶法和微生物轉(zhuǎn)化法，早在20世紀(jì)50年代就有報(bào)道通過化學(xué)法合成胞二磷膽堿，但化學(xué)合成的胞二磷膽堿產(chǎn)品不適合藥用，隨后采用酶促的方法合成胞二磷膽堿，但成本較高。目前常用的方法是微生物轉(zhuǎn)化法，但存在著轉(zhuǎn)化率、產(chǎn)量不高的問題。微生物細(xì)胞轉(zhuǎn)化制備胞二磷膽堿主要是通過ATP的再生體系和胞二磷膽堿合成酶系。ATP的再生是通過糖酵解途徑(EMP)來實(shí)現(xiàn)，胞二磷膽堿合成酶系包括核苷酸激酶、 核苷二磷酸激酶、膽堿激酶和磷酸膽堿胞苷轉(zhuǎn)移酶，ATP是胞二磷膽堿合成過程中磷酸供體。ATP的再生體系與胞二磷膽堿合成酶系偶聯(lián)時(shí)，反應(yīng)體系中只需存在葡萄糖、磷酸鹽、 5’ -胞苷酸和磷酸膽堿即可合成胞二磷膽堿。因此，胞二磷膽堿的合成速率取決于ATP再生的速率、胞二磷膽堿合成酶系的速率以及二者偶聯(lián)的速率。東方伊薩酵母α oriental is)細(xì)胞中ATP的再生量取決于EMP途徑，而通過添加鉀離子、鎂離子和錳離子等離子可以改變代謝流向，提高ATP的再生速率，從而與胞二磷膽堿酶系速率相匹配，實(shí)現(xiàn)高效制備胞二磷膽堿。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是使用東方伊薩酵母α oriental is)高效制備胞二磷膽堿。本發(fā)明的思路是以磷酸膽堿、5’ -胞苷酸或其前體物質(zhì)為底物，以葡萄糖為能量供體，通過無機(jī)鹽提高ATP再生速率，利用東方伊薩酵母(/. oriental is)透性細(xì)胞制備胞
二磷膽堿。本發(fā)明主要包括以下四個(gè)方面
(1)胞二磷膽堿的制備是以磷酸膽堿、5’ -胞苷酸為底物，以葡萄糖為能量供體，在水溶液中通過透性酵母細(xì)胞制備胞二磷膽堿。(2)上述(1)的制備方法中，所使用的酵母細(xì)胞為東方伊薩酵母(/. orimiahi)Zl，中國典型培養(yǎng)物保藏中心，菌種編號(hào)為CCTCC Ν0:Μ 2011272。
(3)上述(1)的制備方法中，葡萄糖為能量供體，一方面提供菌體的能量需求，另一方面為胞二磷膽堿合成酶系提供ATP，本發(fā)明中通過添加鉀離子、鎂離子和錳離子中的一種或組合提高ATP的再生速率。(4)上述(1)的制備方法中，使用的酵母細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)離心后得到的酵母全細(xì)胞， 并在制備的水溶液中添加甲苯來提高細(xì)胞的透性，以提高胞二磷膽堿合成酶系的速率。本發(fā)明的技術(shù)方案一株東方伊薩酵母，其命名為東方伊薩酵母ijssatchenkia orimiahi)Z1，已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO =M 2011272。用所述東方伊薩酵母全細(xì)胞轉(zhuǎn)化產(chǎn)胞二磷膽堿的方法，以磷酸膽堿和5’ -胞苷酸為底物，以葡萄糖為能量供體，通過添加無機(jī)離子提高ATP再生速率，利用東方伊薩酵母 (/. oriental is) CCTCC NO :M 2011272 透性細(xì)胞制備胞二磷膽堿。胞二磷膽堿的制備是在水溶液中進(jìn)行，反應(yīng)溫度為2(T40°C，pH為壙9，反應(yīng)時(shí)間為6 24h。胞二磷膽堿制備中底物磷酸膽堿的起始反應(yīng)濃度為l(Tl00ymol/mL，5’ -胞苷酸的起始反應(yīng)濃度為1(Γ50 μ mol/mL ；能量供體葡萄糖的起始反應(yīng)濃度為5(Γ500 μ mol/mL ； 添加的無機(jī)離子為鉀離子、鎂離子、錳離子的無機(jī)鹽形式，可以是磷酸鹽、硫酸鹽等，添加離子的方式可以是一種或幾種離子的組合，其中鉀離子的起始反應(yīng)濃度為(Γ200 μ mol/mL，鎂離子的起始反應(yīng)濃度為(T200ymol/mL，錳離子的起始反應(yīng)濃度為(Γ50 μ mol/mL ；使用的酵母全細(xì)胞為東方伊薩酵母O· oriental is) CCTCC NO :M 2011272，通過培養(yǎng)離心得到的酵母全細(xì)胞，在反應(yīng)中添加形式是酵母泥，起始添加濃度為20(Tl000g/L ；在反應(yīng)中通過添加甲苯來改變酵母細(xì)胞的通透性，甲苯的起始反應(yīng)濃度為0.廣10mL/L。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明中以葡萄糖為能量供體，一方面提供菌體的能量需求， 另一方面為胞二磷膽堿合成酶系提供ATP;通過添加鉀離子、鎂離子和錳離子中的一種或組合改變代謝流向，提高ATP的再生速率，從而與胞二磷膽堿酶系速率相匹配，實(shí)現(xiàn)高效制備胞二磷膽堿。使用的酵母細(xì)胞為經(jīng)培養(yǎng)離心后得到酵母全細(xì)胞，并在制備的水溶液中添加甲苯來提高細(xì)胞的透性，以提高胞二磷膽堿合成酶系的速率。生物材料樣品保藏東方伊薩酵母ijssatchenkia oriental is) Zl,已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國武漢武漢大學(xué)，保藏日期2011年7月四日，保藏編號(hào)為 CCTCC NO :M 2011272。
圖1本發(fā)明制備胞二磷膽堿主要代謝途徑示意圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1
東方伊薩酵母的培養(yǎng)，所用的酵母培養(yǎng)基為葡萄糖50 g/L，尿素2.0 g/L，磷酸二氫鉀 1. 5 g/L,七水合硫酸鎂0. 5 g/L,七水合硫酸鋅4. 0 mg/L,七水合硫酸鐵3. 0 mg/L,四水合硫酸錳0. 3 mg/L，無水氯化鈣1. 0 mg/L,生物素0. 05 mg/L,以蒸餾水定容。東方伊薩酵母的接種量為10%，于30° C搖床培養(yǎng)M h，然后4500r/min離心lOmin，棄上清后得到酵母泥，
4即可用于制備胞二磷膽堿。在反應(yīng)器中配制由25ymol/mL磷酸膽堿，lOymol/mL 5，-胞苷酸，200 μ mol/mL 葡萄糖，5 μ mol/mL七水合硫酸鎂以及上述培養(yǎng)基培養(yǎng)離心得到的酵母泥2000g和水組成的反應(yīng)液10L，氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH 6. 0，于32° C轉(zhuǎn)化10h，反應(yīng)結(jié)束后，測定反應(yīng)液中胞二磷膽堿的產(chǎn)量為2. 0 g/L，轉(zhuǎn)化率達(dá)到61. 9%。實(shí)施例2
在反應(yīng)器中配制由25 μ mol/mL磷酸膽堿，10 μ mol/mL 5’ -胞苷酸，200 μ mol/mL葡萄糖，5 μ mol/mL七水合硫酸鎂以及按照實(shí)施例1所述的培養(yǎng)東方伊薩酵母的方法培養(yǎng)離心得到的酵母泥2000g和水組成的反應(yīng)液10L，氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH 6. 0，并添加0. lmL/L的甲苯，于32° C轉(zhuǎn)化10h，反應(yīng)結(jié)束后，測定反應(yīng)液中胞二磷膽堿的產(chǎn)量為2. 4g/L，轉(zhuǎn)化率達(dá)到 74. 2%ο實(shí)施例3
在反應(yīng)器中配制由30 μ mol/mL磷酸膽堿，20 μ mol/mL 5’ -胞苷酸，300 μ mol/mL葡萄糖，5 μ mol/mL七水合硫酸鎂，10 μ mol/mL磷酸二氫鉀以及按照實(shí)施例1所述的培養(yǎng)東方伊薩酵母的方法培養(yǎng)離心得到的酵母泥5000g和水組成的反應(yīng)液10L，氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH 5.0， 并添加0. 5mL/L的甲苯，于32° C轉(zhuǎn)化10h，反應(yīng)結(jié)束后，測定反應(yīng)液中胞二磷膽堿的產(chǎn)量為 5. lg/L，轉(zhuǎn)化率達(dá)到78. 9%。實(shí)施例4
在反應(yīng)器中配制由50 μ mol/mL磷酸膽堿，40 μ mol/mL 5’ -胞苷酸，400 μ mol/mL葡萄糖，5 μ mol/mL七水合硫酸鎂，10 μ mol/mL磷酸二氫鉀以及按照實(shí)施例1所述的培養(yǎng)東方伊薩酵母的方法培養(yǎng)離心得到的酵母泥5000g和水組成的反應(yīng)液10L，氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH 6.0， 并添加0. 5mL/L的甲苯，于32° C轉(zhuǎn)化10h，反應(yīng)結(jié)束后，測定反應(yīng)液中胞二磷膽堿的產(chǎn)量為 9.5 g/L，轉(zhuǎn)化率達(dá)到73. 4%。實(shí)施例5
在反應(yīng)器中配制由50 μ mol/mL磷酸膽堿，40 μ mol/mL 5’ -胞苷酸，400 μ mol/mL葡萄糖，5 μ mol/mL七水合硫酸鎂，1 μ mol/mL硫酸錳以及按照實(shí)施例1所述的培養(yǎng)東方伊薩酵母的方法培養(yǎng)離心得到的酵母泥8000g和水組成的反應(yīng)液10L，氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH 8.0，并添加0. 5mL/L的甲苯，于32° C轉(zhuǎn)化10h，反應(yīng)結(jié)束后，測定反應(yīng)液中胞二磷膽堿的產(chǎn)量為IOg/ L，轉(zhuǎn)化率達(dá)到77. 4%。實(shí)施例6
在反應(yīng)器中配制由50 μ mol/mL磷酸膽堿，40 μ mol/mL 5’ -胞苷酸，400 μ mol/mL葡萄糖，5 μ mol/mL七水合硫酸鎂，10 μ mol/mL磷酸二氫鉀以及按照案例1所述的培養(yǎng)東方伊薩酵母的方法培養(yǎng)離心得到的酵母泥7500g和水組成的反應(yīng)液15L，氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH6. 0， 并添加lmL/L的甲苯，于32°C轉(zhuǎn)化他，反應(yīng)結(jié)束后，測定反應(yīng)液中胞二磷膽堿的產(chǎn)量為 10. 6g/L，轉(zhuǎn)化率達(dá)到82%。實(shí)施例7
在反應(yīng)器中配制由50 μ mol/mL磷酸膽堿，40 μ mol/mL 5’ -胞苷酸，400 μ mol/mL葡萄糖，5 μ mol/mL七水合硫酸鎂，10 μ mol/mL磷酸二氫鉀，1 μ mol/mL硫酸錳以及按照實(shí)施例1 所述的培養(yǎng)東方伊薩酵母的方法培養(yǎng)離心得到的酵母泥5000g和水組成的反應(yīng)液10L，氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH 6. 8，，并添加0. 5mL/L的甲苯，于34° C轉(zhuǎn)化10h，反應(yīng)結(jié)束后，測定反應(yīng)液中胞二磷膽堿的產(chǎn)量為10. 4 g/L，轉(zhuǎn)化率達(dá)到80. 4%。實(shí)施例8
在反應(yīng)器中配制由5(^11101/1^磷酸膽堿，4(^11101/1^ 5’ -胞苷酸，400 μ mol/mL葡萄糖，5 μ mol/mL七水合硫酸鎂，10 μ mol/mL磷酸二氫鉀，1 μ mol/mL硫酸錳以及按照實(shí)施例1 所述的培養(yǎng)東方伊薩酵母的方法培養(yǎng)離心得到的酵母泥5000g和水組成的反應(yīng)液10L，氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH 6.0，并添加1!^/1的甲苯，于30°(轉(zhuǎn)化10h，反應(yīng)結(jié)束后，測定反應(yīng)液中胞二磷膽堿的產(chǎn)量為10. 8g/L，轉(zhuǎn)化率達(dá)到83. 5%。實(shí)施例9
在反應(yīng)器中配制由50 μ mol/mL磷酸膽堿，40 μ mol/mL 5’ -胞苷酸，400 μ mol/mL葡萄糖，10 μ mol/mL磷酸二氫鉀，1 μ mol/mL硫酸錳以及按照實(shí)施例1所述的培養(yǎng)東方伊薩酵母的方法培養(yǎng)離心得到的酵母泥6000g和水組成的反應(yīng)液12L，氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH 6. 5，并添加 5mL/L的甲苯，于32° C轉(zhuǎn)化12h，反應(yīng)結(jié)束后，測定反應(yīng)液中胞二磷膽堿的產(chǎn)量為10. 6g/L， 轉(zhuǎn)化率達(dá)到82%。實(shí)施例10
在反應(yīng)器中配制由50 μ mol/mL磷酸膽堿，40 μ mol/mL 5’ -胞苷酸，400 μ mol/mL葡萄糖，5 μ mol/mL七水合硫酸鎂，10 μ mol/mL磷酸二氫鉀，1 μ mol/mL硫酸錳以及按照實(shí)施例1 所述的培養(yǎng)東方伊薩酵母的方法培養(yǎng)離心得到的酵母泥5000g和水組成的反應(yīng)液10L，氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH 6.0,并添加lmL/L的甲苯，于32°C轉(zhuǎn)化12h，反應(yīng)結(jié)束后，測定反應(yīng)液中胞二磷膽堿的產(chǎn)量為11. 2g/L，轉(zhuǎn)化率達(dá)到86. 6%。
權(quán)利要求
1.一株東方伊薩酵母，其命名為東方伊薩酵母Os1SaicAez^ia orimi^is) Z1，已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO =M 2011272。
2.用權(quán)利要求1所述東方伊薩酵母全細(xì)胞轉(zhuǎn)化產(chǎn)胞二磷膽堿的方法，其特征在于以磷酸膽堿和5’ -胞苷酸為底物，以葡萄糖為能量供體，通過添加無機(jī)離子提高ATP再生速率， 利用東方伊薩酵母CCTCC NO =M 2011272透性細(xì)胞制備胞二磷膽堿；胞二磷膽堿的制備是在水溶液中進(jìn)行的，反應(yīng)溫度是2(T40°C，pH4、，反應(yīng)時(shí)間為6l4h ；所述的底物中，磷酸膽堿的起始濃度為l(Tl00ymol/mL，5’ -胞苷酸的起始濃度為 10 50ymol/mL ；所述的能量供體葡萄糖的起始濃度為5(Γ500 μ mol/mL ；所述添加的無機(jī)離子為鉀離子、鎂離子、錳離子中的一種或幾種的組合；鉀離子的起始反應(yīng)濃度為(Γ200 μ mol/mL，鎂離子的起始反應(yīng)濃度為(Γ200 μ mol/mL，錳離子的起始反應(yīng)濃度為0 50 μ mol/mL ；所使用的東方伊薩酵母全細(xì)胞為CCTCC NO =M 2011272通過培養(yǎng)離心得到的酵母全細(xì)胞，在反應(yīng)中添加形式是酵母泥，起始添加濃度為20(Tl000g/L ；所述的東方伊薩酵母透性細(xì)胞是指在反應(yīng)中通過添加甲苯處理改變酵母細(xì)胞的通透性，甲苯的起始反應(yīng)濃度為0.廣10mL/L。
全文摘要
一株東方伊薩酵母及其全細(xì)胞轉(zhuǎn)化產(chǎn)胞二磷膽堿的方法，屬于生物制藥技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明利用東方伊薩酵母(Issatchenkiaorientalis)Z1，即CCTCCNOM2011272，全細(xì)胞制備胞二磷膽堿，以磷酸膽堿和5’-胞苷酸為底物，以葡萄糖為能量供體，通過添加無機(jī)離子提高ATP再生效率；以葡萄糖為能量供體，一方面提供菌體的能量需求，另一方面為胞二磷膽堿合成酶系提供ATP；通過添加鉀離子、鎂離子和錳離子中的一種或組合改變代謝流向，提高ATP的再生速率，從而與胞二磷膽堿酶系速率相匹配，實(shí)現(xiàn)高效制備胞二磷膽堿；使用酵母全細(xì)胞，并在制備過程的水溶液中添加甲苯來提高細(xì)胞的透性，以提高胞二磷膽堿合成酶系的速率。
文檔編號(hào)C12N1/16GK102286386SQ201110232740
公開日2011年12月21日 申請日期2011年8月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月15日
發(fā)明者丁重陽, 尤翠萍, 張梁, 石貴陽, 顧正華 申請人:江南大學(xué)