專利名稱：一種用分子標(biāo)記快速篩選邊雞體重增長程度的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及家禽育種領(lǐng)域，具體涉及一種用DNA分子標(biāo)記篩選邊雞體重增長程度的方法。
背景技術(shù)：
傳統(tǒng)的數(shù)量遺傳學(xué)對數(shù)量性狀遺傳機制的理解建立在抽象的微效多基因假設(shè)基礎(chǔ)上，將影響一個數(shù)量性狀的所有基因當(dāng)作一個整體來處理，而不考慮其中的各個基因是如何作用的。這一假說在多年的動植物育種中發(fā)揮了重要作用，推動了動植物育種工作的進展，在當(dāng)時的理論和技術(shù)條件下不失為一個很好的基礎(chǔ)。但這一假說不了解數(shù)量性狀的遺傳背景，不了解控制數(shù)量性狀的基因在染色體上的位置及其傳遞規(guī)律，無法對其效應(yīng)作出準(zhǔn)確的估計，更不能從分子水平分離和定位該類基因。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，遺傳學(xué)家和育種學(xué)家認(rèn)識到控制數(shù)量性狀的基因并非在基因組中隨機分布，且存在影響數(shù)量性狀的主效基因。目前，在育種中對雞體重增長程度的篩選方法主要是通過數(shù)量遺傳學(xué)方法，而數(shù)量遺傳學(xué)方法進展緩慢，尋找到合適的DNA標(biāo)記用于輔助選擇能增強選擇的準(zhǔn)確性、縮短世代間隔，加快遺傳進展。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種用DNA分子標(biāo)記篩選邊雞體重增長程度的方法，該方法利用雞rn^vi酶切圖譜對邊雞體重進行標(biāo)記輔助選擇，不受環(huán)境影響。本發(fā)明的原理是DNA池測序發(fā)現(xiàn)邊雞MSTN基因外顯子1的234bp處存在一個 G-A突變，DNAMAN 5. 22軟件分析表明該位點為KdvI識別位點。針對該酶切位點設(shè)計特異性引物擴增邊雞基因組DNA，引物的擴增產(chǎn)物經(jīng)m^vl酶切產(chǎn)生3種基因型(GG、GA和AA)。 無論是一世代還是二世代的邊雞，在6到18周齡時，AA和GA基因型邊雞的體重都顯著或極顯著高于GG型(P<0. 05或P<0. 01)。該單核苷酸突變能穩(wěn)定遺傳，選擇的檢測方法簡單快捷，且不受外界環(huán)境的影響，可以用于邊雞體重選擇的分子遺傳標(biāo)記，進行標(biāo)記輔助選擇。本發(fā)明所說的方法是提取待測樣本的雞基因組DNA，經(jīng)特異性引物擴增得到 162bp的目的片段，目的片段經(jīng)限制性內(nèi)切酶rn^vl酶切，凝膠電泳后用銀染顯色，得到DNA 的酶切圖譜，根據(jù)圖譜中條帶的數(shù)量和大小對待測樣本體重增長的快慢進行判斷。所述根據(jù)圖譜中條帶的數(shù)量和大小對待測樣本體重增長的快慢進行判斷的方法是僅有162bp條帶的為體重增長快的純合型樣本，僅有127bp條帶的為體重增長慢的純合型樣本；同時含有162bp和127bp條帶的為體重增長快的雜合型樣本。本發(fā)是提供了邊雞MSTN基因在邊雞育種篩選中作為體重選擇的分子遺傳標(biāo)記的應(yīng)用。所述分子遺傳標(biāo)記在應(yīng)用于育種篩選時，選擇MSTN基因中不含m^vl酶切位點的個體，即體重增長快的純合型樣本(AA型)。
圖 1 是 PCR 產(chǎn)物圖，Marker 為 GM331。圖2是BbvI酶切產(chǎn)物圖，Marker為GM331。
具體實施例方式實施例1
1.待測基因組DNA的提取 1. 1采血
一世代(137只)和二世代(117只)的邊雞母雞采自山西省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所，翅靜脈采集血樣0. 5 mL左右，肝素鈉抗凝，置冰盒帶回實驗室，-20°C保存。1.2消化蛋白質(zhì)和RNA
取抗凝血30 μ L，放入1.5 mL離心管中，加入0.3 mL TE，0. 3ml裂解液，10 μ L RnaseA 酶(2. 5 mg/mL)，8yL蛋白酶K (20 mg/mL)，顛倒混勻，55°C過夜，充分消化蛋白質(zhì)和RNA。有機溶劑提取DNA
加入0.6 mL Tris飽和酚，顛倒混勻20 min，12000 rpm離心10 min ；吸取上清液至另一干凈的1.5 mL的離心管中，加入0.6 mL酚/氯仿/異戊醇(25 : :1)，顛倒混勻20 min, 12000 rpm離心10 min ；吸取上清液放入另一干凈的1. 5 mL的離心管中，加入0. 6 mL氯仿 /異戊醇(24 :1)溶液，顛倒混勻20 min, 12000 rpm離心10 min ；吸取上清液放入另一干凈的1.5 mL的離心管中，加入1 mL的冰無水乙醇，顛倒混合，可見絮狀漂浮物。12000 rpm 離心10 min，倒掉乙醇；加入0. 5 mL70%冰乙醇洗滌2次；倒掉乙醇，37°C過夜干燥DNA樣品。加300 μ L超純水過夜溶解DNA。1. 4 DNA濃度和純度的測定
用核酸測定儀測定DNA的0擬60、0擬80和濃度，把基因組DNA稀釋成100 ng/μ 1,4 V 貯存，備用。2.引物設(shè)計和PCR擴增 2.1酶切引物的設(shè)計
根據(jù)GenBank中雞MSTN基因序列(GenBank登錄號為AF346599)針對外顯子1的KdvI 位點設(shè)計1對引物，擴增產(chǎn)物大小為162 bp。引物序列如下 Pl :F: 5，-GCATTAGCAGGGACGTTAT-3，； (SEQ ID NO 1) R:5，-ACTCCGTAGGCATTGTGAT-3，(SEQ ID NO :2)。2. 2 PCR 擴增
PCR擴增反應(yīng)為25 PL體系，包括上、下游引物(10 Mmol/L)2 μ ；dNTPs (2 mmol/L) 2.5 μ ；Taq DNA 聚合酶(5 U/^L)0. 2 PL;DNA 模板(50 ηδ/μ )2 μ ；Mg2+ (25 mmol/L)l. 5 μ ； 10 XPCR緩沖液2. 5 μ ；超純水14. 3 μ 。PCR擴增反應(yīng)程序94°C變性6 min ；94°C變性30 s，56°C復(fù)性30 s，72°C延伸30 s，進行30個循環(huán)；最后72°C延伸10 min ;10°C保存。PCR反應(yīng)完成后，用交聯(lián)度為(Acr:BiS)39:l的10%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測擴增結(jié)果如圖1(其中1-8泳道為8個不同邊雞個體的PCR產(chǎn)物，其它個體的擴增結(jié)果與圖1相同，省略)，硝酸銀染色，UV凝膠成像系統(tǒng)進行凝膠成像。
2. 3 PCR-RFLP 檢測
PCR產(chǎn)物用m^vl酶切，以檢測多態(tài)性。酶切反應(yīng)總體積為20 yL，超純水16.5 μ L, BbvI 酶(10 u/μ L) 0.5 μ L,10Xbuffer 2 yL，37° C 酶切 2 h，酶切產(chǎn)物用交聯(lián)度為 (Acr:Bii029:l的10%的非變性聚丙烯酰胺凝膠檢測，200V電泳5 h，硝酸銀染色。酶切圖譜如圖2所示，顯示3種基因型，僅有162bp目的片段的樣本不含rn^vl酶切位點，命名為AA 型；僅有127bp的為含有rn^vl酶切位點的純合型，命名為GG型；同時含有162bp和127bp 的為含有KdvI酶切位點的雜合型樣本，命名為GA型。GG和AA相比在外顯子1編碼區(qū)的 234 bp (C. 234 bp)處有一個G — A的突變。當(dāng)C. 234 bp處為G時，BbvI酶切產(chǎn)生127 bp 和35 bp的片段；當(dāng)C. 234 bp處為A時，無m^vl酶切位點。在凝膠檢測時，有酶切位點的樣本產(chǎn)生的35bp的片段由于長度太小，跑出了凝膠，所以在凝膠中未顯示出條帶。根據(jù)酶切圖譜中條帶的數(shù)量和大小辨別引物的擴增產(chǎn)物中是否有m^i酶切位點。2. 4 MSTN基因rn^vl位點不同基因型與邊雞生長性狀的關(guān)聯(lián)分析
各樣本的生長性狀與PCR-RFLP檢測結(jié)果分析如表1和表2，由此可見，無論是一世代還是二世代的邊雞，在6到18周齡時，AA和GA基因型邊雞的體重都顯著或極顯著高于GG型 (P<0. 05或P<0. 01)。在育種篩選中只選擇AA型(即不含KdvI酶切位點的MSTN基因)可以在群體中固定該基因型。所以PCR產(chǎn)物能否被rn^vi酶切開可作為篩選邊雞體重增長程度的方法。 注同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.(^)，肩標(biāo)不同大寫字母表示極顯著(P<0.01 )。
權(quán)利要求
1.一種用分子標(biāo)記快速篩選邊雞體重增長程度的方法，其特征在于提取待測樣本的雞基因組DNA，經(jīng)特異性引物擴增得到MSTN基因目的片段，目的片段經(jīng)限制性內(nèi)切酶rn^vl 酶切，凝膠電泳后用銀染顯色，得到DNA的酶切圖譜，根據(jù)圖譜中條帶的數(shù)量和大小對待測樣本體重增長的快慢進行判斷。
2.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于其中所述根據(jù)圖譜中條帶的數(shù)量和大小對待測樣本體重增長的快慢進行判斷的中方法是圖譜中僅有162bp條帶的為體重增長快的純合型樣本，僅有127bp條帶的為體重增長慢的純合型樣本；同時含有162bp和127bp條帶的為體重增長快的雜合型樣本。
3.邊雞MSTN基因在邊雞育種篩選中作為體重選擇的分子遺傳標(biāo)記的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于選擇MSTN基因中不含m^vl酶切位點的個體。
全文摘要
本發(fā)明涉及家禽育種領(lǐng)域，具體涉及一種用DNA分子標(biāo)記篩選邊雞體重增長程度的方法。所述方法是提取待測樣本的雞基因組DNA，經(jīng)特異性引物擴增得到MSTN基因目的片段，目的片段經(jīng)限制性內(nèi)切酶BbvI酶切，凝膠電泳后用銀染顯色，得到DNA的酶切圖譜，根據(jù)圖譜中條帶的數(shù)量和大小對待測樣本體重增長的快慢進行判斷。本發(fā)明選擇的檢測方法簡單快捷，且不受外界環(huán)境的影響，可以用于邊雞體重選擇的分子遺傳標(biāo)記，進行標(biāo)記輔助選擇。
文檔編號C12Q1/68GK102321750SQ20111023197
公開日2012年1月18日 申請日期2011年8月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月15日
發(fā)明者丁馥香, 張麗, 張李俊, 張跟喜, 戴國俊, 王金玉, 謝愷舟, 趙秀華 申請人:揚州大學(xué)