專利名稱：多基因突變位點的實時pcr基因檢測芯片及其檢測方法
技術領域：
本發明屬于多基因突變位點的實時檢測技術領域，具體涉及一種多基因突變位點的實時PCR基因檢測芯片及其檢測方法。
背景技術：
DNA突變(mutation)是遺傳物質中任何可檢測的能遺傳的改變，但不包括遺傳重組。突變是可以傳遞給子細胞，甚至延續給后代，從而導致產生了突變細胞或個體。對于一個多細胞生物來說，如果突變僅發生在體細胞中，那么這種突變是不會傳遞給后代的。這種類型的突變稱為體細胞突變。但若突變發生在的生殖細胞中，那么這種突變就能通過配子傳遞給下一代，在后代個體的體細胞和生殖細胞中產生同樣的突變，這種突變就叫做種系突變。由于遺傳物質一般是DNA，突變會影響到DNA的化學或物理的構成，它的復制，表型功能或者一個或多個堿基對序列會發生改變，例如增加、減少或置換堿基，顛倒順序或轉移到新的位置上。發生在基因水平的突變稱為基因突變，它涉及到基因的一個或多個序列的改變。包括一對或多對堿基對的替換，增加或缺失。由于DNA堿基對的改變引起的基因突變稱為點突變。每一個人或動物個體都攜帶有其獨特的突變譜，包括長短不一的增加或缺失 (indel)、DNA片斷包括基因重復數(CNV)和點突變(SNP)。突變的種類包括(1)堿基替換突變①同義突變由于密碼子具有兼并性，因此，單個堿基置換后使mRNA上改變后的密碼子與改變前所編碼的氨基酸一樣，肽鏈中出現同一氨基酸。②錯義突變DNA分子中的核苷酸置換后改變了 mRNA上的遺傳密碼，從而導致合成的多肽鏈中一個氨基酸被另一氨基酸所取代，稱為錯義突變。錯義突變的結果是產生異常蛋白質。③無義突變當單個堿基置換導致出現終止密碼子(UAG、UAA、UGA)時，多肽鏈將提前終止合成，所產生的蛋白質大都失去活性或喪失正常功能，這種突變稱為無義突變。④終止密碼突變當DNA分子中一個終止密碼發生突變，成為編碼氨基酸的密碼子時，多肽鏈的合成將繼續進行，肽鏈延長直到遇到下一個終止密碼子時才停止，因而形成了延長的異常肽鏈，這種突變稱為終止密碼突變。(2)移碼突變基因內部DNA的堿基序列中，丟失或插入1個或幾個堿基對，從而使堿基對的排列順序發生改變引起突變。基因片段上堿基數單個增添或減少一定會導致生物性狀的改變。若堿基對數以3 的倍數增添或減少，則合成的蛋白質上氨基酸種類排列順序變化較小。基因片段上可能某一位點上添(減)1個堿基對，然后在以后某一位點上又減 (添)4個堿基對，使其添減之差為3或3的倍數，則合成的蛋白質氨基酸種類在這兩個位點之間變化，其他部位變化不明顯。
(3)抑制突變RNA上的反密碼子通過堿基互補配對能識別mRNA上的密碼子，從而將mRNA上的核苷酸序列轉變為多肽鏈上的序列。如果控制mRNA上的基因所在的DNA分子上某一對脫氧核苷酸發生改變，產生了基因突變，但這種突變剛好被tRNA的基因突變所糾正，結果是突變基因的最終產物并未發生改變。由于tRNA基因的突變，在翻譯過程中抑制了 mRNA上的突變基因的表達，故稱為抑制突變。(4)重組突變基因所在的DNA分子斷裂后，不同的DNA分子在斷裂處可能發生交換重組，極性相同的不同單鏈重新連接起來，產生新組合的DNA分子的脫氧核苷酸序列，不同于原來的DNA分子序列，從而可以導致各種各樣的突變。檢測突變的技術方法1、核酸分子雜交技術，用于檢測樣本中是否存在與探針序列互補的同源核酸序列。常用有以下方法。(1)限制性內切酶分析法。此方法是利用限制性內切酶和特異性DNA探針來檢測是否存在基因變異。當待測DNA序列中發生突變時會導致某些限制性內切酶位點的改變， 其特異的限制性酶切片段的狀態在電泳遷移率上也會隨之改變，借此可作出分析。( 等位基因特異寡核苷酸探針雜交法。根據已知基因突變位點的核苷酸序列，人工合成兩種寡核苷酸探針一是相應于突變基因堿基序列的寡核苷酸；二是相應于正常基因堿基序的寡核苷酸，用它們分別與受檢DNA進行分子雜交。從而檢測受檢者基因是否發生突變，以及是否有新的突變類型。2、聚合酶鏈反應(PCR)PCR技術采用特異的引物，能特異地擴增出目的DNA片段。由于在基因順序中突變區兩側的堿基序列和正常基因仍然相同。因此。根據待測基因兩端的DNA順序設計出一對引物，經PCR反應將目的基因片斷擴增出來，即可進一步分析判斷致病基因的存在與否，并了解其變異的形式。相同長度的單鏈DNA基因堿基序列不同，甚至單個堿基不同，都可能形成不同的空間構象，從而在電泳時泳動速率不同。PCR產物變性后，經聚丙烯酰胺凝膠電泳，正常基因和變異基因的遷移位置不同，借此可分析確定致病基因的存在，這就是PCR/單鏈構象多態性分析。3.基因芯片生物芯片技術是近年發展起來的分子生物學與微電子技術相結合的核酸分析檢測技術。最初的生物芯片技術主要目標是用于DNA序列測定、基因表達譜鑒定和基因突變體檢測和分析，所以又稱為DNA芯片或基因芯片技術。由于目前這一技術已擴展至免疫反應、受體結合等非核酸領域，出現了蛋白質芯片、免疫芯片、細胞芯片、組織芯片等，所以改稱生物芯片技術更符合發展趨勢。4.基因測序分離出有關基因，測定出堿基排列順序，找出其變異所在，這是最為確切的基因診斷方法。對于在染色體上的一個較大的基因來說，突變的種類既有刪除突變、又有重復突變、還有很多的點突變。對于很大的基因來說測序是很困難的、用基因芯片技術需要用到昂貴的儀器、而且操作繁瑣不適用于大規模推廣、探針方法不適于檢測刪除和重復突變，PCR 方法無法檢測點突變。
發明內容
本發明目的在于提供一種多基因突變位點的實時PCR基因檢測芯片及其檢測方法，解決了現有技術中不能對大基因的多個基因突變位點、較大基因的外顯子刪除、重復和點突變的檢測等問題。為了解決現有技術中的這些問題，本發明提供的技術方案是一種多基因突變位點的實時PCR基因檢測芯片，其特征在于所述基因檢測芯片包括多孔PCR板，所述多孔PCR板的孔內設置有PCR反應體系，所述PCR反應體系包括用于特異性擴增目標基因靶向序列的若干個引物對、熒光探針，所述引物對含有目標基因外顯子中至少15個連續的核苷酸構成的連續核苷酸序列；所述熒光探針在PCR擴增時熒光探針的熒光分子發射熒光信號。優選的，所述目標基因選自肌營養不良蛋白基因(dystrophin)、腓骨肌萎縮癥 PMP22、MPZ、SIMPLE 基因。優選的，所述引物為SEQ ID No 37 208序列之一的正向引物或反向引物；所述熒光探針具有SEQ ID No 209 294之一的連續核苷酸序列。優選的，所述PCR反應體系還包括PCR緩沖液、dNIPs、Gold Taq酶，所述PCR反應體系終濃度組成為
PCR緩沖液終濃度1 5X;
dNTPs0. 01 1. 5mM ；
引物終濃度為0.01 2μ M ； Gold Taq DNA 聚合酶 0. 01 1. OU/μ L ；
MgCl2終濃度為2 3mM ；
熒光探針1 3X。 優選的，所述PCR反應體系終濃度組成為 PCR緩沖液終濃度1 5X;
dNTPs0. 1 0. 5mM ；
引物
Gold Taq DNA 聚合酶 MgCl2 熒光探針
終濃度為0. 1 0. 5 μ M ； 0. 01 1. ου/μ L ； 終濃度為2 3mM ； 1 2X。
優選的，所述熒光探針選自Taqman探針；所述PCR緩沖液包括Tris. cl，氯化鉀， 硫酸銨，氯化鎂；_20°C下pH值在8. 0-9. 0間。優選的，所述多孔PCR板為96孔PCR板或384孔PCR板；PCR板的孔內設置不同的引物和熒光探針。本發明還提供了一種實時檢測目標基因外顯子多位點突變的方法，其特征在于所述方法包括以下步驟(1)設計并選取包括含有目標基因外顯子中至少15個連續的核苷酸構成連續核苷酸序列構成的若干個引物和熒光探針對分別置于多孔PCR板的不同孔內形成基因檢測
-H-* LL
心片；
5
(2)提取模板DNA，將模板DNA加入基因檢測芯片多孔PCR板的每個孔內對模板 DNA中目標基因進行PCR擴增；(3)根據qPCR檢測對擴增后的目標基因的基因突變位點。優選的，所述方法中模板DNA的濃度在50 IOOng/ μ L。優選的，所述方法中進行PCR反應的條件為92 97°C預變性4 15min ；92 97°C變性10 30s，56 60°C退火10 30s，70 75°C延伸15 30s，擴增35 50個循環。本發明將集中探針技術、多重PCR技術及定量PCR技術于一個微孔板上檢測較大基因的刪除、重復和點突變。本發明把檢測突變點的多對精心設計的引物、熒光探針、PCR緩沖液、dNTPs和Gold Taq酶以優化的配比混均后，點到25_30 μ 1混合液到普通96-孔PCR 板或1-5 μ 1混合液到384-孔PCR板上，批量置于冷凍干燥儀上過夜干燥，密封避光4度保存，從而制成基因探針芯片產品。使用時，加入1_5μ 1的DNA溶液，震動混均后，放在qPCR 儀上即可進行分析。所得芯片穩定性很好，操作簡單，快速，室溫保存三個月熒光信號還保留90%以上。每個孔可針對不同的突變或SNP，它們有可能是同一個基因的也有可能是不同基因的。由于本發明采用的基因檢測芯片上每塊板上的所有探針及引物都進行優化，優化后所有孔的qPCR反應條件是一樣的，故可同時對多個基因進行篩查。由于采用熒光實時定量 PCR儀，所以本發明可同時對單位點突變、外顯子丟失重復進行檢測。所述的PCR引物，用化學合成或PCR擴增獲得的突變位點兩端10-50個序列的模板，以及與之配對的反向序列。所述的PCR引物為SEQ ID No :37 208序列之一的正向引物或反向引物形成的引物對；所述熒光探針具有SEQ ID No 209 294之一的連續核苷酸序列。所述的DNA模板，用常規方法從患者組織中提取獲得的DNA。所述的患者組織，包括外周血細胞、外周血血清或血漿、體液、腔道的脫落物、糞便、病變組織、腫瘤組織，以及用這些組織制成的石蠟塊、石蠟切片、冰凍切片等。優選的，本發明的檢測目標基因突變的方法，包括以下步驟(1)在血液包括細胞或血清或血漿、分泌物或是組織中提取核酸樣本(2)用上述的基因檢測芯片和多個引物，以步驟(1)提取的核酸、陰性對照為模板，進行實時定量PCR檢測。在本發明中，術語“引物”是指一種寡核苷酸，可以是天然的也可以是合成，它可以作為在一定條件下誘發DNA合成的起始點，在上述條件下可以誘發合成與核酸鏈相互補的引物擴增產物，即在四種不同的三磷酸脫氧核糖核酸及一種聚合試劑(即DNA聚合酶或逆轉錄酶)存在下，在一種合適的緩沖液并在合適的溫度下進行上述合成。優選的引物是單股寡脫氧核糖核苷酸。引物的合適長度取決于該引物的設計用途，但在一般在15 25個核苷酸之間，較短的引物分子通常需要較低的溫度，從而與模板形成充分穩定的雜交復合物。 引物不必反應模板的準確序列，但必須充分互補，已與模板雜交并引發DNA合成。引物設計遵循以下原則①引物應用核酸系列保守區內設計并具有特異性。②產物不能形成二級結構。③引物長度一般在15 30堿基之間。④G+C含量在40% 60% 之間。⑤堿基要隨機分布。⑥引物自身不能有連續4個堿基的互補。⑦引物之間不能有連續4個堿基的互補。⑧引物5'端可以修飾。⑨引物3'端不可修飾。⑩引物3'端要避開密碼子的第3位。弓Li殳if 白勺I^ft1* Primer Premier 5, Beacon Designer 7。本發明所用引物通過亞磷酰胺三酯法合成，亞磷酰胺三酯法是將DNA固定在固相載體上完成DNA鏈的合成的，合成的方向是由待合成引物的3'端向5'端合成的，相鄰的核苷酸通過3' -5'磷酸二酯鍵連接。具體方法如下1、將預先連接在固相載體CPG上的活性基團被保護的核苷酸與三氯乙酸反應，脫去其5'-羥基的保護基團DMT，獲得游離的 5'-羥基。2、合成DNA的原料，亞磷酰胺保護核苷酸單體，與活化劑四氮唑混合，得到核苷亞磷酸活化中間體，它的3'端被活化，5'-羥基仍然被DMT保護，與溶液中游離的5'-羥基發生縮合反應。3、帶帽(capping)反應，縮合反應中可能有極少數5 ‘-羥基沒有參加反應(少于2% )，用乙酸酐和1-甲基咪唑終止其后繼續發生反應，這種短片段可以在純化時分離掉。4、在氧化劑碘的作用下，亞磷酰形式轉變為更穩定的磷酸三酯。經過以上四個步驟，一個脫氧核苷酸被連接到固相載體的核苷酸上。再以三氯乙酸脫去它的5'-羥基上的保護基團DMT，重復以上步驟，直到所有要求合成的堿基被接上去。最后通過氨水高溫處理，連接在CPG上的引物被切下來，通過OPC，PAGE等手段純化引物。相對于現有技術中的方案，本發明的優點是經試驗證實，本發明檢測方法對于較大基因的突變檢出率達到98%以上。
下面結合附圖及實施例對本發明作進一步描述圖1為本發明實施例進行模板DNA的量優化時擴增的電泳圖；圖2為本發明實施例18個外顯子擴增的電泳圖；圖3是對96個平行樣品的重復性實驗結果；圖4是對10到101°拷貝的靈敏度實驗結果。
具體實施例方式以下結合具體實施例對上述方案做進一步說明。應理解，這些實施例是用于說明本發明而不限于限制本發明的范圍。實施例中采用的實施條件可以根據具體廠家的條件做進一步調整，未注明的實施條件通常為常規實驗中的條件。實施例1肌營養不良蛋白基因(dystrophin)的突變檢測1、引物的合成和排布本實施例采用96孔板的基因突變檢測芯片設計，其引物探針是通過primer 3 plus 在線軟件進行設計(http://www. bioinformatics. nl/cgi_bin/primer3plus/ primer3plus. cgi)，并在 UCSC 數據庫(http //genome, ucsc. edu/)驗證其特異性。弓丨物在96孔板上的排布情況如表1表1 96孔板上引物排布設計
權利要求
1.一種多基因突變位點的實時PCR基因檢測芯片，其特征在于所述基因檢測芯片包括多孔PCR板，所述多孔PCR板的孔內設置有PCR反應體系，所述PCR反應體系包括用于特異性擴增目標基因靶向序列的若干個引物對、熒光探針，所述引物對含有目標基因外顯子中至少15個連續的核苷酸構成的連續核苷酸序列；所述熒光探針在PCR擴增時熒光探針的熒光分子發射熒光信號。
2.根據權利要求1所述的多基因突變位點的實時PCR基因檢測芯片，其特征在于所述目標基因選自肌營養不良蛋白基因(dystrophin)。
3.根據權利要求1所述的多基因突變位點的實時PCR基因檢測芯片，其特征在于所述引物為SEQ ID No :37 208序列之一的正向引物或反向引物；所述熒光探針具有SEQ ID No 209 294之一的連續核苷酸序列。
4.根據權利要求1所述的多基因突變位點的實時PCR基因檢測芯片，其特征在于所述 PCR反應體系還包括PCR緩沖液、dNTPs、Gold Taq酶，所述PCR反應體系終濃度組成為PCR緩沖液終濃度1 5 X ；dNTPs 0. 01 1. 5mM ；引物終濃度為0. 01 2 μ M ;Gold Taq DNA聚合酶 0. 01 1. OU/μ L ;MgCl2 終濃度為2 3mM ；熒光探針 1 3X。
5.根據權利要求4所述的多基因突變位點的實時PCR基因檢測芯片，其特征在于所述 PCR反應體系終濃度組成為PCR緩沖液終濃度1 5 X ；dNTPs 0. 1 0. 5mM ；引物終濃度為0. 1 0. 5 μ M ； Gold Taq DNA聚合酶 0. 01 1. OU/μ L ;MgCl2 終濃度為2 3mM ；熒光探針 1 2X。
6.根據權利要求1所述的多基因突變位點的實時PCR基因檢測芯片，其特征在于所述熒光探針選自Taqman探針；所述PCR緩沖液包括Tris . cl，氯化鉀，硫酸銨，氯化鎂； -20°C 下 pH 值在 8. 0-9.0 間。
7.根據權利要求1所述的多基因突變位點的實時PCR基因檢測芯片，其特征在于所述多孔PCR板為96孔PCR板或384孔PCR板；每個PCR板的孔內設置不同的引物和熒光探針，且多孔PCR板每個孔的PCR反應條件相同。
8.一種實時檢測目標基因外顯子多位點突變的方法，其特征在于所述方法包括以下步驟(1)設計并選取包括含有目標基因外顯子中至少15個連續的核苷酸構成連續核苷酸序列構成的若干個引物和熒光探針對分別置于多孔PCR板的不同孔內形成基因檢測芯片；(2)提取模板DNA，將模板DNA加入基因檢測芯片多孔PCR板的每個孔內對模板DNA中目標基因進行PCR擴增；(3)根據qPCR檢測對擴增后的目標基因的基因突變位點。
9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于所述方法中模板DNA的濃度在50 IOOng/μ L0
10.根據權利要求8所述的方法，其特征在于所述方法中進行PCR反應的條件為92 97°C預變性4 15min ；92 97°C變性10 30s，56 60°C退火10 30s，70 75°C延伸15 30s，擴增；35 50個循環。
全文摘要
本發明公開了一種多基因突變位點的實時PCR基因檢測芯片及其檢測方法，所述基因檢測芯片包括多孔PCR板，所述多孔PCR板的孔內設置有PCR反應體系，所述PCR反應體系包括用于特異性擴增目標基因靶向序列的若干個引物對、熒光探針、PCR緩沖液、dNTPs、GoldTaq酶，所述引物對含有目標基因外顯子中至少15個連續的核苷酸構成的連續核苷酸序列；所述熒光探針在PCR擴增時熒光探針的熒光分子發射熒光信號。該方法對于較大基因的突變檢出率達到98%以上。
文檔編號C12Q1/68GK102424833SQ201110231149
公開日2012年4月25日 申請日期2011年8月12日 優先權日2011年8月12日
發明者楊林, 楊楠, 艾洪新 申請人:楊林, 楊楠