專利名稱：基于rt-pcr測定混合肉制品中特定肉類成分含量的方法
技術領域：
本發明涉及食品檢驗和生物技術領域，具體地說，涉及一種基于RT-PCR測定混合肉制品中特定肉類成分含量的方法。
背景技術：
食品"摻雜使假"一直是消費者關注的焦點問題之一，有些不法企業和商家為了降低成本，在肉制品加工過程中以豬肉冒充牛羊肉，或以其它低價肉替代高價肉而未在標簽上注明。這不僅嚴重侵害了消費者利益，而且如果清真食品中摻有豬肉成分還會涉及到民族和宗教等問題，造成惡劣的社會影響。此外，流行病學研究證明飼料中的動物源性成分是造成“瘋牛病”等神經系統疾病傳播的主要因素。目前，用于肉種成分鑒定的技術大都建立在對蛋白質結構與DNA序列特異性分析的基本上，包括酶聯免疫(ELISA)、聚合酶鏈式反應(PCR)、電泳、色譜、生物傳感分析等技術。其中Taqman實時熒光PCR(Taqman RT-PCR)法在靈敏度、準確性和重復性等重要性能參數上無可比擬的優勢，成為該領域的主流技術，是作為仲裁方法和司法鑒定的理想技術類型，是現行國家和行業標準中指定的方法之一。然而，現有的研究大多集中在對飼料中豬、牛、羊等動物源性成分的定性檢測上， 而用于食品摻假鑒別，特別是涉及有關核酸成分定量檢測技術的研究較為滯后。單純的定性檢測已不能滿足需求，如在肉、奶等食品“摻雜使假”案件的處理中，如何判定摻假成分是添加還是污染所致，如何確定摻假嚴重程度都需要有可靠的定量技術作為依托。生物樣品的復雜性，如動物種別、年齡、性別、器官、肌肉類型差別等，導致DNA提取總量和擴增靶序列模板總量差異，給標準樣品的選定和制備造成困難。因此急需系統誤差小、可信度高的食品摻假行為性質判定技術的出現。
發明內容
本發明的目的是提供用于檢測混合肉制品中豬肉成分含量的實時熒光PCR豬特異性寡核苷酸引物和探針以及脊椎動物通用寡核苷酸引物和探針。本發明的另一目的是提供一種基于RT-PCR測定混合肉制品中特定肉類，特別是豬肉成分含量的方法。本發明的進一步目的是提供含有脊椎動物通用寡核苷酸引物和探針以及豬特異性寡核苷酸引物和探針的檢測試劑盒及其應用。為了實現本發明目的，本發明的一種脊椎動物通用寡核苷酸引物和探針，其是根據脊椎動物線粒體DNA(16s rDNA)上的保守序列設計的，上游引物為5，-TACGACCTCGATGTTGGATCA-3，；下游引物為5，-AGATAGAAACCGACCTGGAT-3，；探針為5，-F-CCGGTCTGAACTCAGATCACGTAGGA-M-3，；其中，F為熒光報告基團，M 為
熒光淬滅基團。
本發明還提供一種基于RT-PCR測定混合肉制品中特定肉類成分含量的方法，包括以下步驟1)根據上述脊椎動物通用寡核苷酸引物和探針設計待測肉類的特異性引物和探針，該待測肉類的特異性引物和探針序列是提供該待測肉類來源的動物的保守序列，且該待測肉類的特異性引物和探針與權利要求1所述的引物和探針的Tm值、擴增片段長度和擴增效率相似度為97%以上；所述探針的5’端連有熒光報告基團，3’端連有熒光淬滅基團；2)以該待測肉類的純肉樣品的基因組DNA為模板，稀釋至不同濃度梯度，采用步驟1)設計的引物和探針以及上述脊椎動物通用寡核苷酸引物和探針分別進行RT-PCR擴增；然后以Ig(樣品濃度)為橫坐標，以(ct_#s-ctM)為縱坐標，繪制標準曲線，確定標準曲線的斜率為Ic1、截距SC1 ；3)以混合肉制品的基因組DNA為模板，采用步驟1)設計的引物和探針以及上述脊椎動物通用寡核苷酸引物和探針分別進行RT-PCR擴增，得到(；__鄉和Ctjlffl'，通過下式
計算得到該混合肉制品中待測肉類的成分百分含量
權利要求
1.脊椎動物通用寡核苷酸引物和探針，其特征在于， 上游引物為5’ -TACGACCTCGATGTTGGATCA-3’ ； 下游引物為5，-AGATAGAAACCGACCTGGAT-3，；探針為5，-F-CCGGTCTGAACTCAGATCACGTAGGA-M-3，;其中，F為熒光報告基團，M為熒光淬滅基團。
2.一種基于RT-PCR測定混合肉制品中特定肉類成分含量的方法，其特征在于，包括以下步驟1)根據權利要求1所述的脊椎動物通用寡核苷酸引物和探針設計待測肉類的特異性引物和探針，該待測肉類的特異性引物和探針序列是提供該待測肉類來源的動物的保守序列，且該待測肉類的特異性引物和探針與權利要求1所述的引物和探針的Tm值、擴增片段長度和擴增效率相似度為97%以上；所述探針的5’端連有熒光報告基團，3’端連有熒光淬滅基團；2)以該待測肉類的純肉樣品的基因組DNA為模板，稀釋至不同濃度梯度，采用步驟1) 設計的引物和探針以及權利要求1所述的引物和探針分別進行RT-PCR擴增；然后以Ig(樣品濃度)為橫坐標，以(Ct_#s-Ctjlffl)為縱坐標，繪制標準曲線，確定標準曲線的斜率為 Ic1、截距為C1 ；3)以混合肉制品的基因組DNA為模板，采用步驟1)設計的引物和探針以及權利要求1 所述的引物和探針分別進行RT-PCR擴增，得到和Ctjlffl‘，通過下式計算得到該混合肉制品中待測肉類的成分百分含量
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述混合肉制品為混合生肉制品或混合熟肉制品。
4.權利要求2或3所述的方法在測定混合肉制品中豬、牛、羊、雞、鴨、驢、兔、鹿、狗或魚肉成分含量中的應用。
5.豬特異性寡核苷酸引物和探針，其特征在于， 上游引物為5’ -ATCTGAATCAATGCAACAGTACAT-3，； 下游引物為5，-TGATAGTGAGTCGGAGAAGAATGT-3，； 5’ -GAACTAGTAGGGGTGCTGATAGTG-3，；或5’ -ATTAAGGCTGTTTTCGCCTAGT-3’ ；探針為5，-F-TCTCCTCATTAGCCTGATCAGTCTATCCC-M-3，；其中，F 為熒光報告基團，M 為熒光淬滅基團。
6.根據權利要求5所述的引物和探針，其特征在于， 所述上游引物為5，-ATCTGAATCAATGCAACAGTACAT-3，； 所述下游引物為5，-TGATAGTGAGTCGGAGAAGAATGT-3，；所述探針為5，-FAM-TCTCCTCATTAGCCTGATCAGTCTATCCC-TAMRA-3，。
7.一種基于RT-PCR測定混合肉制品中豬肉成分含量的方法，其特征在于，包括以下步驟1)以純豬肉樣品的基因組DNA為模板，稀釋至不同濃度梯度，采用權利要求6所述的引物和探針以及權利要求1所述的引物和探針分別進行RT-PCR擴增；然后以Ig(純豬肉樣品濃度)為橫坐標，以(ctm_-ct_")為縱坐標，繪制標準曲線，確定標準曲線的斜率為 k2、截距為C2 ；2)以混合肉制品的基因組DNA為模板，采用權利要求8所述的引物和探針以及權利要求1所述的引物和探針分別進行RT-PCR擴增，得到Ctjlffl‘“，通過下式計算得到該混合肉制品中豬肉的成分百分含量
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，所述混合肉制品為混合生肉制品或混合熟肉制品。
9.含有權利要求1所述脊椎動物通用寡核苷酸引物和探針以及權利要求6所述豬特異性寡核苷酸引物和探針的檢測試劑盒。
10.權利要求9所述的試劑盒在測定混合肉制品中豬肉成分含量中的應用。
全文摘要
本發明涉及基于RT-PCR測定混合肉制品中特定肉類，特別是豬肉成分含量的方法。本發明提供了檢測混合肉制品中豬肉成分含量的實時熒光PCR豬特異性寡核苷酸引物和探針以及脊椎動物通用寡核苷酸引物和探針。另外，本發明還提供了含有上述豬特異性引物和探針以及脊椎動物通用引物和探針的檢測試劑盒。采用本發明方法能夠簡便、快捷、準確地檢出生肉或熟試樣中豬源性DNA成分含量。本發明建立在豬特異性引物體系與通用引物體系擴增曲線的相關關系上，具有較高的準確性和抗干擾能力。此外，本發明具有較強的可移植性，通過更換特異性引物體系可檢測混合肉樣中其它物種成分的含量。
文檔編號C12N15/11GK102296111SQ20111022435
公開日2011年12月28日 申請日期2011年8月5日 優先權日2011年8月5日
發明者喬曉玲, 周彤, 曲超, 李家鵬, 楊君娜, 田寒友, 申思, 陳文華 申請人:中國肉類食品綜合研究中心