人乳頭狀瘤病毒16型三肽疫苗的篩選和驗證及持續(xù)表達hpv16e5,e6,e7的腫瘤動物模型...的制作方法

專利名稱：人乳頭狀瘤病毒16型三肽疫苗的篩選和驗證及持續(xù)表達hpv16 e5,e6,e7的腫瘤動物模型 ...的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及人乳頭狀瘤病毒(Human pappilomavirus, HPV) 16型三肽疫苗的篩選和驗證及持續(xù)表達HPV16 E5，E6，E7的腫瘤動物模型的構建。其技術特征在于針對抗原力口工相關轉(zhuǎn)運子(transporter associated with antigen processing, TAP)設計 HPVl6 E5，E6，E7蛋白的主要組織相容性復合物I (MHC- I )抗原結合表位，利用生物信息學分析平臺篩選出一致性較高、特異性及親和力較強的HPV16 E5，E6，E7三肽作為研究對象制備 HPV16多肽疫苗，從而獲取對HPV16陽性腫瘤兼具預防和治療雙重作用的疫苗；同時，通過腺相關病毒表達系統(tǒng)將HPV16 E5穩(wěn)定的整合到TC-I細胞中，再將改造后的TC-I細胞注入 C57BL/6小鼠體內(nèi)，可以成功成瘤，為研究HPV16相關的疾病制造了有效而又特異的動物模型。發(fā)明內(nèi)容屬于腫瘤免疫治療領域。
背景技術：
宮頸癌高居全球婦女癌癥死亡率中的第二位，在一些發(fā)展中國家由于缺乏合適的篩查方法，甚至居于首位，嚴重威脅婦女的健康和生命。WHO資料顯示，全球每年宮頸癌的新發(fā)病例約為50萬例，其中80%以上發(fā)生在發(fā)展中國家。我國是宮頸癌的高發(fā)國家之一，每年發(fā)病率為14. 6/10萬，新增病例約15萬，占全世界新發(fā)病例數(shù)的1/3。近年，宮頸癌發(fā)病率逐年上升并趨于年輕化。然而目前常規(guī)的腫瘤治療手段尚無法從根本上清除惡性腫瘤，腫瘤的徹底根治需要不斷的革新。這種需要在宮頸癌的治療中尤其明顯，早期宮頸癌的治療主要為根治性全子宮切除或術前輔以新輔助化療，晚期宮頸癌則主要為放射治療，這兩種方法都不可避免地部分或完全破壞了女性生殖道，無法生育、性生活喪失或不滿意成為不可忽視的后遺癥， 宮頸癌發(fā)病年輕化的特點使得這種矛盾在近年顯得十分突出。對新型治療手段的需求迫使人們不得不從分子水平尋找靶點。隨著腫瘤發(fā)病內(nèi)在分子機制逐漸明了，腫瘤分子醫(yī)學理論和方法學的突破引發(fā)了一系列發(fā)展新型腫瘤治療模式的嘗試，大量分子靶點特異性抗癌化合物進入臨床試用，標志著腫瘤治療的突破到了一個關鍵的轉(zhuǎn)折點，并已獲得階段性成果，初步凸顯出未來腫瘤問題解決的基本輪廓，其最為核心的解決方法之一就是要從腫瘤繁復的基因調(diào)控網(wǎng)絡中分解出最為關鍵的分子靶標，實施分子靶向治療。截止至2001年底，獲美國FDA批準進入臨床實驗階段的分子治療品種已超過三千種，包括細胞傳導阻斷劑、血管生成抑制劑、腫瘤疫苗和單克隆抗體，為腫瘤問題的最終解決帶來了新的希望。可以說，未來人類腫瘤的有效控制在根本上依賴分子治療的發(fā)展完善。2008年美國FDA批準宮頸癌疫苗“加德西”在美國上市，是人類研制成功的第一種宮頸癌疫苗，是一種主要針對6型、11型、16型和18型HPV 的多價預防性預苗。但該疫苗有以下的不足之處①預防作用較好但治療作用甚微，對于已經(jīng)感染HPV的患者療效不明顯；②對于那些長期持續(xù)感染HPV的患者單純的預防性治療無法解決其實際問題，特異性的治療性疫苗研發(fā)迫在眉睫；③對于術后復發(fā)的宮頸疾病患者多為HPV整合感染所致，針對Ll的預防性疫苗對整合后的HPV感染無能為力，一個針對HPV 的兼具預防和治療雙重作用的疫苗急待研發(fā)。宮頸癌病因?qū)W研究表明人乳頭瘤病毒(HPV)感染是宮頸癌首要致癌因素和重要啟動因子，幾乎100%宮頸癌組織有高危型HPV DNA表達。HPV屬于乳頭多瘤空泡病毒科乳頭瘤病毒屬，是由DNA核心和蛋白衣殼組成的無包膜DNA病毒，衣殼由主要(Li)和次要 (L2)衣殼蛋白組成。HPV具有明顯的種屬特異性，它們不能在動物體內(nèi)感染，也不能作體外細胞培養(yǎng)。不同型別的HPV基因結構基本相似，由三個基因區(qū)組成，按其功能可分為早期區(qū) (E區(qū))、晚期區(qū)(L區(qū))和上游調(diào)節(jié)區(qū)⑴冊)。早期區(qū)含有6個開放閱讀框(ORF)，其中有直接惡性潛能的E5、E6、E7基因主要與病毒細胞惡性轉(zhuǎn)化功能及致癌性有關。在HPV感染之初，在疾病發(fā)生的階段，E5通過下調(diào)凋亡相關因子P21的表達和作用于表皮生長因子受體等途徑導致細胞的生長加快甚至是惡性增殖；E6不僅通過結合并降解p53從而導致細胞周期失控，而且能激活端粒酶使細胞永生化；E7則通過與控制細胞周期有關的腫瘤抑制蛋白Rb的相互作用，使細胞周期失控而發(fā)生永生化；有研究進一步揭示，在HPV感染初期E5 能擴大或加強E6和E7的表達和與之相關的惡性作用，并且這種輔助作用是不可缺少的， 特別在E7所調(diào)控的細胞惡性轉(zhuǎn)化方面，E5扮演著重要的角色。E5、E6、E7三種癌蛋白的表達是維持腫瘤細胞處于惡性轉(zhuǎn)化狀態(tài)所必須的，與宮頸癌的發(fā)生及發(fā)展有極密切聯(lián)系。另外，HPV 16型是最常見的高危型別，我國的流行病學表明宮頸癌患者中HPV 16型陽性率達到50% -87%。針對目前國外的研究，E6，E7多肽疫苗一直都是熱點，但大多數(shù)的實驗結果只是在一定程度上達到治療目的，鮮有完全根治的報道。最近的研究進一步發(fā)現(xiàn)，除E6， E7外，HPV E5蛋白也是HPV感染之初導致宮頸癌的重要環(huán)節(jié)，因此，我們以疾病的源頭為起點，同時針對E5，E6，E7三個靶點制備疫苗，阻斷目前已知的HPV全部的直接導致細胞惡性轉(zhuǎn)化的因素，從而希望能以此為契機徹底杜絕HPV的致病潛能。

發(fā)明內(nèi)容
基于以上技術背景和重大的醫(yī)療需求，本發(fā)明將公開一種針對16型HPV E5，E6， E7三個靶點制備的多肽疫苗，我們希望通過這種兼具預防和治療功效的疫苗來有效解決目前HPV16陽性腫瘤治療的困難與不足，同時開辟一條免疫方法治療惡性腫瘤的康莊大道。宮頸癌疫苗的研究最早可追溯到20世紀70年代，在90年代初蓬勃興起。從蛋白疫苗，多肽疫苗，核酸疫苗到聯(lián)合疫苗，多種形式的疫苗各具特色。與其他可能的治療性疫苗相比，多肽疫苗安全性高，制備容易，免疫源性特異，并且毒副作用較小。同時，考慮到多肽片段短，抗原性可能稍弱，我們在實驗中加用了 CpG序列作為免疫增強劑。CpG序列(CpG motifs)是指一類以非甲基化的胞嘧啶和鳥嘌呤核苷酸(CpG)為核心的寡聚脫氧核糖核苷酸(oligodeoxynucleotides，0DN)，其堿基排列大多遵循以下規(guī)律5，2 PurPur CG Pyr Pyr23’，即5’端為2個嘌呤，3’端為2個嘧啶.研究表明，這種序列可激活多種免疫效應細胞，因此又被稱為免疫刺激 DNA 序列(Immuno-stimulatory DNA sequence, ISS).本研究中采用2004年Mmsin等_報道的針對抗原加工相關轉(zhuǎn)運子(TAP)結合生物信息學，分析HPV16 E5，E6，E7蛋白與主要組織相容性復合物I類分子(MHC- I )的抗原結合表位，聯(lián)合二核苷酸胞嘧啶(CpG)佐劑，研制兼具預防和治療雙重作用的HPV16多肽疫苗，有望成為新一代強有力的宮頸癌靶向治療和預防的方法。
本研究中，由于E5靶點的存在，需要穩(wěn)定表達E5的成瘤細胞系來檢測疫苗的針對性，同時更好的模擬天然HPV感染時的情況，我們選擇了腺相關病毒表達系統(tǒng)將HPV16E5 穩(wěn)定的整合到TC-I的基因組中，從而建立符合本實驗要求的動物模型。腺相關病毒 (adeno-associated virus, AAV)載體源于非致病的野生型腺相關病毒，由于其安全性好、 宿主細胞范圍廣(分裂和非分裂細胞)、免疫源性低，在體內(nèi)表達外源基因時間長以及可感染分裂期和非分裂期的宿主細胞等特點，被視為繼腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒之后最有前途的基因轉(zhuǎn)移載體之一，在世界范圍內(nèi)的基因治療和疫苗研究中得到廣泛應用。AAV則因其獨特的生物學性狀顯示出在基因治療中的巨大潛力包括①AAV能轉(zhuǎn)導分裂期細胞和非分裂期細胞 ’②AAV具有廣泛的趨向性；③AAV能整合至宿主染色體具有建立長期表達的能力； ④AAV是一種非致病性病毒；⑤AAV不會產(chǎn)生細胞介導的免疫反應。本研究中成功利用AAV 構建了穩(wěn)定表達HPV16E5的TC-I細胞，并在C57BL/6小鼠成功成瘤，為研究HPV16相關的疾病制造了很好的動物模型，為深入探討HPV相關疾病的分子免疫學機制和治療方法提供了有力保障。為此，本發(fā)明提出的宮頸癌“三肽”疫苗(針對E5，E6，E7三靶點)，在國內(nèi)外尚無相關報道，且在本研究中我們發(fā)現(xiàn)了很有效的三肽組合，可以很好的預防和治療HPV16陽性的腫瘤，甚至可以完全的無瘤生存。同時，我們成功構建了持續(xù)表達HPV16E5，E6，E7的免疫全能動物腫瘤模型，也無同類報道，它將為研究HPV16相關腫瘤提供有效而逼真的實驗平臺。本發(fā)明達到了以下效果1、成功構建持續(xù)表達HPV16 E5，E6，E7的腫瘤動物模型通過腺相關病毒表達系統(tǒng)將HPV16 E5穩(wěn)定的整合到TC-I細胞中，再將改造后的TC-I細胞注入C57BL/6小鼠體內(nèi)， 可以成功成瘤，為研究HPV16相關的疾病制造了有效而又特異的動物模型。2、腫瘤細胞系體外實驗結果表明該“三肽”聯(lián)合CpG佐劑的疫苗可誘發(fā)特異性針對HPV16陽性腫瘤細胞的免疫應答，特異性殺傷靶細胞，從而抑制HPV16型陽性的腫瘤細胞的增殖和生長，誘導其凋亡，進而預防腫瘤的發(fā)生，阻斷腫瘤的發(fā)展。3、腫瘤動物模型的體內(nèi)研究證實通過腫瘤局部注射的途徑給藥，該“三肽”聯(lián)合 CpG佐劑的疫苗對受試的腫瘤動物模型有顯著的治療和預防作用，阻遏腫瘤細胞成瘤、抑制侵襲，而且可以使已形成的腫瘤明顯縮?。挥行ьA防腫瘤的形成，甚至可以完全的無瘤生存，且對動物無明顯相關毒副作用。
四

附圖1 :HPV16 E5多肽片段篩選。附圖2 :HPV16 E7多肽片段篩選。附圖3 :HPV16 E6多肽片段篩選。附圖4 持續(xù)表達HPV16 E5、E6、E7的免疫全能動物腫瘤模型的構建及鑒定。附圖5 體內(nèi)外試驗對HPV16 E5、E6、E7多肽片段進一步篩選與鑒定。附圖6 體內(nèi)外試驗觀察“三肽+CPG”疫苗的免疫效應。
五具體實施方式
例1 :HPV16 E5、E6、E7多肽片段的篩選將HPV16 E5、E6和E7全長序列通過國立衛(wèi)生研究所生物信息及分子結構分析 系統(tǒng)，抗原表位預測系統(tǒng)及TAP預測系統(tǒng)進行相關分析，得到相應片段我們選擇評分較高， 親和力強，免疫源性及抗原性較好的靶位片段作為侯選片段進行下一歩的實驗室篩選。 具體 1 羊見(http://bimas. acrt. nin. gov/cgi-bin/molbio/ken_parker_comDoform) [1] (http://www. syfpeitni. de/) [2] (http://www. imtech. res. in/cgibin/tappred/) [3] 結果見圖1-31. Parker, K. C. , M. A. Bednarek, and J. E. Coligan. Scheme for ranking potential HLA—A2 binding peptides based on independent binding of individual peptide side-chains. J. Immunol. 1994 ； 152 :163-175.2. Rammensee, H. G. , J. Bachmann, N. P. N. Emmerich, et al. SYFPEITHI database for MHC ligands and peptide motifs. Immunogenetics, 1999 ；50 :213-219.3. Bhasin,M. and Raghava,G. P. S. Analysis and prediction of affinity of TAP binding peptides using cascade SVM. Protein Sci. , 2004 ；13(3),596-607例2 :構建持續(xù)表達HPV16 E5,E6, E7的腫瘤動物模型1)AAV-E5目的載體的構建用限制性內(nèi)切酶EcoR I和BAMH I分別酶切pEGFP_Cl_HPV16 E5和pAAV-MCS構 建AAV-E5重組質(zhì)粒。①酶切體系
K buffer5"1K buffer5"1
pAAV-MCS5^1pEGFP- C1-HPV16 E5 5が1
BAMH I2/ABAMH I2"1
EcoR I2fAEcoR I2 パ1
ddH2036^1ddH2036 が1混勻，37°C，2_4h或過夜，電泳分析鑒定。②膠純化(U-gene試劑盒，具體操作見第一部分2. 2. 23)③連接
5xbuffer4 u1
pEGFP- C1-HPV16 E54 ul
pAAV-MCS
T4-Ligase1 ul
ddH207 ul混勻，4°C，過夜后，電泳分析鑒定。④轉(zhuǎn)化篩選用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌DH 5a。涂板(kanamycin/IPTG/X-gel)， 進行藍白斑篩選，挑選白斑。
⑤酶切鑒定提取質(zhì)粒DNA后(博大泰克的質(zhì)粒小量提取試劑盒，操作嚴格按說明書進行)，用EcoR I和BAMH I雙酶切鑒定N1/C1-HPV 16/18E5連接是否成功。37°C，水浴過夜。⑥電泳鑒定1.2%瓊脂糖凝膠電泳。⑦將酶切后正確的克隆送序(由北京奧科公司測序)⑧對測序后正確的質(zhì)粒，進行大量提取(博大泰克的質(zhì)粒大量提取試劑盒，操作嚴格按說明書進行)，同時大量提取pAAV-RC和pHelper2)病毒的制備-三質(zhì)粒鈣磷共轉(zhuǎn)染法1.在直徑為15cm的細胞培養(yǎng)皿內(nèi)將四3細胞按1 1_1 3的比例傳代。2.待細胞至75-90%融合時進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前3小時換培養(yǎng)基(PH7. 20每升培養(yǎng)基內(nèi)加3. 0克H印es)，3.按以下方法配制鈣磷混合液1) 15cm培養(yǎng)皿中加入質(zhì)粒總量為50微克，三種質(zhì)粒比例為Phelper 25 微克RC質(zhì)粒 6. 25微克Vector 質(zhì)粒 18. 75 微克2)將質(zhì)粒加入到0. 25MCaC12中，每盤需^nl CaCl23)將配制的混合液置于漩渦震蕩器上(轉(zhuǎn)速SOO-lOOOrpm/min)，再向其中加入 2*HEBS，每盤需2ml2*HEBS，震蕩10-20秒，充分混勻后，每盤滴入混合液。4.過6-16小時后，換無血清DMEM培養(yǎng)基。5.收集病毒，步驟見下面方案3)病毒收集1.轉(zhuǎn)染后72小時吸棄培養(yǎng)基，離心800rpm*10分鐘，棄上清，留沉淀。2. PBSlOml輕輕吹打盤子里的細胞，將盤子里的細胞清洗干凈，轉(zhuǎn)至離心管， 800rpm*10分鐘離心。3.棄上清，重復步驟2。4.用PBS重懸細胞沉淀，800rpm*10分鐘離心，留取沉淀，盡可能除盡培養(yǎng)基。5.用 10mOTris+15mMNaCl (PH8. 0)或 1*PBS 溶液充分溶解細胞(lml/15cm培養(yǎng)皿。 若想滴度高可減少Pbs體積)6.放置于-80度，反復凍融3-4次。7.離心1000rpm*10分鐘，取上清-80度保存。8. CsCl2梯度離心法大量純化提取病毒，透析去除小分子DNA純化病毒。VLB法測定病毒吸光度(病毒顆粒)，分裝病毒，于-80°C凍存。4)病毒滴度測定TCID50法進行MOI檢測，以確定具有活性的病毒顆粒。將293細胞以2 X IO4/孔接種96孔板，待細胞達到70-80%融合時進行TCID5tl測定。用Iml含5%胎牛血清的DMEM以倍比稀釋法依次稀釋病毒至KT1-IO^W 10_3開始，依次將10-3-10-1(1病毒液100 μ 1加入 96孔板1-8行，第11、12列設為陰性對照，每孔設10個復孔，連續(xù)觀察12-14天后根據(jù)每孔是否出現(xiàn)CPE效應計算TCID5tl值以PFU/ml表示。5).病毒轉(zhuǎn)染起始MOI的確定對數(shù)生長期的TC-I細胞以1 X IO5/孔接種6孔板，常規(guī)培養(yǎng)24h至70-80%融合， 以倍比稀釋法分別加入含0. 01,0. 1、1、10、100M0I的AAV-GFP病毒液(以無血清DMEM稀釋， 終體積0. 5ml)轉(zhuǎn)染細胞，3-4h后加入1. 5ml DMEM完全培養(yǎng)基終止轉(zhuǎn)染。繼續(xù)培養(yǎng)24h后在熒光倒置顯微鏡下觀察綠色熒光強度，并經(jīng)胰酶消化后上流式細胞儀分析轉(zhuǎn)染效率，以轉(zhuǎn)染效率達50-80%的MOI值作為病毒轉(zhuǎn)染的起始MOI。6) · CPE 實驗TC-I細胞以2 X IO5/孔接種12孔板，轉(zhuǎn)染不同MOI的AAV-E5，wt-AAV和 AAV-GFP (轉(zhuǎn)染方法同上)，顯微鏡下觀察細胞病變，當0. IMOI的wt_AAV組出現(xiàn)完全CPE效應時，用PBS輕洗非貼壁細胞和細胞殘渣，1 %多聚甲醛固定lOmin，結晶紫染色，PBS洗去多余結晶紫，觀察并拍照。7).體外復制能力實驗對數(shù)生長的TC-I細胞以3X IO5/孔接種6孔板，轉(zhuǎn)染5M0I的AAV-E5，wt-AAV和 AAV-GFP (轉(zhuǎn)染方法同上)，分別于轉(zhuǎn)染后M、48、72、％h收集細胞和培養(yǎng)上清，500rpm離心 lOmin，棄上清后加入PBS 1ml，反復凍融3次，3000rpm離心10分鐘后去除細胞碎片留用上清，用TCID5tl法測定上清中病毒滴度。8). RT-PCR檢測腫瘤細胞中目的基因的表達對數(shù)生長的TC-I細胞以5 X IO5/孔接種60mm培養(yǎng)皿，常規(guī)培養(yǎng)24h后轉(zhuǎn)染IMOI 的AAV-E5，wt-AAV和AAV-GFP (方法同上)，分別在轉(zhuǎn)染后12、24、48、7池收取細胞并采用 Trizol 試劑一步法提取細胞總RNA，測定樣品吸光度值。各取2 μ g mRNA，按照逆轉(zhuǎn)錄酶 M-MLV說明書進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。取等量cDNA模板，PCR分別擴增HPV16E5基因片段并同時擴增β-actin作為內(nèi)參照。PCR產(chǎn)物用1. 5%瓊脂糖凝膠電泳后紫外燈下拍照。9). Western blot檢測腫瘤細胞中目的基因的表達對數(shù)生長的TC-I細胞以5 X IO5/孔接種60mm培養(yǎng)皿，常規(guī)培養(yǎng)24h后轉(zhuǎn)染2M0I的 AAV-E5，wt-AAV和AAV-GFP (方法同上)，分別在轉(zhuǎn)染后12、24、48、7池收取細胞并提取細胞總蛋白，考馬斯亮藍G-250染料法測定蛋白質(zhì)濃度。10%或12% SDS-PAGE膠電泳分離蛋白質(zhì)(上樣量為50yg)，轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，脫脂奶常溫封閉池，一抗(antiGFP 1 100) 4°C 孵育過夜，TBST洗膜，用相應二抗(1 1000) 37°C孵育lh，TBST洗膜，用ECL試劑盒化學發(fā)光后曝光成像，同時檢測β-actina 500)作為內(nèi)參照。10). C57BL/6 鼠接種選擇4-6周齡的C57BL/6鼠，各取對數(shù)生長期的rTC_l (AAV-E5感染之TC-I細胞) 細胞制備單細胞懸液(1 Χ 106/100 μ 1)，于每只鼠左側(cè)大腿根部接種200 μ 1。觀察其成瘤情況，同時用活體熒光成像儀，觀察腫瘤生長情況。實驗證實我們已成功構建持續(xù)表達HPV16 E5，E6，E7的腫瘤動物模型，為后續(xù)試驗建立了確實有效的操作平臺，見圖4。例3 利用體內(nèi)外試驗對HPV16 E5、E6、E7多肽片段進一步篩選與鑒定。(一 )腫瘤生長情況先將鼠隨機分為9組，各取對數(shù)生長期的rTC-Ι細胞制備單細胞懸液 (1 Χ 106/100 μ 1)，于每只鼠左側(cè)大腿根部接種200 μ 1，一周后于鼠左側(cè)大腿根部給予相應的肽制劑，CpG和生理鹽水共9組，其后，每周給一次相應的肽制劑，或CpG、或生理鹽水。 每1-2天一次，觀察瘤塊生成情況。有瘤體長出后，每周觀察并測量腫瘤大小2-3次(垂直測量腫瘤最長徑a、b)直至成瘤或治療后3-4周，以公式1/2 計算腫瘤體積。( 二)ELISA法檢測免疫因子表達A.標本的采集及保存小鼠眼球后取血標本于室溫放置2小時或4°C過夜后于IOOOxg離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)吮痉庞?20。C保存，但應避免反復凍融。B.試劑的準備和保存A).標準品的稀釋和使用。試劑盒提供2管標準品，每管10ng，每次使用1管。1.配制10，000pg/ml標準品取Iml樣品稀釋液加入標準品管內(nèi)，蓋好后靜置10 分鐘以上，然后反復顛倒/搓動以助溶解。2.配制1000pg/ml標準品取0. Iml 10，000pg/ml的標準品加入有0. 9ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻，做上標記。3.配制 500pg/ml — 15. 6pg/ml 標準品準備 6 只 Eppendorf 管，每管加 0. 3ml 樣品稀釋液，分別標記上 500pg/ml，250pg/ml，125pg/ml，62. 5pg/ml，31. 3pg/ml，15. 6pg/ml。 取0. 3ml lOOOpg/ml的標準品加入標記500pg/ml的管中，混勻后同樣取出0. :3ml，加入下一只管中。余同此類推，直到最后一只樣品管。溶解后的標準品應在12小時內(nèi)使用。B)生物素標記的抗體工作液。1.根據(jù)每孔需要0. Iml計算總的用量(實際配制時應多配制0. 1-0. 2ml)。2.按1μ ι生物素標記抗人VEGF加抗體稀釋液99 μ ι的比例配制工作液。輕輕混勻。C).親和素-過氧化物酶復合物(ABC)工作液的準備在使用前1小時內(nèi)準備。1.根據(jù)每孔需要0. Iml計算總的用量(實配時應多配制0. 1-0. 2ml)。2.按1μ t親和素-過氧化物酶復合物(ABC)加ABC稀釋液99 μ ι的比例配制工作液。輕輕混勻。C.操作程序所有試劑用前需在室溫平衡。試劑或樣品稀釋時，切不可忘記混勻。每次測都應該做標準曲線。如果估計樣品VEGF濃度> 2000pg/ml時，應在試管中將樣品用樣品稀釋液進行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。1.確定本次檢測所需的已包被抗體的酶標板孔數(shù)目，并增加1孔作為TMB空白顯色孔?？倲?shù)=樣品數(shù)+9;做雙份檢測時X2。其余重包裝好放如冰箱中。2.將 1000pg/ml,500pg/ml,250pg/ml,125pg/ml,62. 5pg/ml,31. 3pg/ml,15. 6pg/ ml的標準品各0. Iml依次加入一排7孔中，1孔只加樣品稀釋液的作為零孔。對于人血清、 體液、組織勻漿或細胞培養(yǎng)上清，每孔先加50 μ ι樣品稀釋液，再加50μ ι樣品。3.酶標板加上蓋，37°C反應120分鐘。4.反應后用自動洗板機吸去酶標板內(nèi)的液體(將自動洗板機的洗滌次數(shù)設為零再開始即可)；或甩去酶標板內(nèi)液體，再對著吸水紙拍幾下。不洗。5.將準備好的生物素抗人VEGF抗體工作液按每孔0. Iml依次加入(TMB空白顯色孔除外)。37°C反應60分鐘。6. 0. OlM TBS或0. OlM PBS洗滌3次，每次浸泡1分鐘左右。吸去或甩去多余液體。7.將準備好的ABC工作液按每孔0. Iml依次加入(TMB空白顯色孔除外)。37°C 反應30分鐘。8. 0. OlM TBS或0. OlM PBS洗滌5次，每次浸泡1_2分鐘左右。吸去或甩去多余液體。9.按每孔0. Iml依次加入TMB顯色液，37°C避光反應20_25分鐘(此時肉眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度藍色，后3-4孔差別不明顯)。10.按每孔0. Iml依次加入TMB終止液，此時藍色立轉(zhuǎn)黃色。11.用酶標儀在450nm測定0. D.值，將TMB空白顯色孔設為對照。12.所有的標準品和樣品的吸光值減去零孔的吸光值后，在坐標紙上畫出曲線，以吸光值作為縱坐標，以濃度作為橫坐標。13.根據(jù)樣品的吸光值在坐標上找出對應的濃度。在本階段試驗中，根據(jù)分子生物學篩選出的多肽片段再結合實驗室證據(jù)，我們在候選的三段多肽中各選擇了一段效應最強的片段進行下一步試驗，為三肽疫苗最有效的組合奠定基礎，見圖5。例4 體內(nèi)外試驗觀察“三肽+CPG”疫苗的免疫效應。(一)C57BL/6 鼠接種選擇4-6周齡的C57BL/6鼠，根據(jù)實驗目的分為預防和治療兩大組，每個大組又分為三肽組，二肽組，單肽組，錯構肽組，CpG組和生理鹽水組6組1)預防組先于鼠左側(cè)大腿根部給予相應的肽制劑+CpG或單純CpG或生理鹽水， 按不同的配伍將鼠隨機分為三肽組，二肽組，單肽組，錯構肽組，CpG組和生理鹽水組五組， 一周后按取對數(shù)生長期的細胞制備單細胞懸液(1 Χ 106/100 μ 1)，于每只鼠左側(cè)大腿根部接種200 μ 1，同時再給一次相應的處理，其后，每1-2天一次，觀察瘤塊生成情況。在預防組中根據(jù)實驗成瘤細胞的不同又分為Α.未轉(zhuǎn)染組(TC-I) ；B.轉(zhuǎn)染a組(AAV-E^2-TC-1)； C.轉(zhuǎn)染b組(AAV-TC-I) ；D. B16F1細胞(小鼠黑色素瘤細胞)組2)治療組先將鼠隨機分為6組，A.未轉(zhuǎn)染組(TC-I) ；B.轉(zhuǎn)染a組 (AAV-E5b2-TC-l) ；C.轉(zhuǎn)染b組(AAV-TC-I) ；D. B16F1細胞(小鼠黑色素瘤細胞)組。各取對數(shù)生長期的細胞制備單細胞懸液(IX 106/100 μ 1)，于每只鼠左側(cè)大腿根部接種200 μ 1， 一周后于鼠左側(cè)大腿根部給予相應的肽制劑+CpG，或單純CpG或生理鹽水，按不同的配伍將鼠隨機分為三肽組，二肽組，單肽組，錯構肽組，CpG組和生理鹽水組六組，其后，每周給一次相應的處理，每1-2天一次，觀察瘤塊生成情況。有瘤體長出后，每周觀察并測量腫瘤大小2-3次(垂直測量腫瘤最長徑a、b)直至成瘤或治療后3-4周，以公式1/2 計算腫瘤體積。(二)鼠脾淋巴細胞的分離培養(yǎng)1.小鼠眼球后取血后，拉頸處死小鼠，置70%酒精中浸泡5分鐘消毒，然后移入超凈臺。2.打開腹腔，無菌取出小鼠脾臟，放入盛有5-10mlDMEM不完全培養(yǎng)液的平皿中輕輕漂洗，并細心剝除脾臟周圍的結締組織。3.將脾臟移入另一個盛有5-10mlDMEM不完全培養(yǎng)液的平皿中，輕輕漂洗后置于 100目細胞篩用滴管拉碎，使脾細胞通過篩孔被擠壓入培養(yǎng)液中，反復沖洗，以取得單個細胞懸液。4.將脾細胞懸液緩緩加入到已裝有淋巴細胞分離液的IOml離心管中(脾細胞懸液與淋巴細胞分離液體積比為1 1)，然后2000rpm/min離心20分鐘；5.收集分離出的脾細胞，置于IOml的離心管內(nèi)加入DMEM不完全培養(yǎng)液吹打。取少量用于顯微鏡下計數(shù)，同時1500rpm/min離心10分鐘，棄上清；加入適量完全培養(yǎng)液(DMEM 液+10%小牛血清)，將細胞重懸，調(diào)整細胞濃度為1 X 106/ml。6.然后移入培養(yǎng)瓶，放入37°C，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。(三)淋巴細胞的腫瘤細胞毒功能檢測分別取各組的小鼠脾臟，無菌制備脾細胞懸液，低滲法除去紅細胞，PBS液洗3次， 用含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)細胞濃度2X 106/ml，以100 μ 1/孔接種于96 孔板中，作為效應細胞(effector cells, Ε)，同時計數(shù)B16調(diào)整濃度分別為lX105/ml， 2X105/ml，以每孔ΙΟΟμΙ接種于96孔板中，分別作靶細胞組(target cells, Τ)、效靶混合組，溫育^h，然后采用LDH法分別檢測殺傷率。殺傷率(％ )=(靶細胞OD值-效應細胞OD值)/靶細胞OD值X 100%(四)CFSE標記 rTC-Ι 細胞(1)將CFSE用DMSO溶解成5mmol/L的儲存液，于_20°C避光保存；(2)收集對數(shù)生長期B16F10細胞(3)用PBS洗滌后，再用PBS懸浮細胞，調(diào)整細胞濃度為5 X 106/ml ；(4)加入CFSE至終濃度為5 μ mol/L,置37°C培養(yǎng)箱，溫育IOmin ；(5)取出B16F10細胞，迅速加入等體積小牛血清中和；(6)將細胞置離心機離心，lOOOrpmdmin，收集細胞；(7)加入無血清DMEM，洗滌一次；(8)將細胞置離心機離心，lOOOrpmdmin，收集細胞；(9)再用PBS洗滌細胞2次，用PBS懸浮細胞(五)ELISP0T法檢測細胞因子分泌情況1.按1 200比例稀釋，將包被抗體加入到4°C儲存的IXPBS中，在ELISP0T平板每孔中加入100 μ 1稀釋后的包被抗體；2.置于4°C冰箱封閉過夜(16小時)；
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3.棄去包被抗體稀釋液。每孔加入200 μ 1含10%牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基清洗，放置2分鐘；4.每孔加入200 μ 1的含10%牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，室溫放置2小時；5.棄去每孔中的200 μ 1的含10%牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基；a)陰性孔在11列中加入20 μ 1含10%牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基；b)陽性孑L 在12列中力口入5 μ 1的10 μ g/ml的PMA禾口 2 μ 1的lmg/ml的 Ionomycin ；c)實驗孔實驗孔每孔加入8 μ 1的100 μ g/ml的多肽；6.每孔加入180 μ 1的1. 5 XlOVml小鼠脾細胞懸液；7. 37°C 5% CO2 孵育 24 小時；8.吸棄細胞。每孔中加入200μ 1去離子水，室溫放置5分鐘，再次加入200μ 1去離子水，室溫放置5分鐘；9.每孔用200 μ 1 IXPBST清洗3次，每次室溫放置2分鐘，棄去PBST ；10.按1 250比例稀釋，將檢測抗體加入到含10%血清的1 XPBS中，ELISP0T平板每孔加入100 μ 1稀釋后的檢測抗體；11.室溫放置2小時；12.棄去檢測抗體稀釋液。每孔用200 μ 1 IX PBST清洗，共3次，每次室溫放置2 分鐘；13.按1 100比例稀釋，將親和素-HRP加入到含10%血清的IXPBS中，ELISP0T 平板每孔加入IOOul酶聯(lián)稀釋液；
14.室溫放置1小時；
15.棄去酶聯(lián)稀釋液。每孔用200μ 1的1 XPBST清洗4次，每次放置2分鐘；
16.每孔用200μ 1的1 XPBS清洗2次，每次放置2分鐘；
17.每孔加入AEC顯色液100μ 1，室溫避光放置10 30分鐘，其間觀察是否形成
18.斑點形成后，用去離子水沖洗終止酶聯(lián)反應；
19.取下墊盤，室溫干燥過夜；
20.使用CTLELISP0T讀數(shù)儀，讀取分析數(shù)據(jù)，ELISP0T平板放入自封袋室溫保存。 本階段的試驗證實了“三肽+CPG ”疫苗有很好的體內(nèi)預防和治療效應，可以特異性
權利要求
1.一種HPV16 “三肽”聯(lián)合CpG佐劑的疫苗的篩選和驗證，其技術特征在于采用2004年Mmsin報道的針對抗原加工相關轉(zhuǎn)運子(TAP)分析多肽片段的方法結合生物信息學，篩選出評分較高的片段，再結合動物體內(nèi)外試驗得到免疫效果最強的三個片段(E5Pmd LSVSTYTSL, E6Pmd NKPLCDLLI，E7Rnd RAHYNIVTF)組合成為三肽疫苗核心。
2.制備權利要求1所述的經(jīng)分子生物學及體內(nèi)外試驗聯(lián)合篩選得到的HPV16E5、E6、E7 三肽片段本身，及其在研究HPV16相關疾病的預防和治療中的用途。
3.制備權利要求1所述的HPV16E5、E6、E7三肽片段用于腫瘤發(fā)病機制探討及基因治療中的用途。
4.一種持續(xù)表達HPV16E5，E6，E7的腫瘤動物模型的構建，其技術特征在于通過腺相關病毒表達系統(tǒng)將HPV16E5穩(wěn)定的整合到TC-I細胞中(rpAAV_HPV16E5-它在野生型AAV5 ECOR I和BAMH I酶切位點中插入外源性16型HPV E5 cDNA全長片段，其他基因組結構與野生型PAAV5完全相同)，將改造后的TC-I細胞注入C57BL/6小鼠體內(nèi)，可以成功成瘤，為研究HPV16相關的疾病制造了有效而又特異的動物模型。
5.制備權利要求4所述的重組腺相關病毒構建體的方法，其特征在于用PCR法擴增全長序列片段，并將獲得的片段裝入載體，經(jīng)測序并與NCBI數(shù)據(jù)庫比對證實為100%吻合， 而后與腺相關病毒骨架質(zhì)粒PAAV進行基因重組，構建成功含HPV16型E5基因的新載體 rpAAV-HPV16E5，rpAAV-HPV16E5質(zhì)粒與包裝載體RC和輔助質(zhì)粒Phelper共轉(zhuǎn)染293細胞， 篩選出表達16型HPV E5的重組腺相關病毒構建體。
6.制備權利要求4所述的構建持續(xù)表達HPV16E5，E6，E7的腫瘤動物模型的方法，其技術特征在于將rpAAV-HPV16E5重組腺相關病毒構建體感染TC-I細胞(rTC_l細胞)，注入C57BL/6小鼠體內(nèi)成功成瘤。
7.制備權利要求4所述的重組腺相關病毒構建體在用于腫瘤發(fā)病機制探討及基因治療中的用途。
8.制備權利要求4所述的構建持續(xù)表達HPV16E5，E6，E7的腫瘤動物模型，在研究相關疾病預防和治療中的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種人乳頭瘤病毒(HPV)16“三肽”聯(lián)合CpG佐劑疫苗的篩選和驗證，以及一種持續(xù)表達HPV16E5，E6，E7的腫瘤動物模型的構建方案。采用針對抗原加工相關轉(zhuǎn)運子(TAP)分析多肽片段的方法結合生物信息學，篩選出評分較高的多肽片段，結合體內(nèi)、外試驗得到免疫效果最強的三個片段組成三肽疫苗核心，再結合CPG佐劑，構建出兼具預防、治療雙重作用的HPV16疫苗。同時，構建了一種持續(xù)表達HPV16E5，E6，E7的腫瘤動物模型其技術特征在于通過腺相關病毒表達系統(tǒng)將HPV16E5穩(wěn)定的整合到TC-1細胞中，將改造后的TC-1細胞注入C57BL/6小鼠體內(nèi)，可以成功成瘤。
文檔編號C12N15/864GK102343103SQ201110218028
公開日2012年2月8日 申請日期2011年7月26日 優(yōu)先權日2011年7月26日
發(fā)明者盧運萍, 廖書杰, 王世宣, 蔣學鋒, 韓志強, 馬丁 申請人:馬丁