專利名稱：一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的培育轉(zhuǎn)基因吳屯楊植株的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的培育轉(zhuǎn)基因吳屯楊植株的方法。
背景技術(shù)：
楊樹是重要的速生用材樹種，在以往的研究中多以提高楊樹產(chǎn)量為目標，忽視了對其抗逆性等性狀的改良。同時，環(huán)境不斷惡化，楊樹生產(chǎn)受到干旱、鹽堿等自然災(zāi)害的嚴重制約。目前，楊樹在全世界及我國人工林中占有較大比重，因此培育抗逆轉(zhuǎn)基因楊樹新品種具有十分重要的現(xiàn)實意義。自1987年Fillatti等首次獲得抗除草劑楊樹基因工程植株以來，楊樹基因轉(zhuǎn)化研究已獲得了較大進展。白楊派已有銀白楊的一些派間雜交種、毛白楊等獲得了轉(zhuǎn)基因植株。但目前尚未有青楊派特別是吳屯楊(Populus wutunensis)轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)建立的報告。抗逆性速生吳屯楊是姜國斌[1]教授的課題組在遼寧西部新民縣大柳屯鄉(xiāng)吳屯村發(fā)現(xiàn)的一種被當?shù)乩习傩辗Q之為“吳屯楊”的楊樹無性系，在當?shù)氐淖匀画h(huán)境下高徑生長表現(xiàn)優(yōu)異。大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院通過多年的試驗地和盆栽試驗對比等研究，對被害率、苗木活力、苗木組織和細胞內(nèi)離子分區(qū)及含量分析、幼嫩組織AIPase活性的細胞化學(xué)分析、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量、光合特性等生理生化指標進行測定，確定了該樹種的抗逆和速生等優(yōu)良特性。吳屯楊具有繁殖容易，育苗、造林成活率高，根系發(fā)達，適應(yīng)性強，生長速度快、 材質(zhì)優(yōu)良等特點，是優(yōu)良天然雜交種，可用于營造防護林，大、小徑階用材林等。2008年12 月，經(jīng)專家認定，該品種通過了遼寧省林木品種審定。目前，抗逆性速生吳屯楊已在在遼寧省西部的阜新蒙古族自治縣、新民縣以及大連等地推廣應(yīng)用。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明直接用吳屯楊葉片作為外植體，取材方便。在已建立起的高效組培再生體系的基礎(chǔ)上，建立了以葉片為外植體的吳屯楊基因轉(zhuǎn)化方法，為今后利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)對吳屯楊進行遺傳改良提供技術(shù)上的支持，同時也為林木的遺傳改良提供了一個新途徑。本發(fā)明的技術(shù)依據(jù)為草丁膦(Phosphinothricin，PPT)是一種非選擇性、廣譜、無殘留的高效滅生性除草劑，能強烈抑制植物葉片中谷氨酰胺合成酶(GQ的活性，導(dǎo)致細胞內(nèi)氨離子積累、破壞細胞結(jié)構(gòu)而致植株死亡。bar基因能消除PPT對植物體的毒害作用，它編碼乙酰轉(zhuǎn)移酶PAT， 使乙酰輔酶A與草丁膦游離氨基結(jié)合，形成AC-PAT復(fù)合物，使草丁膦失去活性，從而使植株具有PPT抗性。農(nóng)桿菌AGLO為目前在植物遺傳轉(zhuǎn)化中常用的一農(nóng)桿菌品系，本發(fā)明使用的農(nóng)桿菌AGLO是由韓國生命工學(xué)研究院贈送，其含有質(zhì)粒pCAMBIA3300，質(zhì)粒pCAMBIA3300上攜帶有上述bar基因[2]作為篩選基因。因此，經(jīng)農(nóng)桿菌AGLO介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的陽性植株便具有抗除草劑抗性，當用除草劑為篩選試劑來選擇轉(zhuǎn)化細胞時，陽性的PPT抗性芽能夠在篩選培養(yǎng)基上正常生長，而未成功轉(zhuǎn)化bar基因的假陽性苗則無法在篩選培養(yǎng)基上正常生長。MS(Murashige and Skoog，1962)培養(yǎng)基，是植物組培的常用培養(yǎng)基，廣泛地用于植物的器官、花藥、細胞和原生質(zhì)體培養(yǎng)，效果良好。本發(fā)明所用的植物培養(yǎng)基均以MS為基本培養(yǎng)基，附加了不同濃度的激素。本發(fā)明是通過如下步驟實現(xiàn)的a.將吳屯楊無菌苗的葉片沿垂直主脈切2 4個切口，切口深達主脈，正面向上，放入預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基中，光照培養(yǎng)2 3天，培養(yǎng)溫度為25 27°C，光照強度為3000 4000Lux，光照時間為16 18小時/天； 所述的預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基為MS+6-BA 1. Omg/L+NAA 0. 2mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉8g/ L；b.挑取農(nóng)桿菌AGLO的菌落接種到含有卡那霉素50mg/L的10 15ml YEP液體培養(yǎng)基中，于26°C下，200rpm震蕩培養(yǎng)M小時，取10 100 μ 1的菌液轉(zhuǎn)接至30 50ml 的YEP液體培養(yǎng)基中，于下，200rpm震蕩培養(yǎng)至菌體OD6c 達到0.8 1.0時，于4°C， 12000rpm條件下離心5min得到菌體，用與離心前等體積的MS液體培養(yǎng)基重新懸浮菌體，獲得侵染菌液；c.將步驟a獲得的葉片浸入步驟b獲得的侵染菌液中，于^TC下、IOOrpm條件下， 震蕩10分鐘，進行侵染；d.步驟c獲得的葉片，除去葉片上的多余菌液，轉(zhuǎn)移到共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng) 2 3天，培養(yǎng)溫度為25 27°C ；所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基為MS+6-BA1. Omg/L+NAA 0. 2mg/L+AS 200 μ mol/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂粉 8g/L ；e.步驟d獲得的葉片，除去葉片上的多余液體，轉(zhuǎn)移到初次篩選培養(yǎng)基上，培養(yǎng) 21天后，換到二次篩選培養(yǎng)基上，培養(yǎng)至分化出不定芽，所述的初次及二次篩選培養(yǎng)溫度為 25 27°C，光照強度為3000 4000Lux，光照時間為16 18小時/天；所述的初次篩選培養(yǎng)基為MS+6-BA1. Omg/L+NAA 0. 2mg/L+Cef400mg/L+0. 8 1. 0mg/L PPT+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂粉 8g/L ；所述的二次篩選培養(yǎng)基為MS+6-BA1. Omg/L+NAA 0. 2mg/L+Cef400mg/L+l. 2 1. 6mg/L PPT+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂粉 8g/L ；f.待抗性芽伸長至2 5cm，將抗性芽接入生根培養(yǎng)基中，每瓶接種3株，2周；所述的生根培養(yǎng)基為1/2MS+IBA0. 03mg/L+NAA 0. 03mg/L+Cef 400mg/L+PPT 1. 5mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂粉 8g/L ；g. CTAB法的全稱是十六烷基三甲基溴化銨法(Hexadecyltrimethy Ammonium Bromide)能夠提取植物基因組DNA，屬于一般分子生物學(xué)常規(guī)操作。采用CTAB法提取轉(zhuǎn)基因植株的DNA，作為被檢模板，采用PCR (Polymerase Chain Reaction)法對候選植株進行鑒定，所用引物如下上游引物5，-CGGTCTGCACCATCGTCAACC-3，，下游引物5，-GTCCAGCTGCCAGAAACCCAC-3，。PCR反應(yīng)條件940C lmin, 68°C lmin，72°C 2min,35 個循環(huán)；最后在 72°C下繼續(xù)延伸 lOmin。
PCR又稱為“多聚酶鏈式反應(yīng)”，是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的實驗方法，根據(jù)PCR引物以及PCR反應(yīng)條件，本領(lǐng)域技術(shù)人員可依據(jù)常識確定PCR反應(yīng)體系，擴增出目的基因。上述步驟e中初次篩選培養(yǎng)基的優(yōu)選為MS+6-BA1. 0mg/L+NAA0. 2mg/L+Cef400mg/L+PPT 1. Omg/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂粉 8g/ L；上述步驟e中二次篩選培養(yǎng)基的優(yōu)選為MS+6-BA1. Omg/L+NAAO. 2mg/L+Cef400mg/L+PPT 1. 5mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂粉 8g/ L0有益效果本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比顯著優(yōu)點是以吳屯楊葉片作為外植體建立高效的吳屯楊遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，在短時間內(nèi)可選育出吳屯楊抗逆新品種。
圖1 初次篩選培養(yǎng)基上獲得的PPT抗性芽；圖2 二次篩選培養(yǎng)基上獲得的PPT抗性芽；圖3 轉(zhuǎn)基因吳屯楊基因組PCR檢測；
具體實施例方式下述實施例中所述試驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所述試劑和材料，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得，或可以常規(guī)方法制備。含bar基因的農(nóng)桿菌AGLO 由韓國生命工學(xué)研究院贈送；6-BA :6-Benzylaminopurine,6-芐氨基嘌呤，購自生工生物(上海)有限公司；NAA :l-naphthlcetic acid，a_萘乙酸，購自生工生物(上海)有限公司；AS =Acetosyringone,乙酰丁香酮，購自生工生物(上海)有限公司；Cef Ceftriaxone，頭孢曲松鈉，購自生工生物(上海)有限公司；PPT :Phosphinothricin，草丁膦，購自生工生物(上海)有限公司；DL500DNA Marker購自寶生物工程(大連)有限公司；Taq酶，dNTP及10 X緩沖液均購自生工生物(上海)有限公司；酵母提取物、蛋白胨、NaCl均購自生工生物(上海)有限公司；YEP液體培養(yǎng)基(單位g/L)酵母提取物10 ；蛋白胨10 ；NaCl :5。MS培養(yǎng)基購自Duchefa公司，商品號M0222. 0050，使用濃度為4. 4g/L，1/2MS培養(yǎng)基的濃度為2. 2g/L。實施例1a.將作為轉(zhuǎn)化外植體的吳屯楊無菌苗的葉片沿垂直主脈切3個切口，切口深達主脈，正面向上，放入預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基中，共50個葉片，每個培養(yǎng)皿接種9 11個葉片，共接種5 個培養(yǎng)皿，光照培養(yǎng)2天，培養(yǎng)溫度為^°C，光照強度為3400LUX，光照時間為16小時/天；上述預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基為MS+6-BA 1. 0mg/L+NAA 0. 2mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉8g/ L；b.挑取帶有bar基因的農(nóng)桿菌AGLO的菌落接種到含有卡那霉素50mg/L的 IOmlYEP液體培養(yǎng)基中，于下，200rpm震蕩培養(yǎng)對小時，取100 μ 1的菌液轉(zhuǎn)接至30ml的YEP液體培養(yǎng)基中經(jīng)過200rpm震蕩培養(yǎng)，當菌體OD6tltl達到0. 8時，4°C條件下，通過 12000rpm離心5min收集菌體，用30ml的MS液體培養(yǎng)基重新懸浮菌體，獲得侵染菌液；c.將經(jīng)步驟a處理的葉片全部浸入步驟b獲得的30ml侵染菌液中，于沈！、 IOOrpm條件下，震蕩10分鐘，進行侵染；d.侵染后的葉片放置在無菌的濾紙上，除去多余菌液，轉(zhuǎn)移到共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，每個培養(yǎng)皿接種5個葉片，暗培養(yǎng)2天，培養(yǎng)溫度為；上述共培養(yǎng)培養(yǎng)基為MS+6-BA1. Omg/L+NAA 0. 2mg/L+AS 200 μ mol/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂粉 8g/L ；e.共培養(yǎng)后的葉片放置于無菌的濾紙上，除去多于液體，每個培養(yǎng)皿9 11個葉片，轉(zhuǎn)移到初次篩選培養(yǎng)基上，培養(yǎng)21天后收獲15個抗性芽，將收獲到的15個抗性芽，每瓶接種5 6株換到二次篩選培養(yǎng)基上，培養(yǎng)至分化出不定芽，共收獲11個。上述初次及二次篩選培養(yǎng)溫度為^°C，光照強度為3400LUX，光照時間為16小時
/天；上述初次篩選培養(yǎng)基為MS+6-BAl.0mg/L+NAA0. 2mg/L+Cef400mg/L+PPT 1. Omg/L+ 蔗糖30g/L+瓊脂粉8g/L ；上述二次篩選培養(yǎng)基為MS+6-BA1. 0mg/L+NAA0. 2mg/L+Cef400mg/L+PPT 1. 5mg/ L+蔗糖30g/L+瓊脂粉8g/L。圖1為初次篩選培養(yǎng)基上獲得的PPT抗性芽，其中⑵指向正常轉(zhuǎn)化苗，⑴、(3)、 (4), (5)未見任何抗性芽生長。圖2為二次篩選培養(yǎng)基上獲得的PPT抗性芽，其中(7)、(8) 指向陽性轉(zhuǎn)化苗，轉(zhuǎn)化苗正常生長，根不斷伸長，頂芽緩慢生長，葉片逐漸伸展，葉面逐漸擴展；(6)、(9)指向假陽性苗，篩選培養(yǎng)基中的PPT對葉片生長具有顯著的抑制效應(yīng)，使得假陽性苗不能生長、或者在生長過程中逐漸死亡。f.待抗性芽伸長至km，將11個抗性芽分別接入生根培養(yǎng)基中，每瓶接種5 6 株；經(jīng)過溫度為^TC,光照強度為3400LUX，光照時間為16小時/天的培養(yǎng)，天后，獲得抗 PPT吳屯楊無性系5株。上述生根培養(yǎng)基為1/2MS+IBA0. 03mg/L+NAA 0. 03mg/L+Cef400mg/L+PPTl. 5mg/ L+蔗糖30g/L+瓊脂粉8g/L。g.利用以上已建立起來的吳屯楊轉(zhuǎn)基因體系，得到了抗PPT吳屯楊無性系5株。 對所得5株P(guān)PT抗性吳屯楊無性系均作PCR檢測。采用CTAB法提取5株轉(zhuǎn)基因植株DNA， 作為被檢模板，擴增目的基因片段。根據(jù)bar基因編碼區(qū)序列合成一對特異PCR引物，目標產(chǎn)物410bp 上游引物5，-CGGTCTGCACCATCGTCAACC-3，，下游引物5，-GTCCAGCTGCCAGAAACCCAC-3，；PCR反應(yīng)體系候選植株DNA 1 μ 1引物1:1μ 1引物2:1μ 1dNTP 2 μ 110 X PCR 緩沖液 2. 5 μ 1
Taqgl 0. 25 μ 1無菌水12. 25 μ 1反應(yīng)總體積20 μ 1上述候選植株DNA濃度為IOng/ μ 1，引物1、引物2濃度為10 μ Μ, dNTP的濃度為 10 μ M。PCR反應(yīng)條件940C lmin, 68°C lmin，72°C 2min,35 個循環(huán)；最后在 72°C下繼續(xù)延伸 lOmin。擴增產(chǎn)物用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。采用CTAB法[3]提取農(nóng)桿菌AGLO的質(zhì)粒 pCAMBIA做為陽性對照，以提取未轉(zhuǎn)化植株葉片DNA做為陰性對照，進行PCR鑒定。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳分析，電泳結(jié)果如附圖3所示，其中，M :DL500DNAMarker, CK+ 陽性對照，CK_ 陰性對照，Rl R5 待檢植株。從電泳圖中可以看出，在待檢植株中，Rl得到一條約為410bp的片段，與CK+陽性對照組所示的條帶大小基本一致，因此可以說明外源bar基因已經(jīng)整合到吳屯楊基因組中，初步確認Rl為轉(zhuǎn)bar基因陽性植株。而R2 R5植株基因組中沒有擴增出對應(yīng)片段，為假陽性植株；實施例2除草劑臨界濃度的確定由于用于基因轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌AGLO帶有bar基因，因此經(jīng)農(nóng)桿菌AGLO介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的陽性植株便具有了抗除草劑抗性，以除草劑為篩選試劑來選擇轉(zhuǎn)化細胞，為了確定吳屯楊對除草劑的抗性，進行了葉片對除草劑抗性的臨界濃度的試驗，將均勻一致的葉片分別置于含 0. 5,1. 0,1. 5,2. 0,2. 5mg/L PPT 的培養(yǎng)基上MS+6_BA 1. Omg/L+NAA 0. 2mg/L+ 蔗糖 30g/L+瓊脂粉8g/L，接種密度為每個培養(yǎng)皿5個葉片，篩選培養(yǎng)溫度為^TC,光照強度為 3400LUX，光照時間為16小時/天。觀察葉片對一系列濃度梯度除草劑的反應(yīng)，培養(yǎng)30天后進行統(tǒng)計，得到除草劑臨界濃度的確定。所述的對照培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基附加了 l.Omg/ L6-BA+0. 2mg/L NAA+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂粉 8g/L。
權(quán)利要求
1.一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的培育轉(zhuǎn)基因吳屯楊植株的方法，具體步驟為a.將吳屯楊無菌苗的葉片沿垂直主脈切2 4個切口，切口深達主脈，正面向上，放入預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基中，光照培養(yǎng)2 3天，培養(yǎng)溫度為25 27°C，光照強度為3000 4000Lux， 光照時間為16 18小時/天；所述的預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基為MS+6-BA 1. Omg/L+NAA 0. 2mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉8g/L ；b.挑取農(nóng)桿菌AGLO的菌落接種到含有卡那霉素50mg/L的10 15mlYEP液體培養(yǎng)基中，于下，200rpm震蕩培養(yǎng)M小時，取10 100 μ 1的菌液轉(zhuǎn)接至30 50ml的YEP液體培養(yǎng)基中，于下，200rpm震蕩培養(yǎng)至菌體0D600達到0. 8 1. 0時，于4°C，12000rpm 條件下離心5min得到菌體，用與離心前等體積的MS液體培養(yǎng)基重新懸浮菌體，獲得侵染菌液；c.將步驟a獲得的葉片浸入步驟b獲得的侵染菌液中，于^TC下、IOOrpm條件下，震蕩 10分鐘，進行侵染；d.步驟C獲得的葉片，除去葉片上的多余菌液，轉(zhuǎn)移到共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)2 3 天，培養(yǎng)溫度為25 27°C ；所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基為MS+6-BA 1. Omg/L+NAA 0. 2mg/L+AS 200 μ mol/L 蔗糖 30g/L+瓊脂粉8g/L ；e.步驟d獲得的葉片，除去葉片上的多余液體，轉(zhuǎn)移到初次篩選培養(yǎng)基上，培養(yǎng)21 天后，換到二次篩選培養(yǎng)基上，培養(yǎng)至分化出不定芽，所述的初次及二次篩選培養(yǎng)溫度為 25 27°C，光照強度為3000 4000Lux，光照時間為16 18小時/天；所述的初次篩選培養(yǎng)基為MS+6-BA 1. Omg/L+NAA 0. 2mg/L+Cef400mg/L+0. 8 1. Omg/L PPT+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂粉 8g/L ；所述的二次篩選培養(yǎng)基為MS+6-BA 1. Omg/L+NAA 0. 2mg/L+Cef400mg/L+l. 2 1. 6mg/L PPT+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂粉 8g/L ；f.待抗性芽伸長至2 5cm，將抗性芽接入生根培養(yǎng)基中，每瓶接種3株，培養(yǎng)2周；所述的生根培養(yǎng)基為1/2MS+IBA 0. 03mg/L+NAA 0. 03mg/L+Cef 400mg/L+PPT 1. 5mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉8g/L ；g.采用CTAB法提取轉(zhuǎn)基因植株的DNA，作為被檢模板，采用PCR法對候選植株進行鑒定，所用引物如下，上游引物5，-CGGTCTGCACCATCGTCAACC-3，，下游引物5，-GTCCAGCTGCCAGAAACCCAC-3，；PCR反應(yīng)條件940C lmin，68°C lmin，72°C 2min，35 個循環(huán)，72°C下延伸 lOmin。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的培育轉(zhuǎn)基因吳屯楊植株的方法，其特征是，所述的步驟e中初次篩選培養(yǎng)基為MS+6-BA1. 0mg/L+NAA0. 2mg/L+Cef400mg/L+PPT 1. 0mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂粉 8g/L ；二次篩選培養(yǎng)基為MS+6-BA1. 0mg/L+NAA0. 2mg/L+Cef400mg/L+PPT 1. 5mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂粉 8g/L。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的培育轉(zhuǎn)基因吳屯楊植株的方法，本發(fā)明涉及一種利用基因工程技術(shù)培育吳屯楊抗逆新品種的方法，本發(fā)明取材方便，直接用吳屯楊葉片作為外植體，對影響基因轉(zhuǎn)化的因素，即抗生素敏感性進行了優(yōu)化，建立了吳屯楊高效遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。為吳屯楊抗逆新品種的培育提供一種轉(zhuǎn)化效率更高的方法，可縮短培育吳屯楊抗逆新品種的時間，為林木的遺傳改良提供了一個新途徑。
文檔編號C12Q1/68GK102329817SQ20111020732
公開日2012年1月25日 申請日期2011年7月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月22日
發(fā)明者劉磊, 姜國斌, 王穎, 郭鵬, 金華 申請人:大連民族學(xué)院