專利名稱：用于口蹄疫病毒實時熒光rt-pcr檢測的引物和方法
技術領域：
本發明屬于病毒檢測技術領域，具體涉及一種用于口蹄疫病毒通用型實時熒光 RT-PCR檢測的引物和方法。
背景技術：
口蹄疫病毒(Foot-and-mouth Disease Virus，FMDV)屬小 RNA 病毒科屬，是最小的動物病毒之一。口蹄疫病毒是偶蹄獸共患的一種急性、熱性、接觸性的烈性傳染病，最易感染的動物是豬、黃牛、水牛、駱駝、羊、鹿等，黃羊、麝、野豬、野牛等野生動物也易感染此病。此病由于有高傳染性、高死亡率的特點，所以傳染范圍大，速度快，且病毒生命力極強， 一旦爆發，必須迅速撲殺病畜及可疑感染動物，并對疫區進行徹底消毒。因此，口蹄疫病毒的每次爆發流行，都意味著巨大的經濟損失，對發展中國家的農業部經濟而言，更是一場不可預估的毀滅性災難。口蹄疫病毒共有0、A、C、Asia I、SAT1、SAT2和SAT3等7個血清型，而每個血清型中又有許多的亞型，由于各個血清型之間交叉保護較少，因此，每次疫病爆發后只能進行屠宰和集體焚毀，以絕后患。2001年英國在爆發口蹄疫病毒的一個多月期間，大約30萬頭牲畜已被宰殺，口蹄疫病毒危機使英國的經濟損失將達到100億美元，隨后三周內還有近100 萬頭牲畜被宰殺銷毀。2003年巴拉圭政府命令槍殺感染口蹄疫病毒的300多頭牛羊，這場災難給這個南美國家造成5000多萬美元的直接損失。2005年巴西口蹄疫病毒發生，世界41 個國家宣布暫時禁止從巴西進口牛肉，造成損失約5億美元，如果情況繼續發展下去，2006 年將損失10億美元以上。可見口蹄疫病毒傳播迅速、難于防治、補救措施少，被稱為畜牧業的“頭號殺手”，嚴重影響農業經濟的發展。口蹄疫的暴發往往給國家的經濟帶來致命的打擊。1951-1952年在英法爆發的口蹄疫，造成的損失高達1. 43億英鎊。因此世界各國都將其列為一類傳染病認真對待，并采取積極措施防止發生和防范從國外傳入。1967年英國口蹄疫大爆發導致40萬頭牛被屠宰， 損失1.5億英鎊。最近一段時間，在東南亞地區多次爆發口蹄疫，損失嚴重，僅臺灣地區就宰殺豬超過20萬頭。1997年，臺灣爆發0型口蹄疫，當局被迫銷毀340萬頭生豬，以防疫情進一步擴大。此次殺豬行動導致臺灣相關行業蒙受2700億元新臺幣損失。2000年英國已宰殺了近10萬頭牲畜后，口蹄疫席卷整個歐洲和世界上的其他國家。韓國、日本暴發口蹄疫后，韓國政府決定投入5000億韓元(5.2億美元)收購并宰殺口蹄疫發病地20公里以內地區的所有豬、牛等家畜。同時日本、美國、新加坡以及中國的臺灣和香港都已先后宣布禁止從韓國進口豬肉和牛肉，有些國家和地區甚至把乳制品也列到禁止范圍之內，給其本國帶來極大的經濟損失。因此，對于口蹄疫這種一類傳染性疾病，世界各國都不敢輕視，隨時都嚴陣以待，采取各項積極有效的措施，防止該病的發生，防范從國外傳入。實時熒光PCR技術是具有巨大發展潛力的高新檢測技術，在許多領域已得到了廣泛應用，因此可以利用其解決口蹄疫病毒多血清型和高變異性給臨床檢測造成的難題。實時熒光定量PCR技術是于1996年被首次推出的，該技術不僅實現了 PCR方法從定性到定量的飛躍，而且與常規PCR相比，它具有特異性更強、檢測周期更短、有效解決PCR污染問題、 自動化程度高等特點，目前已得到廣泛應用。常規反轉錄聚合酶鏈式反應(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)是先將RNA反轉錄成cDNA，然后利用DNA聚合酶在體外快速擴增目的 DNA片斷的技術。熒光實時RT-PCR是在普通RT-PCR的基礎上，在擴增反應體系中加入一對引物的同時再加入一個特異性的熒光探針，該探針為兩端分別標記熒光報告基團和熒光淬滅基團的寡核苷酸。在探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團所吸收，從而檢測不到該探針熒光基團所發出的熒光信號，而在PCR擴增時，Taq酶的5’端外切酶活性將特異結合在目的擴增片段上的熒光探針酶切降解，使熒光報告基團游離于反應體系中，脫離了熒光淬滅基團的屏蔽作用，此時可以檢測到熒光報告基團的熒光信號，熒光信號量的變化與擴增產物量成正比。由于口蹄疫病毒具有多個亞型且變異快，國內外疫情的發生情況又較復雜，所以迫切需要建立一種特異敏感、準確可靠、快速簡便的口蹄疫病毒檢測方法，用于快速檢測國內外主要流行的口蹄疫病毒亞型，從而滿足進出口檢驗檢疫和疫病監控的需要。
發明內容
本發明的目的在于提供用于檢測口蹄疫病毒通用型的PCR引物和熒光探針。本發明的目的還在于提供利用上述PCR引物和熒光探針進行檢測口蹄疫病毒通用型的方法。本發明通過以下技術方案實現分析所有已報道的口蹄疫病毒通用型基因組序列，分別設計引物和熒光探針。在常規RT-PCR檢測技術的基礎上，添加一條標記了兩個熒光基團的核苷酸探針，熒光報告基團標記在探針的5’端，熒光淬滅基團標記在探針的3’ 端，兩者構成能量轉移結構，即熒光報告基團所發射的熒光可被熒光淬滅基團吸收，當二者距離變遠時，抑制作用減弱，報告基團熒光信號增強。在擴增反應過程中，探針同模板上目的擴增片段雜交，由于Taq酶具有5’端到3’端的外切酶活性，在擴增延伸階段將探針切斷，熒光淬滅基團的抑制作用消失，報告基團熒光信號增強，從而進行口蹄疫病毒通用型的檢測。用于口蹄疫病毒實時熒光RT-PCR檢測的引物為上游引物UNFMDVpfl 127 :5，-TGGGTTTTACAAACCTGTGATGG-3，；下游弓丨物UNFMDVpr 1221:5，-CCACGGAGATCAACTTCTCCTG-3，；上游弓丨物UNFMDVpr 1221， 5，-CAGGAGAAGTTGATCTCCGTGG-3，；下游引物UNFMDVpfll27，5，-CCATCACAGGTTTGTAAAACCCA-3，；上游引物Hfpfl 117 其序列為上游引物UNFMDVpfl 127向5，端方向延伸10個堿基得到的堿基序列；下游引物Hfprl231 其序列為下游引物UNFMDVprl221向3’端方向延伸10個堿
基得到的堿基序列；下游引物Hfprl211 其序列為下游引物UNFMDVprl221向5’端方向延伸10個堿
基得到的堿基序列；上游引物Hfpflll7，其序列為上游引物UNFMDVpr 1221'向5，端方向延伸10個堿基得到的堿基序列；下游引物Hfpr 1231'其序列為下游引物UNFMDVpf 1127，向3，端方向延伸10個
堿基得到的堿基序列；下游引物Hfprl211，其序列為下游引物UNFMDVpf 1127，向5，端方向延伸10個
堿基得到的堿基序列；采用上述引物做實時熒光RT-PCR檢測時，引物的配對方案為上游引物 UNFMDVpfl 127和下游引物UNFMDVprl221配對使用；上游引物UNFMDVprl221’和下游引物 UNFMDVpfl 127'配對使用；上游引物Hfpf 1117和下游引物Hfprl231配對使用；上游引物 Hfpflll7和下游引物Hfprl211配對使用；上游引物Hfpf 1117，和下游引物Hfprl231，配對使用；上游引物Hfpflll7，和下游引物Hfprl211，配對使用。用于口蹄疫病毒實時熒光RT-PCR檢測的熒光探針序列為UNFMDVpvll81 :5，-CTCTCCTTTGCACGCCGTGGG-3，；UNFMDVpvll81' :5， -CCCACGGCGTGCAAAGGAGAG-3，；UNFMDVpvll82 其序列為UNFMDVpvll81向5’端方向延伸10個堿基得到的堿基序列；UNFMDVpvll82'其序列為UNFMDVpvll81向3，端方向延伸10個堿基得到的堿基序列；UNFMDVpvll83 其序列為UNFMDVpvll81，向5，端方向延伸10個堿基得到的堿基序列；UNFMDVpvll83，其序列為UNFMDVpvll81，向3，端方向延伸10個堿基得到的堿基序列；上述熒光探針分別用Joe、Rox, Ned、Hex、Tet、Fam或Vic熒光素標記探針序列的 5’端，熒光淬滅基團標記探針序列的3’端。一種口蹄疫病毒實時熒光RT-PCR檢測的方法，按照如下步驟進行(1)選擇權利要求1任一配對引物和權利要求2任一熒光探針；(2)提取各種來源樣品中口蹄疫病毒的基因組RNA ；(3)確定最佳引物濃度、鎂離子濃度、反轉錄酶用量、Taq DNA聚合酶用量和dNIPs 濃度；(4)選擇儀器的檢測通道；(5)上機檢測，若得到口蹄疫病毒特異性的熒光曲線，則證明待檢樣品中含有口蹄
疫病毒。口蹄疫病毒的基因組RNA的提取方法為QIAamp Viral RNA Mini kit或iTrizol 核酸抽提試劑。本發明的有益效果充分運用PCR技術的高效擴增性、核酸雜交的良好特異性和熒光檢測技術的快速敏感性，檢測操作即可完成高致病性口蹄疫病毒通用型的檢測，可以確定血清型，具有結果可靠和準確靈敏、操作簡單、省時省力、降低檢測成本、提高檢測效率等優點。
圖1為口蹄疫病毒通用型實時熒光RT-PCR檢測曲線圖。圖2為口蹄疫病毒通用型實時熒光RT-PCR方法的特異性試驗結果曲線。圖3為口蹄疫病毒通用型實時熒光RT-PCR方法的敏感性試驗結果曲線。
具體實施例方式下面結合附圖和具體實施例對本發明做進一步說明。實施例1 口蹄疫病毒實時熒光RT-PCR反應體系的優化(1)引物濃度的優化在反應體系中，將引物濃度分別從0. Ιμπιο /L至 1. 6 μ mol/L作倍比連續稀釋，互相組合后進行檢測，通過試驗結果的分析比較，確定的最佳引物終濃度見表1 表1 口蹄疫病毒通用型引物的最佳濃度
權利要求
1.一種用于口蹄疫病毒實時熒光RT-PCR檢測的引物，其特征在于，所述引物為 上游引物 UNFMDVpfl 127 :5，-TGGGTTTTACAAACCTGTGATGG-3，；下游引物 UNFMDVpr 1221 :5，-CCACGGAGATCAACTTCTCCTG-3，； 上游引物 UNFMDVpr 1221，5，-CAGGAGAAGTTGATCTCCGTGG-3，； 下游引物 UNFMDVpfl 127，5，-CCATCACAGGTTTGTAAAACCCA-3，； 上游引物Hfpflll7 其序列為上游引物UNFMDVpfll27向5’端方向延伸10個堿基得到的堿基序列；下游引物Hfprl231 其序列為下游引物UNFMDVpr 1221向3’端方向延伸10個堿基得到的堿基序列；下游引物Hfprl211 其序列為下游引物UNFMDVpr 1221向5’端方向延伸10個堿基得到的堿基序列；上游引物Hfpflll7’ 其序列為上游引物UNFMDVprl221 得到的堿基序列；下游引物Hfpfl231，其序列為下游引物UNFMDVpfll27 得到的堿基序列；下游引物Hfpr 1211’ 其序列為下游引物UNFMDVpfl 127 得到的堿基序列；采用上述引物做實時熒光RT-PCR檢測時，引物的配對方案為上游引物UNFMDVpf 1127 和下游引物UNFMDVprl221配對使用；上游引物UNFMDVprl221，和下游引物UNFMDVpf 1127， 配對使用；上游引物Hfpfl 117和下游引物Hfprl231配對使用；上游引物Hfpfl 117和下游引物Hfpr 1211配對使用；上游引物Hfpflll7，和下游引物Hfprl231，配對使用；上游引物 Hfpflll7，和下游引物Hfprl211，配對使用。
2.—種用于口蹄疫病毒實時熒光RT-PCR檢測的熒光探針，其特征在于，所述熒光探針序列為UNFMDVpvll81 :5’ -CTCTCCTTTGCACGCCGTGGG-3，； UNFMDVpvll81' :5， -CCCACGGCGTGCAAAGGAGAG-3，；UNFMDVpvll82 其序列為UNFMDVpvll81向5，端方向延伸10個堿基得到的堿基序列； UNFMDVpvll82’:其序列為UNFMDVpvll81向3’端方向延伸10個堿基得到的堿基序列； UNFMDVpvll83 其序列為UNFMDVpvll81’向5’端方向延伸10個堿基得到的堿基序列； UNFMDVpvll83’ 其序列為UNFMDVpvll81，向3，端方向延伸10個堿基得到的堿基序列；上述熒光探針分別用J0e、R0X、Ned、Hex、Tet、Fam或Vic熒光素標記探針序列的5’端， 熒光淬滅基團標記探針序列的3’端。
3.—種口蹄疫病毒實時熒光RT-PCR檢測的方法，其特征在于，按照如下步驟進行(1)選擇權利要求1任一配對引物和權利要求2任一熒光探針；(2)提取各種來源樣品中口蹄疫病毒的基因組RNA；(3)確定最佳引物濃度、鎂離子濃度、反轉錄酶用量、TaqDNA聚合酶用量和dNIPs濃度；(4)選擇儀器的檢測通道；2，向5’端方向延伸10個堿基 ，向3’端方向延伸10個堿基 ’向5’端方向延伸10個堿基(5)上機檢測，若得到口蹄疫病毒特異性的熒光曲線，則證明待檢樣品中含有口蹄疫病
4.根據權利要求3所述一種口蹄疫病毒實時熒光RT-PCR檢測的方法，其特征在于，口蹄疫病毒的基因組RNA的提取方法為QIAamp Viral RNA Mini kit或Trizol核酸抽提試劑。
全文摘要
本發明公開了屬于病毒檢測技術領域的一種用于口蹄疫病毒實時熒光RT-PCR檢測的引物和方法。本發明分析所有已報道的口蹄疫病毒通用型基因組序列，分別設計引物和熒光探針，通過實時熒光RT-PCR檢測，得到口蹄疫通用型的特異性熒光曲線，可以確定血清型，檢測結果可靠、準確靈敏、操作簡單、省時省力、降低檢測成本、提高檢測效率。
文檔編號C12R1/93GK102260750SQ20111020347
公開日2011年11月30日 申請日期2011年7月20日 優先權日2011年7月20日
發明者劉建麗, 林濤, 趙麗, 邱楊, 陳進會, 黃偉 申請人:東莞出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫綜合技術中心