cDNA-AFLP法分離蘇太豬肌內脂肪含量差異表達基因的方法

專利名稱：cDNA-AFLP法分離蘇太豬肌內脂肪含量差異表達基因的方法
技術領域：
本發明屬于基因工程領域，涉及CDNA-AFLP法分離蘇太豬肌內脂肪含量差異表達基因的方法。
背景技術：
從生物個體的生長、發育、衰老、死亡，到組織的分化、凋亡以及細胞對各種生物、 理化因子的應答，本質上都涉及到基因的選擇性表達。不同細胞間或同一細胞不同時間與空間，基因表達的差異決定著生命活動的多樣性。基因在時間和空間上的有序表達貫穿和調控了個體的整個生命過程。高等生物大約有幾萬個不同的基因，在一定時間、空間中，任何一個細胞中僅有10% 15%的基因表達，并受到嚴格調控。這種在不同細胞間或同一細胞中，基因按時間和空間順序選擇性地、有序地進行表達，稱為基因的差別性表達。基因的差別性表達有兩種方式，分別為新出現的基因表達與表達量差異的基因表達。基因表達的變化是調控細胞生命活動過程的核心機制。由于細胞的各種生理過程或病理改變在本質上都是由基因表達的改變所決定的。因此，通過比較不同細胞或同一類細胞不同生理條件下、 不同生長發育階段的基因表達的差異，將為分析整個細胞的生命過程提供有用的信息。一旦獲取差異表達的基因將有助于了解正常生理變化和病理改變的分子機制，為基因診斷、 基因治療和發現新的藥物靶點提供新的視角。因此，分離和克隆差異表達基因成為分子生物學研究的一個努力方向。近年來，分離差異表達基因的技術不斷發展與完善，目前這些方法已得到廣泛應用，并已成功分離了許多差異表達的基因。肌內脂肪的形成是一個漸進的過程，在個體發育的不同時期其性狀的表現也會有所不同。從根本上講，在日齡和環境條件基本一致的情況下，肌內脂肪的沉積的變化是由控制肌內脂肪沉積的基因在不同的表達所決定的。Anderson等(1973)認為，豬脂肪組織的增長在前1 2個月主要是脂肪細胞數目的增加，在2-5月齡是脂肪細胞數目增加和脂肪細胞體積增大共存，5 6月齡以后的發育主要為脂肪細胞體積的增大。在不同類型的豬肌肉中的研究發現，脂肪型豬和瘦肉型豬脂肪細胞的增殖和肥大能力均存在顯著差異，前者脂肪細胞成熟的速度較慢而后者脂肪細胞成熟的速度較快，表明脂肪細胞在不同品種間的成熟速度有明顯的差異，這種差異也可能是導致肌內脂肪沉積速度差異的一個重要原因。在動物細胞里，80%以上的能量是在線粒體中合成的。糖和脂肪等營養物質經酵解和三羧酸循環后脫下的氫經線粒體內膜上的電子傳遞系統即呼吸鏈，最后傳遞給氧。呼吸鏈中的復合物I即NADH脫氫酶是最復雜的酶系，其作用是催化NADH的2個電子傳遞至輔酶Q。還原型輔酶煙酰胺腺嘌呤二核苷酸NADH是細胞能量代謝所必需的輔酶，其分子量為770.8kDa，等電點為3.0。NADH在生化過程中起電子傳遞作用，能量反應中的電子，通常都先被傳遞至NAD，再還原成NADH，經過傳遞鏈傳遞電子至氧，并釋放能量，氧化磷酸化作用便利用這些能量制造ATP，1分子NADH還原產生3分子ATP。它在生物體內的糖酵解、檸檬酸循環和光合作用等過程中，起著電子傳遞的重要作用。NADH對活化生物體內多酶系統，促進核酸、蛋白、多糖的合成和代謝，增加物質轉運和調控，改善代謝功能等具有重要的作用，同時NADH在維持細胞生長、分化和能量代謝中也起重要作用。細胞內NADH含量的升高，使脂肪酸氧化減弱。同時NADH含量升高又促進脂肪酸的合成。隨著年齡的增長，組織器官日趨老化，從能量供應充足的狀態到能量供應不足，組織器官出現其功能異常，特別是大腦中樞神經系統中神經細胞功能退化，如帕金森氏綜合征，阿爾海姆茨病等，并導致全身性疾病發生，如疲勞綜合征。研究表明NADH能增加內源性多巴胺合成和改善帕金森氏綜合征癥狀，預防帕金森氏綜合征黑質變性過程和促進神經細胞存活分化。NADH不僅是一種重要的生化試劑，同時也可能作為一種生化藥物發揮細胞保護作用。cDNA-AFLP技術是Bachem等發明的。該技術是將AFLP技術應用于mRNA表達差異分析基礎上發展的一種mRNA指紋圖譜技術。該技術保留了 AFLP技術的可靠性與高效性， 可廣泛地應用于動植物差異基因的分離及鑒定。cDNA-AFLP在cDNA酶切片段兩端加上統一的接頭作為PCR擴增的模板，使經典PCR反應的可靠性大為提高。Habu等比較了 DDRT-PCR 和cDNA-AFLP技術擴增結果，重復性可達100%。Fukuda等的試驗也證實cDNA-AFLP分析再現性達95%以上。本試驗研究中發現由引物擴增出的差異表達片斷均可重復出現，即使是不同個體的材料也能擴增得到相同的差異片段，從而也證實該試驗方法的重復性好及可靠性高的特點。cDNA-AFLP技術程序多且復雜，從RNA的提取到電泳銀染每個環節要求都必須嚴格，只有這樣才能獲得最佳效果。高質量的模板是AFLP標記順利完成的關鍵基礎。所以在很長一段時間里，人們大多使用AFLP試劑盒來完成各項研究(有些直接讓公司來做)。因為它用起來方便，不會產生因體系不佳帶來的問題，但使用試劑盒的費用非常昂貴。目前還未報道cDNA-AFLP技術在豬肌內脂肪上的研究。

發明內容
本發明的目的是針對現有技術的上述不足，提供一種cDNA-AFLP法分離蘇太豬肌內脂肪含量差異表達基因的方法。本發明的目的可通過如下技術方案實現利用CDNA-AFLP法分離蘇太豬肌內脂肪含量差異表達基因的方法，蘇太商品豬屠宰后采取背最長肌，根據肌內脂肪的含量從中選取最高和最低各5頭以上構建RNA池，提取肌內脂肪部位的總RNA，以總RNA為模板合成雙鏈cDNA，用識別序列分別為6bp和4bp的兩種限制性內切酶酶切雙鏈cDNA，酶切片段兩端與相應的限制性內切酶人工接頭序列連接后，利用與所述的限制性內切酶人工接頭序列互補的預擴增引物進行預擴增，再以預擴增產物為模板進行選擇性擴增，選擇性擴增產物通過變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，獲得脂肪含量差異表達基因的差異片段，回收差異片段，進行克隆及測序，從而獲得蘇太豬肌內脂肪含量差異表達基因。其中，所述的識別序列為6bp的限制性內切酶優選EcoR I限制性內切酶，所述的識別序列為6bp的限制性內切酶優選Taq I限制性內切酶。所述的EcoR I接頭序列為SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2，Taq I接頭序列為SEQID No. 3 和 SEQ ID No. 4。所述的與EcoR I限制性內切酶人工接頭序列互補的預擴增引物序列為SEQ ID No. 5，與Taq I限制性內切酶人工接頭序列互補的預擴增引物序列為SEQ ID No. 6。所述的選擇性擴增引物一條為EcoRI選擇性引物，另一條為TaqI選擇性引物。所述的EcoRI 選擇性引物選自 El :SEQ ID No. 7，E2 :SEQ ID No. 8，E3 :SEQ ID No. 9，E4 :SEQ ID No. 10，E5 :SEQ ID No. 11，E6 :SEQ ID No. 12，E7 :SEQ ID No. 13，E8 SEQ ID No. 14，E9 =SEQ ID No. 15中的任意一條；所述的iTaqI選擇性引物選自Tl =SEQ ID No. 16，T2 =SEQ ID No. 17，T3 :SEQ ID No. 18, T4 :SEQ ID No. 19，T5 :SEQ ID No. 20，T6 :SEQ ID No. 21，T7 =SEQ ID No. 22，T8 =SEQ ID No. 23 ；共形成72種選擇性擴增引物對組合。所述的選擇性擴增PCR反應程序如下94°C 4min ； [94°C 30s,65°C lmin(每個循環降低 0. 7°C )，72°C lmin] X 12 ； (94°C 30s, 56°C lmin，72°C lmin) X 25 ；72°C 7min。有益效果本發明將cDNA-AFLP應用于分離蘇太豬肌內脂肪含量差異表達基因， 經過大量試驗優化了 AFLP體系，發現了調節肌內脂肪沉積的相關候選基因。較之于現今流行的芯片技術篩選差異表達基因的方法，本發明具有重復性好，假陽性率低，試驗成本少的特點。


圖1瓊脂糖變性膠RNA完整性檢測，其中1 肌內脂肪高組；2 肌內脂肪低組。圖2預擴增產物瓊脂糖凝膠電泳檢測，M =DNA Marker ；1 肌內脂肪含量高組；2 肌內脂肪含量低組。圖3cDNA-AFLP選擇性擴增電泳圖，1 肌內脂肪含量高組；O 肌內脂肪含量低組。圖4菌落陽性克隆的PCR檢測結果，M =DNA Ladder Marker ；A1-A4指示192bp片斷；B1-B4指示310bp片斷。圖5NADH4基因擴增結果，1-6為肌內脂肪含量低組個體，7_12為肌內脂肪含量高組個體。圖6EcoRI內切酶酶切NAHD4，M =DNA Marker ； 1-6為肌內脂肪含量低組個體，7-12 為肌內脂肪含量高組個體。圖7用于實時熒光定量分析的兩組個體背最長肌肌內脂肪含量，H和L分別代表肌內脂肪最高和最低組；*表示差異顯著< 0. 05)。圖8蘇太豬NADH4基因在不同肌內脂肪含量中的相對表達水平，L 表示肌內脂肪含量低組NADH4基因的相對表達量；H 表示肌內脂肪含量高組NADH4基因的相對表達量。 ”表示差異極顯著(P <0.01)。
具體實施例方式1. 1實驗動物背最長肌來自90頭180日齡的蘇太商品豬，來自蘇州蘇太豬育種中心。屠宰后采取背最長肌，一部分保存于-20°C，用于IMF含量的測定；一部分立即置于液氮中速凍，-70°C保存，根據IMF的含量從中選取最高和最低各6頭構建RNA池，分別記為脂肪含量最高組和脂肪含量最低組，用于cDNA-AFLP分析。
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1. 2主要試劑及試劑盒M-MLV Reverse Transcriptase, RNase 抑制齊[J :Promega 公司；Trizol 試劑盒 Invitrogen 公司；rTaq DNA Polymerase, dNTP 上海皓嘉科技發展有限公司；M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit、Taq I 限制性內切核酸酶、T4 DNA 連接酶、DNA Ladder Marker TaKaRa 公司；EcoR I 限制性核酸內切酶Fermentas 公司；insT/Aclone PCR Product Cloning Kit:MBI 公司；TOPO TA Cloning Kit for Sequencing : Invitrogen 公司；丙烯酰胺、N-N’亞甲基雙丙烯酰胺南京基天生物技術有限責任公司；凝膠回收試劑盒天為時代公司。1.3主要溶液及其配制1. 3. IRNA提取試劑配制(1)0. 的DEPC(焦磷酸二乙酯)處理水ImL DEPC加至999mL去離子水，37°C 過夜(大于12h)，然后高壓滅菌。(2)異戊醇/氯仿取1 49的體積比即可，放于棕色瓶中。(3) 2M醋酸鈉(ρΗ4· 0)加16. 42g無水醋酸鈉于40mL DEPC水和35mL冰醋酸中， 用冰醋酸調PH4. 0，加水至IOOmL后，然后高壓滅菌。(4)苯酚/異戊醇/氯仿取25 24 1的體積比混合即可，放于棕色瓶中。(5) 75%乙醇500mL =DEPC水125mL加100%乙醇375mL即可。配試劑時器皿均要高壓滅菌，器皿要高壓30min或干烤2h，并戴手套操作。(6)水飽和酚(ρΗ4· 5)。1. 3. 2雙鏈cDNA的合成及酶切所需溶液的配制(1)10% SDS (無須滅菌)SDS IOg溶于IOOmL雙蒸水中，30°C以上貯存。 (2) 0. 25M EDTA (pH 8. 0)(高壓滅菌)(NaOH 調 pH 值)EDTA 9. 325g ；加雙蒸水定容至 IOOmL0(3) 10moL/L乙酸銨用70mL室溫的ddH20溶解77g乙酸銨，定容至IOOmL,用 0. 22 μ m濾器過濾除菌。(4) IOmM ATP :27. 5g ATP (disodium salt)，加入 4mL ddH20 調節 pH 至 7. 0 后加 ddH20 補足 5mL，-20°C保存。1. 3. 3電泳試劑配制(1) 10XTBE 緩沖液稱取 108g Tris,7. 44g Na2EDTA · 2H20、55g 硼酸，溶入 800mL
水，定容至IL0(2)溴乙錠(lOmg/mL)儲存液稱取Ig溴乙錠，加IOOmL去離子水，攪拌至溶解， 置于棕色瓶避光保存。工作液濃度為0. 5 μ g/mL。(3)1%的瓊脂糖膠稱取Ig瓊脂糖，置于250mL錐形瓶，加入IOmL 10XTBE和 90mL去離子水混勻，放入微波爐加熱融化，冷卻至55°C再加入5 μ L 0. 5 μ g/mL的溴乙錠， 搖勻灌膠。(4) 30%丙烯酰胺取^Og丙烯酰胺、IOg N, N-甲叉雙丙烯酰胺加水溶解過濾定容至 1000mL。(5) 10% APS 取Ig過硫酸銨加水溶解定容IOOmL即可。(6)6X 上樣緩沖液(Loading Buffer)溴酚藍，0. 25% ；二甲苯青，0. 25% ；甘油，30% ；加蒸餾水定容至5mL。1.3.4染色溶液的配制(1)固定液IL 10%的冰乙酸取IOOmL冰乙酸加900mL混合即可。(2)染色液Ig硝酸銀加1. 5mL37%的甲醛溶于IL水中。(3)顯色液在2L蒸餾水中加入60g Na2CO3, 3mL37 %甲醛和400uL硫代硫酸鈉 (10mg/mL)。(4)固定液IL 10%的冰乙酸取IOOmL冰乙酸加900mL混合即可。實施例11.1 總 RNA 提取分別提取脂肪含量最高組和脂肪含量最低組的背最長肌，用Trizol —步法提取 的肌內脂肪部位的總RNA，用分光光度計測定RNA的濃度，其OD26tZOD28tl比值為1. 8 2. O 之間，說明樣品的純度較高，符合實驗要求。總RNA經甲醛和甲酰胺變性處理后，經1. 2%甲 醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的質量，結果見圖1。1. 2雙鏈cDNA的合成及其精制根據cDNA合成試劑盒(M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit)要求進行操作，以1. 1 中得到的RNA為模板合成cDNA第一鏈，再以在第一條cDNA鏈為基礎合成cDNA第二條鏈， 并對合成的cDNA進行精制。1.3酶切和接頭的連接(1)第一歩Taq I酶酶切(體系為30 μ L)
雙鏈cDNA (600ng)5μ
0.1%BSA2μ
10 χ Buffer2.5μ
T"aql 酶(5υ/μ Ιμ
ddH2〇19.5μ 65°C酶切 2h，80°C失活 20min。(2)第二步EcoR I酶酶切Taq I酶酶切產物 30 μ LEcoR I 酶(5U/ μ L) 2 μ LIOXBuffer4μ LddH204 μ L37°C反應 4h，70°C失活 15min。(3)接頭的連接
EcoR I酶酶切產物40μ
10 χ Τ4 DNABuffer3μ
T4DNA 連接酶(350υ/μ 1.5μ
EcoR I 接頭序列(5 pmol)1.5μ Taq I 接頭序列(50 pmol)1 .5mL
ATP(IOmM)1.5mL
ddH2〇ImL16°C連接過夜，65°C失活15min。1 15稀釋作為預擴增的模板。Taq I 接頭序列5，-GACGATGAGTCCTGAC-3，(SEQ ID No. 3)3，-TACTCAGGACTGGC-5，(SEQ ID No. 4)EcoR I 接頭序歹Ij :5，-CTCGTAGACTGCGTACC-3，(SEQ ID No. 1)3，-CATCTGACGCATGGTTAA-5，(SEQ ID No. 2)將人工合成等量的兩條TaqI (EcoRI)單鏈寡核苷酸于95°C加熱5min，冷卻至室 溫。-20°C保存備用。1. 4預擴增cDNA酶切片斷加上接頭后，進行一次PCR擴增，使用預擴增引物，預擴增的目的是 使目的數量増加，以保證在選擇性擴增中盡量覆蓋各種豐度的差異表達基因。預擴增體系及反應條件如下
初級模板(1.3中加上接頭的cDNA片段)5mL
10 X PCR Buffer5pL
dNTPs(四種成分各2.5mM)2pL
25mM MgCI23pL
EcoR I預擴增弓丨物1.5mL
yaql預擴增引物1.5m L
rTaq 酶0.25m L
ddH2〇31.75mLEcoR I 預擴增引物5，-GACTGCGTACCAATTCA-3，(SEQ ID No. 5)；Taq I 預擴增引物5，-GATGAGTCCTGACCGAA-3，(SEQ ID No. 6)；反應程序94°C 4min ； (94 °C 30s，56°C lmin，72°C lmin) X 23 ；72°C IOmin0 擴 增結束后，取10 y L樣品瓊脂糖凝膠電泳檢測，在50 700bp區域應該有彌散，不應該有大 于2Kb的片段，點樣孔也不該有殘留，本實驗中對預擴產物的檢測表明，產物集中在1Kb以 內(如圖2)，在AFLP擴增的正常范圍內，表明cDNA酶切充分、連接及預擴增效果較好，為選 擇性擴增提供了理想的模板。1. 5選擇性擴增將預擴增產物稀釋15倍作為選擇性擴增的模板。選擇性擴增的體系
預擴增產物(稀釋15倍)5ML
10 X PCR Buffer5pL
dNTPs(四種成分各2.5mM)2μl25mM MgCI23μlEcoR I選擇性引物(見表1)1.5μlT"aq I選擇性引物(見表1)1.5μlrTaq 酶 0.25μlddH2〇 31.75μl表1 AFLP選擇性擴增弓丨物序列
權利要求
1.利用CDNA-AFLP法分離蘇太豬肌內脂肪含量差異表達基因的方法，其特征在于蘇太商品豬屠宰后采取背最長肌，根據肌內脂肪的含量從中選取最高和最低各5頭以上構建 RNA池，提取肌內脂肪部位的總RNA，以總RNA為模板合成雙鏈cDNA，用識別序列分別為6bp 和4bp的兩種限制性內切酶酶切雙鏈cDNA，酶切片段兩端與相應的限制性內切酶人工接頭序列連接后，利用與所述的限制性內切酶人工接頭序列互補的預擴增引物進行預擴增，再以預擴增產物為模板進行選擇性擴增，選擇性擴增產物通過變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，獲得脂肪含量差異表達基因的差異片段。
2.根據權利要求1所述的利用cDNA-AFLP法分離蘇太豬肌內脂肪含量差異表達基因的方法，其特征在于所述的識別序列為6bp的限制性內切酶為EcoR I限制性內切酶，所述的識別序列為6bp的限制性內切酶為Taq I限制性內切酶。
3.根據權利要求2所述的利用cDNA-AFLP法分離蘇太豬肌內脂肪含量差異表達基因的方法，其特征在于所述的EcoR I接頭序列為SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2, Taq I接頭序列接頭序列為 SEQ ID No. 3 和 SEQ ID No. 4。
4.根據權利要求2所述的利用cDNA-AFLP法分離蘇太豬肌內脂肪含量差異表達基因的方法，其特征在于所述的與EcoR I限制性內切酶人工接頭序列互補的預擴增引物序列為 SEQ IDNo. 5，與Taq I限制性內切酶人工接頭序列互補的預擴增引物序列為SEQ ID No. 6。
5.根據權利要求2所述的利用cDNA-AFLP法分離蘇太豬肌內脂肪含量差異表達基因的方法，其特征在于所述的選擇性擴增引物一條為EcoRI選擇性引物，另一條為TaqI選擇性引物。
6.根據權利要求2所述的利用cDNA-AFLP法分離蘇太豬肌內脂肪含量差異表達基因的方法，其特征在于所述的EcoRI選擇性引物選自El =SEQ ID No. 7，E2 =SEQ ID No. 8，E3 SEQ ID No. 9，E4 :SEQ ID No. 10，E5 :SEQ ID No. 11，E6 :SEQ ID No. 12，E7 :SEQ ID No. 13， E8 =SEQ ID No. 14，E9 =SEQ ID No. 15中的任意一條；所述的iTaqI選擇性引物選自Tl =SEQ ID No. 16，T2 =SEQ ID No. 17，T3 :SEQ ID No. 18，T4 :SEQ ID No. 19，T5 :SEQ ID No. 20, T6 SEQ ID No. 21, T7 =SEQ ID No. 22，T8 =SEQ ID No. 23 ；共形成72種選擇性擴增引物對組合。
7.根據權利要求2所述的利用cDNA-AFLP法分離蘇太豬肌內脂肪含量差異表達基因的方法，其特征在于所述的選擇性擴增PCR反應程序如下94°C 4min ;[94°C 30s, 65°C lmin(每個循環降低 0. 7°C )，72°C lmin] X 12 ； (94°C 30s, 56°C lmin，72°C lmin) X 25 ； 72 °C 7min。
8.根據權利要求1 7中任意一條所述的利用cDNA-AFLP法分離蘇太豬肌內脂肪含量差異表達基因的方法，其特征在于所述的分離蘇太豬肌內脂肪含量差異表達基因的方法還包括回收差異片段，進行克隆及測序。
全文摘要
本發明公開了cDNA-AFLP法分離蘇太豬肌內脂肪含量差異表達基因的方法。蘇太商品豬屠宰后采取背最長肌，根據肌內脂肪的含量從中選取最高和最低各5頭以上構建RNA池，提取肌內脂肪部位的總RNA，以總RNA為模板合成雙鏈cDNA，用識別序列分別為6bp和4bp的兩種限制性內切酶酶切雙鏈cDNA，酶切片段兩端與相應的限制性內切酶人工接頭序列連接后，利用與所述的限制性內切酶人工接頭序列互補的預擴增引物進行預擴增，再以預擴增產物為模板進行選擇性擴增，選擇性擴增產物通過變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，獲得脂肪含量差異表達基因的差異片段，回收差異片段，進行克隆及測序，從而獲得蘇太豬肌內脂肪含量差異表達基因。
文檔編號C12N15/10GK102286466SQ201110197190
公開日2011年12月21日 申請日期2011年7月14日 優先權日2011年7月14日
發明者張子敬, 張寶樂, 徐銀學, 李紀委 申請人:南京農業大學