專利名稱：一種發酵法生產2(5)-乙基-4-羥基-5(2)-甲基-3(2h)-呋喃酮的方法
技術領域：
本發明涉及到一種發酵法生產2 (5)-乙基-4-羥基-5 (2)-甲基_3 (2H)-呋喃酮的方法，屬于發酵技術領域。
背景技術：
2 (5)-乙基-4-羥基-5 O)-甲基-3 QH)-呋喃酮，簡稱HEMF。自然界主要存在于醬油中，故稱其為醬油酮，具有高強度的甜焦糖香，醬香特色。是有機化合物雜環香體類呋喃同系衍生物中極其重要而且用途極為廣泛的香料之一。HEMF是上世紀七十年代日本化學家從發酵釀造成的濃口型醬油中分離出，并確認為醬油中的主體香。HEMF即醬油中致香的特有成份，此后，許多國家以不同方法合成。在研究HEMF特性中，發現它不僅是人感官易于接受的良好香料，而且是制作香料中有價值的組成部分。它添加在釀造食品如調味料、酒、無酒精飲料及果制品如果醬、果漿、罐頭等食品中，將具有改進或加強其天然香味作用，并能提高或代替天然香料。同時，HEMF是美國食用制造者協會(FEMA)認可的安全食用香料。最近日本學者研究發現醬油酮還具有抗腫瘤活性。目前市場上銷售的HEMF基本都是化學合成的，少量的是以天然材料為原料合成的天然等同的HEMF。天然HEMF由于價格昂貴，只用于有特殊要求的食品中。天然HEMF與化學合成的HEMF相比，香氣純正、濃厚，具有不可替代性，在市場銷售份額中將不斷增加。 因此，利用微生物發酵法生產天然HEMF，具有廣闊的前景。
發明內容
本發明的目的在于提供一種用發酵法生產2(5)-乙基-4-羥基-5 )-甲基-3 (2H)-呋喃酮的方法，代替現行使用的化工合成方法生產HEMF。且該方法生產成本低， 效率高，產品香氣純正、濃厚，具有不可替代性。本發明的技術方案一種發酵法生產2 (5)-乙基-4-羥基-5⑵-甲基-3 (2H)-呋喃酮，簡稱為HEMF，的方法，該HEMF由下述發酵方法生產
(1)種子培養取活化后的斜面菌體KS18增香型耐高鹽酵母菌，挑取一滿環接入50mL 種子培養基中，接種后于25-37°C，100-250 rpm下進行發酵培養20-35 h；
所述KS18增香型耐高鹽酵母菌已在[食品與發酵工業2010年第36卷第3期31-35] 公開。所述斜面及種子培養基的組成成分g/L計葡萄糖20-25，蛋白胨10_15，酵母粉 5-10，NaCl 120-240，以自來水定容，pH 5. 0-6. 0 ；
(2)發酵培養將培養好的種子培養液，按照5%-15%的接種量接入發酵培養基中，接種后于 25-37°C，100-250 rpm 下培養 140-200 h 獲得 HEMF ；
所述的發酵培養過程中采用兩階段氯化鈉添加策略和氨基酸組合添加策略相結合的方法；初始氯化鈉濃度為120-200 g/L，在發酵30-60 h時添加氯化鈉至200440 g/L濃度， 并且在發酵過程中使用甘氨酸、丙氨酸和精氨酸組合添加，含量為1-10 g/L。所述的發酵培養基的組成成分g/L計己糖70-100，戊糖25-50，氮源1_10，甘氨酸、丙氨酸和精氨酸組合 1-10，KH2PO4 10-15，MgSO4 · 7H20 5-10, NaCl 120-240,以自來水定容，pH 5. 2-5. 4 ；
所述己糖選用葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖、山梨糖、山梨醇中的一種或幾種； 所述戊糖選用木糖、核糖、脫氧核糖、阿拉伯糖、木糖、核酮糖、木酮糖中的一種或幾
種；
氮源選用花生餅粉、蛋白胨、黃豆餅粉、棉子餅粉、玉米漿、魚粉、酵母膏中的一種或幾種。本發明的有益效果本發明方法可替代化工合成方法生產HEMF，這樣不僅生產成本低，效率高，而且可有效減輕對環境的污染。并且采用本發明的發酵方法在一定程度上提高產量及質量，通過本方法，使得HEMF的產量達到120-130 mg/L。
圖1發酵法生產HEMF的工藝流程圖。
具體實施例方式實施例1
發酵法生產2 (5)-乙基-4-羥基-5 (2)-甲基-3 (2H)-呋喃酮，步驟為
(1)取活化后的斜面菌體(KS18增香型耐高鹽酵母菌)，挑取一滿環接入50ml種子培養基中，接種后于30°C，150 rpm下進行發酵培養30 h；
(2)將培養好的種子培養液，按照10%的接種量接入發酵培養基中，接種后于30°C， 150 rpm下培養140 h獲得HEMF。步驟(1)中所述的菌種名稱為KS18增香型耐高鹽酵母菌，屬耐180140 g/L氯化鈉濃度的增香酵母菌。步驟(1)中所述的斜面培養基的組成成分(g/L)葡萄糖20，蛋白胨10，酵母粉 5，NaCl 200，瓊脂粉 12，pH 5.8-6.0。步驟(1)中所述的種子培養基的組成成分(g/L)葡萄糖20，蛋白胨10，酵母粉 5，NaCl 200，pH 5.8-6. 0。步驟O)中所述的發酵培養基的組成成分(g/L)葡萄糖75，木糖25，酵母膏1， 甘氨酸、丙氨酸和精氨酸組合 5，KH2PO4 10，MgSO4 · 7H20 5，NaCl 200，pH 5.2。步驟O)中所述的發酵過程中采用兩階段氯化鈉添加策略和氨基酸組合添加策略相結合的方法為初始氯化鈉濃度為200 g/L，在發酵40 h時添加氯化鈉至220 g/L濃度，并且在發酵過程中使用甘氨酸、丙氨酸和精氨酸組合含量為5 g/L。測定HEMF含量發酵液在10000 rpm下離心10 min后棄去上清液，用21過氧化氫脫色過濾后，用高效液相色譜法(HPLC)測定含量為122. 1 mg/L。實施例2
發酵法生產2 (5)-乙基-4-羥基-5 (2)-甲基-3 (2H)-呋喃酮，步驟為
4(1)取活化后的斜面菌體(KS18增香型耐高鹽酵母菌)，挑取一滿環接入50mL種子培養基中，接種后于30°C，150 rpm下進行發酵培養30 h；
(2)將培養好的種子培養液，按照10%的接種量接入發酵培養基中，接種后于30°C， 150 rpm下培養160 h獲得HEMF。步驟(1)中所述的菌種名稱為為KS18增香型耐高鹽酵母菌，屬耐180140 g/L氯化鈉濃度的增香酵母菌。步驟(1)中所述的斜面培養基的組成成分(g/L)葡萄糖20，蛋白胨10，酵母粉 5，NaCl 200，瓊脂粉 12，pH 5.8-6.0。步驟(1)中所述的種子培養基的組成成分(g/L)葡萄糖20，蛋白胨10，酵母粉 5，NaCl 200，pH 5.8-6. 0。步驟O)中所述的發酵培養基的組成成分(g/L)葡萄糖70，核糖30，蛋白胨5， 甘氨酸、丙氨酸和精氨酸組合 5，KH2PO4 10，MgSO4 · 7H20 5，NaCl 200，pH 5. 4。步驟O)中所述的發酵過程中采用兩階段氯化鈉添加策略和氨基酸組合添加策略相結合的方法為初始氯化鈉濃度為200 g/L，在發酵40 h時添加氯化鈉至220 g/L濃度，并且在發酵過程中使用甘氨酸、丙氨酸和精氨酸組合含量為5 g/L。測定HEMF含量利用高效液相色譜法測定HEMF含量，方法同實施例1，測得HEMF 含量為126 mg/L。
權利要求
1. 一種發酵法生產2 (5)-乙基-4-羥基-5 (2)-甲基-3 (2H)-呋喃酮，簡稱為HEMF，的方法，其特征在于該HEMF由下述發酵方法生產(1)種子培養取活化后的斜面菌體KS18增香型耐高鹽酵母菌，挑取一滿環接入50mL 種子培養基中，接種后于25-37°C，100-250 rpm下進行發酵培養20-35 h；所述斜面及種子培養基的組成成分g/L計葡萄糖20-25，蛋白胨10-15，酵母粉 5-10，NaCl 120-240，以自來水定容，pH 5. 0-6. 0 ；(2)發酵培養將培養好的種子培養液，按照5%-15%的接種量接入發酵培養基中，接種后于 25-37°C，100-250 rpm 下培養 140-200 h 獲得 HEMF ；所述的發酵培養過程中采用兩階段氯化鈉添加策略和氨基酸組合添加策略相結合的方法；初始氯化鈉濃度為120-200 g/L，在發酵30-60 h時添加氯化鈉至200440 g/L濃度， 并且在發酵過程中使用甘氨酸、丙氨酸和精氨酸組合添加，含量為1-10 g/L；所述的發酵培養基的組成成分g/L計己糖70-100，戊糖25-50，氮源1_10，甘氨酸、丙氨酸和精氨酸組合 1-10，KH2PO4 10-15，MgSO4 · 7H20 5-10, NaCl 120-240,以自來水定容， pH 5. 2-5. 4 ；所述己糖選用葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖、山梨糖、山梨醇中的一種或幾種； 所述戊糖選用木糖、核糖、脫氧核糖、阿拉伯糖、木糖、核酮糖、木酮糖中的一種或幾種；氮源選用花生餅粉、蛋白胨、黃豆餅粉、棉子餅粉、玉米漿、魚粉、酵母膏中的一種或幾種。
全文摘要
一種發酵法生產2(5)-乙基-4-羥基-5(2)-甲基-3(2H)-呋喃酮(HEMF)的方法，屬于發酵技術領域。本發明包括如下步驟(1)種子液培養；(2)發酵培養。通過采用兩階段氯化鈉添加策略和氨基酸組合添加策略相結合的方法，使HEMF的發酵生產率獲得大幅度提高。本發明方法可替代化工合成方法生產HEMF，產品香氣純正、濃厚。本發明發酵方法使HEMF的生產成本低，效率高，而且可有效減輕對環境的污染；并且采用本發明的發酵方法能夠提高產量及質量，在工業化生產中具有應用價值。
文檔編號C12P17/04GK102250978SQ20111019351
公開日2011年11月23日 申請日期2011年7月12日 優先權日2011年7月12日
發明者馮杰, 張麗敏, 詹曉北, 鄭志永 申請人:江南大學