專利名稱：自體nk細胞體外活化擴增培養的方法及其專用培養基的制作方法
技術領域：
本發明涉及免疫治療領域中一種自體NK細胞體外活化擴增培養的方法及其專用
培養基。
背景技術：
20世紀70年代Kiessling和Herberman首次在小鼠體內發現了一種區別于T細胞殺傷特征的免疫細胞并將其命名為自然殺傷細胞(natural killer cell)(以下，本發明說明書中省略為“NK細胞”)。NK細胞是機體抵抗惡性腫瘤和病毒感染的重要免疫調節細胞，起源于骨髓來源的CD34+造血祖細胞，無需有抗體存在或預先致敏便可直接殺傷腫瘤細胞，是腫瘤免疫治療的重要效應細胞。隨著對NK細胞識別人類腫瘤分子機制研究的深入， 以NK細胞為基礎的抗腫瘤免疫治療引起重視并取得重大進展。目前有關NK細胞在腫瘤免疫治療的研究主要集中在自體NK細胞過繼免疫治療、異體NK細胞過繼免疫治療及基因修飾NK細胞免疫治療等，并已取得顯著成效。但如何在保證臨床安全性的前提下提高NK細胞體外增殖效率和殺傷活性一直是科研工作者和臨床醫生共同探索研究的重點。目前各類動物模型試驗都已證明自體NK細胞過繼性治療是安全有效的， Alicie等報道應用自體NK細胞治療多發性骨髓瘤模型的同源免疫活性小鼠(Alici E， Konstan-tinidis KV, Sutlu Τ, et al. Exp Hematol，2007，35 (12) :1839-1846)，以及 Siegler等將體外活化擴增的急性骨髓性白血病(acute myeloid leukemia AML)患者 NK細胞對非肥胖糖尿病型重癥聯合免疫缺陷型(N0D/SCID)小鼠模型中的自體AML芽細胞殺傷都證實這一點(Siegler U, Kalberer CP, Nowbakht P, et al. Leukemia, 2005, 19(12). 2215-2222)。各種臨床研究證明自體NK細胞治療技術是一種安全有效的治療腫瘤手段。2009年5月1日我國衛生部頒布《醫療技術臨床應用管理辦法》正式生效，批準在國內開展自體免疫細胞(T細胞、NK細胞)治療技術并制定相應管理規范，使得探求一種安全有效的自體NK細胞體外活化擴增體系成為可能。目前主要是從培養基和血清種類，細胞刺激因子，輔助飼養細胞等各方面探索NK 細胞高效培養的捷徑。體外NK細胞擴增培養體系中，常用培養基分別為CellGro SCGM， RPMI-1640培養基，無血清培養基(X-VIVO TM Serum-free Media) 3大類。各培養基的使用效果證實CellGro SCGM培養基比RPMI-1640和X-VivolO培養基能更有效支持NK細胞生長活化與擴增。SCGM培養基是德國Cell Gro公司研制的一種用于造血干細胞培養的專門培養基(含有一些人源或人基因重組蛋白質)，已通過歐洲藥典委員會和歐洲藥物治療管理局認證，可以用于臨床。已知IL-2、IL-15、IL-18和IL-12等細胞因子對NK細胞的活化與擴增非常重要，其中IL-15的作用尤為重要。IL-2是體外擴增NK細胞體系中最常用的細胞因子，可以在24h反應期內提高NK殺傷活性并刺激其增殖。近期Mrivastava等研究證實IL-15單獨或聯合IL-2使用通常會導致最低限度NK細胞擴增(Strivastava S， Lundqvist A, Childs Rff. Cytotherapy, 2008,10 (8) :775-783)。大量研究證明細胞因子對 NK細胞的活化和擴增是必要的，但是僅有細胞因子并不能刺激NK細胞達到最理想的增殖狀態。Alici等在多發性骨髓瘤患者體外NK細胞擴增的研究中使用IL-2和0KT3作為其細胞刺激因子，細胞擴增明顯(Alici E, Sutlu T, Bjork strand B,Gilljam Μ, et al. Blood, 2008,111 (6) :3155-3162)。另外絕大多數研究人員認為NK細胞持續增殖需要在細胞因子的基礎上增加額外刺激信號，比如同種異體單核細胞、自體淋巴細胞、促分裂素活性淋巴細胞、臍血間充質干細胞等輔助飼養細胞。目前多采用病毒轉染的B淋巴細胞及腫瘤細胞作飼養細胞以提高NK細胞擴增倍數，但其安全性尚待探討。總體來說，目前的NK細胞擴增效果仍不能滿足實際應用，且安全性較低，臨床適
用性差。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種自體NK細胞體外活化擴增培養的方法及其專用培養基和含有該專用培養基的產品。該自體NK細胞體外活化擴增培養的方法可有效提高NK細胞的擴增倍數及殺傷活性并增加其安全性，從而使該細胞達到了能應用于臨床的細胞質量指標。本發明所提供的體外培養人NK細胞的成套培養基，由培養基1、培養基2和培養基 3組成；所述培養基1是在干細胞生長培養基中添加人白細胞介素2 (IL-幻、人白細胞介素 12(IL-12)、人白細胞介素15(IL-15)、人白細胞介素18 (IL-18)、植物血凝素(PHA)、抗人T 細胞CD3單克隆抗體(OKB)和離體的人血漿得到的液體培養基。所述培養基2與所述培養基1相比，所述培養基2中無所述植物血凝素(PHA)和所述抗人T細胞CD3單克隆抗體(0KT3)，其它成分均與所述培養基1的相同；所述培養基3與所述培養基2相比，所述培養基3將所述培養基2中的所述離體的人血漿替換為離體的人AB血清，其它成分均與所述培養基2的相同。其中，所述培養基1、培養基2和培養基3中，所述人白細胞介素2的終濃度均為 500U/ml，所述人白細胞介素12的終濃度均為lOng/ml，所述人白細胞介素15的終濃度均為 20ng/ml，所述人白細胞介素18的終濃度均為lOng/ml。所述培養基1和培養基2中，所述離體的人血漿終濃度均為5% (體積百分比)；所述培養基1中，所述植物血凝素(PHA)的終濃度為2 μ g/ml、抗人T細胞⑶3單克隆抗體(0KT3)的終濃度為lOOng/ml ；所述培養基3中，所述離體的人AB血清的終濃度為5% (體積百分比)。所述抗人T細胞CD3單克隆抗體(0KT3)具體可為鼠抗人T細胞CD3單克隆抗體。上述成套培養基中，所述干細胞生長培養基是德國CellGro公司生產的SCGM培養基。上述成套培養基可按照包括如下步驟的方法制備分別制備所述培養基1、所述培養基2和所述培養基3，再將所述培養基1、所述培養基2和所述培養基3分別進行獨立包裝，得到所述成套培養基。本發明還提供了體外培養人NK細胞的產品。本發明所提供的體外培養人NK細胞的產品，由上述體外培養人NK細胞的成套培養基和飼養細胞組成，所述成套培養基和所述飼養細胞均獨立包裝；所述飼養細胞為將離體的人PBMC細胞經射線輻照后得到的細胞；所述飼養細胞和所述成套培養基中的所述離體的人血漿均來自同一個體。
所述飼養細胞具體可為將離體的人PBMC細胞經30Gy γ射線輻照后得到的細胞。所述γ射線輻照中的輻照速率具體可為200cGy/min。體外培養人NK細胞的產品可按照包括如下步驟的方法制備將所述成套培養基和所述飼養細胞分別獨立包裝，得到所述體外培養人NK細胞的產品。所述飼養細胞可放入瓶中，該飼養細胞瓶可裝入如下包裝盒鋼精鋁質圓筒，直徑 6cm，高10cm，泡沫塑料內架設置凹槽(直徑2. 5cm，高8cm)。將飼養細胞瓶完全包埋在內架中央。此包裝盒適于-80°C保存及干冰冷凍運輸。本發明所提供的利用上述任一所述的產品體外培養人NK細胞的方法，包括以下步驟1)將離體的人NK細胞作為種子加入所述培養基1中并添加所述飼養細胞培養3-4天后，將經所述培養基1培養的人NK細胞轉入所述培養基2中并添加所述飼養細胞培養至第 14天，第15天開始將經所述培養基2培養的人NK細胞轉入所述培養基3中并添加所述飼養細胞進行培養，直至第21天得到擴增后的人NK細胞；上述培養時間均以接入所述培養基 1的時刻為0時刻；所述離體的人NK細胞、所述飼養細胞和所述離體的人血漿來自于同一個體。所述飼養細胞和所述離體的人NK細胞可按照10 1的個數比加入所述培養基1， 所述飼養細胞和所述經所述培養基1培養的人NK細胞可按照10 1的個數比加入所述培養基2，所述飼養細胞和所述經所述培養基2培養的人NK細胞可按照10 1的個數比加入所述培養基3。所述培養基1、所述培養基2和所述培養基3中，所述飼養細胞的含量均可為 2X IO6 個/ml。所述離體的人NK細胞、所述飼養細胞和上述任一成套培養基中的所述離體的人血漿來自于同一個體。所述方法中，所述培養的條件可均為35 °C -37 °C、空氣中CO2體積含量為 4. 0% -10. 0%和(X)2 流速為 0. 10L/min-0. 25L/min。所述方法中，所述溫度具體可為37°C，所述空氣中(X)2體積含量具體可為5. 0%, 所述(X)2流速具體可為0. 15L/min。本發明方法擴增得到的人NK細胞是CD3—CD56+NK細胞，本發明的方法使體外自體 NK細胞的擴增效果增強，經過三周的培養NK細胞大量增殖，NK細胞純度達到96. 83%, NK 細胞總數擴增了 137倍，經流式細胞儀檢測得NK細胞活化性受體上調。本發明方法擴增得到的人NK細胞可用于治療患者自體的疾病或阻滯疾病(尤其是癌癥、免疫缺陷病等疾病)發展。自體NK細胞非腫瘤細胞系，直接輸注患者體內不具有增殖成瘤的危險性，安全性更高。以患者自體外周單個核細胞(PBMC)來源的NK細胞作為飼養細胞，無異體腫瘤細胞，與采用病毒轉染的B淋巴細胞及腫瘤細胞作飼養細胞的自體 NK細胞擴增法相比安全性更高；用患者自體血漿代替動物血清，在倫理學方面患者易于接受。活化擴增后的NK細胞在體外對腫瘤細胞(K562細胞、H0-8910細胞、自體原代卵巢癌細胞)的殺傷活性是活化擴增前的NK細胞的2倍以上，活化擴增后的NK細胞在體內對早期和晚期荷人卵巢癌腹水瘤裸鼠均有治療作用，具體表現為用本發明方法擴增得到的人NK 細胞治療后的早期荷人卵巢癌腹水瘤裸鼠中位生存期由治療對照組的65天延長至117天； 用本發明方法擴增得到的人NK細胞治療后的晚期荷人卵巢癌腹水瘤裸鼠中位生存期由治療對照組的64天延長至95天。外源性因子(細菌、支原體、真菌、病毒及添加成分殘留等)和PCR等檢測結果表明，本發明方法擴增得到的人NK細胞的安全性符合臨床研究的相關標準。本發明從臨床安全性、有效性的角度提高NK細胞的擴增倍數及活性，并從NK細胞來源，培養基和血清種類，細胞刺激因子，輔助飼養細胞等各方面條件聯合培養細胞，以期優化NK細胞體外擴增的效率及殺傷活性，為NK細胞的進一步臨床應用奠定基礎。
圖1為卵巢癌患者(低分化漿液性腺癌)癌組織HE染色圖片圖2為原代卵巢癌細胞鏡下圖片圖3為擴增活化前NK細胞表面分子的表達情況圖4為NK細胞在培養基1、培養基2和培養基3中的生長速率圖5為擴增活化后NK細胞表面分子的表達情況圖6為不同效靶比NK細胞(擴增前)對K562細胞、H0-8910細胞和自體原代卵巢癌細胞的殺傷率圖7為活化擴增前后的NK細胞對K562細胞殺傷活性的變化圖8為活化擴增前后的NK細胞對Ho-8910細胞殺傷活性的變化圖9為活化擴增前后的NK細胞對自體原代卵巢癌細胞殺傷活性的變化圖10為不同效靶比NK細胞(擴增活化后)對K562細胞、H0-8910細胞和自體原代卵巢癌細胞的殺傷率圖IlA為腹腔注射2 X IO6個Ho_8910細胞第21天鼠荷瘤情況圖IlB為早期治療組和治療對照組兩組鼠腹圍圖IlC為早期治療組和治療對照組兩組鼠生存率圖12A為腹腔注射2X IO6個Ho_8910細胞第35天鼠荷瘤情況圖12B為晚期治療組和治療對照組兩組鼠腹圍圖12C為晚期治療組和治療對照組兩組鼠生存率
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可以從商業途徑得到。材料MACS磁珠購自Miltemyi Biotec公司，胎牛血清購自美國Hyclone公司，CellGro SCGM細胞培養基購自德國CellGro公司，RPMI-1640培養基購自美國GIBCO公司，人白細胞介素2(IL-2)購自北京四環生物制藥有限公司、國藥準字S10970015，人白細胞介素12(IL-12)購自PEPR0TECH公司、商品目錄號:200_12，人白細胞介素15(IL_15)購自 PEPR0TECH公司、商品目錄號:200-15，人白細胞介素18(IL_18)購自PR0SPEC公司、商品目錄號CYT469，植物血凝素(PHA)購自sigma公司、商品目錄號L8754，抗人T細胞CD3鼠單抗(OKB)購自武漢生物制品研究所、國藥準字S19990012，人AB血清購自上海佳倫生物科技有限公司、商品目錄號JL1010，51Cr購自中國同位素總公司，人紅白血病細胞系K562 購自中國科學院上海細胞研究所，人卵巢癌細胞株Ho-8910購自中國科學院上海細胞生物研究所細胞庫，裸鼠購于南京大學動物模式研究所，青霉素-鏈霉素溶液(100X)購自上海碧云天生物技術有限公司。CO2細胞培養箱購自ThermoR)rma公司，SW-CJ-2FB型雙人水平垂直兩用凈化工作臺購自蘇州凈化公司，倒置生物顯微鏡》)S-1B購自重慶奧特顯微鏡廠，pH計Delta320購自Mettler-Toledo，數顯恒溫水浴箱HH-2購自江蘇金壇市環宇科學儀器廠，78-1型磁力加熱攪拌器購自江蘇安普電子工程有限公司，超低溫冰箱購自Harris Manufa-cturing CO 公司，離心管(50ml，20ml)購自Corning公司，25cm2矩形培養瓶購自Corning公司，移液管(10ml、25ml)購自Costar STRIPETTE公司，電動移液槍購自Dragon MED公司，凍存管購自Corning公司，常溫離心機1-15K購自Sigma公司，低溫冷凍離心機1-15K購自Sigma 公司，低溫冷凍離心機R0TAN4R購自Sigma公司，γ射線輻照儀(Biobeam 2000)購自德國 ΒΙ0ΒΕΑΜ公司，Y-計數儀(GC-911)購自安徽中科中佳科學儀器有限公司，β -液體閃爍計數儀(FJ-2107A)購自西安262廠。實驗方法本發明涉及的NK細胞來自血液樣本。血液樣本的采集可來源于各種免疫缺陷疾病患者的血液自身免疫性疾病(溶血性貧血，系統性紅斑狼瘡，糖尿病等)、傳染性疾病 (肺結核，艾滋病等)以及惡性血液疾病(急性髓細胞性白血病，慢性淋巴細胞白血病等) 或癌癥(多發性骨髓瘤，腎癌等)。為多方面充分評價自體NK細胞的安全性和有效性，下述實施例選取的血液樣本來自于卵巢癌患者(漿液性)。NK細胞可以通過目前已知的各種方法純化，例如可通過抗體標記流式細胞儀分選、Percoll不連續密度梯度離心法、Panning法、補體裂解法、綿羊紅細胞花環法、試劑盒分選法。下述實施例1采用NK細胞分離試劑盒，用MACS法分選純化NK細胞。下述實施例1中的擴增活化前的NK細胞均按照如下方法獲取1、外周血標本肝素鈉抗凝管采集卵巢癌患者外周血50ml，并經患者同意。2、自體血漿制備取50ml患者外周血，經1500rpmX5min低速離心后吸取上層淡黃色血漿即為自體血漿，置4°C冰箱備用。3、外周血單個核細胞的分離Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個核細胞。1)取剩余抗凝血與PBS 1 1充分混勻。2)短管中加入等體積的淋巴細胞分離液(購自天津灝洋生物制品科技有限責任公司，商品目錄號CDS1075)，用滴管沿管壁將血液緩慢加于分離液面上，注意保持清楚的界面。水平離心1500-2000rpmX20分鐘。離心機升速為1，降速為0。3)離心后管內分為三層，上層為血漿和PBS液，下層主要為紅細胞和粒細胞。中層為淋巴細胞分離液，在上、中層界面處有一以單個核細胞為主的白色云霧層狹窄帶，單個核細胞包括淋巴細胞和單核細胞。4)用毛細管插到云霧層，吸取單個核細胞。置入另一短中管中，加入5倍以上體積的PBS，1500rpmX 10分鐘，洗滌細胞兩次。短中管中即為分離所得的外周血單個核細胞 (PBMCs)4、自體飼養細胞的制備步驟3中所得的外周血單個核細胞(PBMCs)分為兩部分， 第一部分用于分選高純度的NK細胞，第二部分用以137Cs為輻照源的γ射線進行輻照作為飼養細胞。所述輻照的劑量可為20Gy-100Gy。所述輻照的速率可為50cGy/min-200cGy/min0下述實施例1的飼養細胞是將外周血單個核細胞(PBMCs)進行如下以137Cs為輻照源的Y射線輻照得到的輻照劑量為30Gy，輻照的速率為200cGy/min。5、MACS法分選高純度的NK細胞利用NK細胞分選試劑盒(NK Cell Isolation Kit II，德國Miltenyi Biotec公司，商品目錄號130-091-152)按照如下方法分離NK細胞計數步驟3中所得的第一部分PBMCs，準備磁珠標記并用流式細胞儀分析擴增前NK細胞的含量(絕對值及百分比)。將細胞1500rpmX10min離心后棄上清，按40ul/107個細胞加入MACS buffer重懸細胞，按照10ul/107個細胞加入生物素一抗(NK cell Biotin Antibody Cocktail)混勻后 4°C孵育 lOmin，按 30ul/107 個細胞加入 MACS buffer 同時按 20ul/107 個細胞加入生物素二抗(NK cell MicroBeads Cocktail)混勻后 4°C孵育 15min， 離心棄上清，按500ul/108個細胞重懸細胞。將LS分離柱放置在分離器(Vario MACS)上， 下方放置12ml無菌離心管，將3mlMACS buffer緩沖釋液緩慢加入分選柱中，待buffer開始滴下時加入細胞懸液，收集未標記的細胞，待細胞懸液通過時用:3ml buffer洗柱3次，試管中的細胞即為NK細胞(擴增前的NK細胞)。下述實施例1中的NK細胞的生物學特性均按照下述方法檢測一、流式細胞儀分析MACS分選后NK細胞的情況及表面分子①使用流式細胞儀檢測NK細胞表面分子(⑶3、⑶56、NKp30, NKp44, NKp46和 NKG2D)的表達，所述抗體如表1所示表1流式細胞儀檢測所用抗體
權利要求
1.體外培養人NK細胞的成套培養基，由培養基1、培養基2和培養基3組成；所述培養基1是在干細胞生長培養基中添加人白細胞介素2、人白細胞介素12、人白細胞介素15、人白細胞介素18、植物血凝素、抗人T細胞CD3單克隆抗體和離體的人血漿得到的液體培養基；所述培養基2與所述培養基1相比，所述培養基2中無所述植物血凝素和所述抗人T 細胞CD3單克隆抗體，其它成分均與所述培養基1的相同；所述培養基3與所述培養基2相比，所述培養基3將所述培養基2中的所述離體的人血漿替換為離體的人AB血清，其它成分均與所述培養基2相同。
2.根據權利要求1所述的成套培養基，其特征在于所述培養基1、培養基2和培養基3中，所述人白細胞介素2的終濃度均為500U/ml，所述人白細胞介素12的終濃度均為 lOng/ml，所述人白細胞介素15的終濃度均為20ng/ml，所述人白細胞介素18的終濃度均為 10ng/ml ；所述培養基1和培養基2中，所述離體的人血漿終濃度均為5% (體積百分比)；所述培養基1中，所述植物血凝素(PHA)的終濃度為2yg/ml、抗人T細胞CD3單克隆抗體(OKT3)的終濃度為lOOng/ml ；所述培養基3中，所述離體的人AB血清的終濃度為5% (體積百分比)。
3.體外培養人NK細胞的產品，由權利要求1或2所述的體外培養人NK細胞的成套培養基和飼養細胞組成，所述成套培養基和所述飼養細胞均獨立包裝；所述飼養細胞為將離體的人PBMC細胞經射線輻照后得到的細胞；所述飼養細胞和所述成套培養基中的所述離體的人血漿均來自同一個體。
4.根據權利要求3所述的產品，其特征在于所述飼養細胞為將離體的人PBMC細胞經 30Gyy射線輻照后得到的細胞。
5.根據權利要求3或4所述的產品，其特征在于所述γ射線輻照中的輻照速率為 200cGy/mino
6.權利要求1或2所述的成套培養基的制備方法，包括如下步驟分別制備所述培養基1、所述培養基2和所述培養基3，再將所述培養基1、所述培養基2和所述培養基3分別進行獨立包裝，得到所述成套培養基。
7.權利要求3-5中任一所述產品的制備方法，包括如下步驟將按照權利要求6所述的方法制備得到的成套培養基和權利要求3-5中任一所述的飼養細胞分別獨立包裝，得到所述體外培養人NK細胞的產品。
8.利用權利要求3至5中任一所述的產品體外培養人NK細胞的方法，包括以下步驟 1)將離體的人NK細胞作為種子加入所述培養基1中并添加所述飼養細胞培養3-4天后， 將經所述培養基1培養的人NK細胞轉入所述培養基2中并添加所述飼養細胞培養至第14 天，第15天開始將經所述培養基2培養的人NK細胞轉入所述培養基3中并添加所述飼養細胞進行培養，直至第21天得到擴增后的人NK細胞；上述培養時間均以接入所述培養基1 的時刻為O時刻；所述離體的人NK細胞、所述飼養細胞和所述離體的人血漿來自于同一個體。
9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于所述飼養細胞和所述離體的人NK細胞按照10 1的個數比加入所述培養基1，所述飼養細胞和所述經所述培養基1培養的人NK細胞按照10 1的個數比加入所述培養基2，所述飼養細胞和所述經所述培養基2培養的人 NK細胞按照10 1的個數比加入所述培養基3。
10.根據權利要求8和9所述的方法，其特征在于所述方法中，所述培養的條件均為 350C -37"C、空氣中 CO2 體積含量為 4. 0% -10. 0%和 CO2 流速為 0. lOL/min-O. 25L/min ；具體可為如下培養條件所述溫度為37°C，所述空氣中CO2體積含量為5. 0%，所述(X)2流速為 0.15L/min。
全文摘要
本發明公開了一種自體NK細胞體外活化擴增培養的方法及其專用培養基。該方法是利用如下成套培養基并同時添加飼養細胞體外活化擴增自體NK細胞由培養基1、培養基2和培養基3組成的成套培養基；所述培養基1是在干細胞生長培養基中添加人白細胞介素2、人白細胞介素12、人白細胞介素15、人白細胞介素18、植物血凝素、抗人T細胞CD3單克隆抗體和離體的人血漿得到的液體培養基；所述培養基2與所述培養基1相比，所述培養基2中無所述植物血凝素和所述抗人T細胞CD3單克隆抗體，其它成分均與所述培養基1的相同；所述培養基3與所述培養基2相比，所述培養基3將所述培養基2中的所述離體的人血漿替換為離體的人AB血清，其它成分均與所述培養基2的相同。
文檔編號C12N5/0783GK102268405SQ201110187858
公開日2011年12月7日 申請日期2011年7月6日 優先權日2011年7月6日
發明者丁玉蘭, 馮定慶, 周虎, 周穎, 宣恒華, 張麗娜, 李青, 桂云, 王曉麗, 程敏, 趙衛東, 金夏, 馬杰 申請人:安徽省立醫院