專利名稱：一種芽孢桿菌微生態(tài)制劑及其液固結(jié)合發(fā)酵制備工藝的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及的是一種以枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌為主的微生態(tài)制劑，還涉及這種微生態(tài)制劑的液固結(jié)合發(fā)酵制備工藝。
背景技術：
微生態(tài)制劑是采用有益微生物，經(jīng)培養(yǎng)、發(fā)酵、干燥、加工等工藝制成含有活菌的活菌劑或者包含菌體及其代謝產(chǎn)物的制劑，具有抗病、治病、促生長等功能，而且具有無殘留污染，無副作用和不產(chǎn)生抗藥性等特點。枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌是微生態(tài)制劑的理想菌種，包括在我國農(nóng)業(yè)部公布的可直接飼喂動物的飼料級微生物添加劑中。它們耐酸， 耐堿，耐高溫，在制粒過程中及動物胃腸道中均能保持穩(wěn)定；枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌能分泌蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶以及多種氨基酸，從而提高飼料轉(zhuǎn)化率，促進動物生長，縮短飼養(yǎng)周期；并且能促進雙歧桿菌、乳酸桿菌和梭菌等厭氧菌的生長，有效抑制腸道中腸桿菌和腸球菌等需氧菌的生長，促進宿主腸道正常菌群生長，維持腸道微生態(tài)平衡。傳統(tǒng)微生態(tài)制劑的制備多采用固態(tài)發(fā)酵工藝，固態(tài)發(fā)酵工藝簡單，生產(chǎn)成本較低， 但存在產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定，發(fā)酵過程易污染，干燥過程能耗大等缺點。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有制備芽孢桿菌微生態(tài)制劑的技術工藝活菌數(shù)不穩(wěn)定， 易污染雜菌等缺陷，提出一種新的制備芽孢桿菌微生態(tài)制劑的工藝方法。該方法采用液固結(jié)合制備芽孢桿菌微生態(tài)制劑，工藝簡單，不易污染雜菌，活菌數(shù)穩(wěn)定，可達IO8個活菌/g 以上。本發(fā)明的目的是通過以下技術方案實現(xiàn)的本發(fā)明提供一種微生物飼料添加劑及其制備方法。其特征是以液體培養(yǎng)基A，在35 37°C條件下分別培養(yǎng)枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis)和地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis) 17 M 小時，制成擴培液，菌數(shù)達到IOltVmL以上，并按照重量比5 10%與經(jīng)滅菌后的固體培養(yǎng)基B進行混勻接種，隨后在35 37°C條件下進行超短期(廣2小時)固體發(fā)酵，利用了芽孢桿菌在環(huán)境變化時容易產(chǎn)生芽孢的特點，使代謝活躍的菌體在固體培養(yǎng)基中經(jīng)短期發(fā)酵后迅速成熟并生成芽孢。隨后進行粉碎、包裝，制成微生物飼料添加劑。液體培養(yǎng)基A的組成為1. 0% (m/V)酵母浸粉，1. 6% (m/V)蛋白胨，0. 5% (m/V) NaCl，水，ρΗ6· 0 7· 0。固體培養(yǎng)基B的組成為1. 2% (m/m)葡萄籽提取物，98. 8% (m/m)麩皮。制備步驟如下。出發(fā)菌株為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)，保藏編號=CICC 20037 ；地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)，保藏編號CICC 23584。1)一級種子培養(yǎng)一級液體種子培養(yǎng)基蛋白胨16g/L，酵母粉10g/L，NaCl 5g/L，PH 6. (Γ7. 0，121°C滅菌20min ；培養(yǎng)條件將枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌分別接種于固體LB培養(yǎng)基平板，37°C培養(yǎng)Mh，挑取單菌落接種于IOmL液體種子培養(yǎng)基，于旋轉(zhuǎn)式搖床 200rpm，37°C培養(yǎng)14 1他，得到一級種子液；
2)二級種子培養(yǎng)二級液體種子培養(yǎng)基蛋白胨16g/L，酵母粉10g/L，NaCl 5g/L，pH 6. (Γ7. 0，121°C滅菌20min ；培養(yǎng)條件于IL三角瓶中裝入200mL 二級液體種子培養(yǎng)基，分別接種上述一級種子液，37°C，200rpm培養(yǎng)，發(fā)酵10 1他，得到二級種子液；
3)高密度液體發(fā)酵補料液葡萄糖500g/L，蛋白胨200g/L；液體培養(yǎng)基蛋白胨16g/ L，酵母粉10 g/L，NaCl 5 g/L，pH 6. 0 7· 0，121°C滅菌20min ；培養(yǎng)條件于5 50L發(fā)酵罐中裝入50%體積的液體培養(yǎng)基，接種培養(yǎng)基體積的上述二級種子液，370C，攪拌200rpm 培養(yǎng)6、h后，開始流加補料液，流速50mL/min，發(fā)酵至17l4h，停止發(fā)酵，得到高密度菌體發(fā)酵液；
4)固相載體處理固相培養(yǎng)基(麩皮和質(zhì)量比的葡萄籽提取物)采用微波干燥殺菌，功率IOkff時間30min，水分含量彡5% ；
5)液固混配將步驟3)中所得的菌體發(fā)酵液按照重量比廣10%與步驟4)中處理后的固相培養(yǎng)基分別混合，充分拌勻，得到發(fā)酵曲；
6)快速固體發(fā)酵將步驟5)中所得發(fā)酵曲在35 37°C條件下靜置廣3h，進行快速固體發(fā)酵，使菌種成熟并產(chǎn)生芽孢，得到固體發(fā)酵產(chǎn)物；
7)粉碎將步驟6)中得到的上述固體發(fā)酵產(chǎn)物粉碎，過4(Γ60目篩，經(jīng)過分袋包裝得到成品微生態(tài)制劑。步驟1)中固體LB培養(yǎng)基配方蛋白胨16g/L，酵母粉10 g/L, NaCl 5 g/L, pH 6. 0 7· 0，瓊脂 15g/L, 121°C 滅菌 20min。步驟3)中液體發(fā)酵產(chǎn)物活菌數(shù)約為lO^VmL。步驟6)中產(chǎn)品的活菌數(shù)約為108/g，芽孢率彡80%。步驟7)中得到的芽孢桿菌微生態(tài)制劑以0. 1%的量添加于畜禽類飼料中，用于降
低畜禽腹瀉率，提高采食量，提高日增重。本發(fā)明所述方法采用液固結(jié)合發(fā)酵制備工藝，即在液體發(fā)酵罐中進行單一菌種高密度發(fā)酵，這不僅實現(xiàn)了嚴格意義上的純培養(yǎng)，而且活菌數(shù)達到IOltVmL以上，然后再進行液體與固體混配，從而制成各種不同規(guī)格的液體或固體產(chǎn)品。產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定可控，能耗大幅下降，生產(chǎn)過程無三廢產(chǎn)生，屬于清潔生產(chǎn)工藝。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例來進一步詳細闡述本發(fā)明。實施例1 地衣芽孢桿菌微生態(tài)制劑的液固結(jié)合發(fā)酵工藝。將枯草芽孢桿菌(Bacillus subtil is)接種于固體LB培養(yǎng)基平板，37°C培養(yǎng)Mh， 挑取單菌落接種于液體種子培養(yǎng)基(蛋白胨1. 6%，酵母粉1. 0%，NaCl 0. 5%，ρΗ6. (Γ7. 0)，于旋轉(zhuǎn)式搖床200rpm，37°C培養(yǎng)16h，得到一級種子液。于IL三角瓶中裝入20%體積的液體種子培養(yǎng)基，分別接種1%上述一級種子液，37°C，200rpm培養(yǎng)，發(fā)酵16h，得到二級種子液。于 IOL發(fā)酵罐中裝入50%體積的液體培養(yǎng)基，接種1%上述二級種子液，370C，攪拌轉(zhuǎn)速200rpm 培養(yǎng)6、h后，開始流加補料液，流速50mL/min，發(fā)酵至17l4h，停止發(fā)酵。麩皮和質(zhì)量比 1°Γ2%的葡萄籽提取物采用微波干燥殺菌，功率IOkW時間30min水分含量5%，按照質(zhì)量比廣10%的比例將發(fā)酵產(chǎn)物與微波處理后的固體培養(yǎng)基混合，充分拌勻，得到發(fā)酵曲，將發(fā)酵曲在37°C條件下靜置廣3h，進行快速固體發(fā)酵，使菌種成熟并產(chǎn)生芽孢，得到固體發(fā)酵產(chǎn)物。將發(fā)酵產(chǎn)物粉碎，過4(Γ60目篩，得到枯草芽孢桿菌微生態(tài)制劑。實施例2 枯草芽孢桿菌微生態(tài)制劑的液固結(jié)合發(fā)酵工藝。將地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)接種于固體LB培養(yǎng)基平板，37 °C 培養(yǎng)Mh，挑取單菌落接種于液體種子培養(yǎng)基(蛋白胨1. 6%，酵母粉1. 0%，NaCl 0. 5%， ρΗ6. 0 7.0)，于旋轉(zhuǎn)式搖床200rpm，37°C培養(yǎng)16h，得到一級種子液。于IL三角瓶中裝入20% 體積的液體種子培養(yǎng)基，分別接種1%上述一級種子液，37°C，200rpm培養(yǎng)，發(fā)酵16h，得到二級種子液。于IOL發(fā)酵罐中裝入50%體積的液體培養(yǎng)基，接種1%上述二級種子液，37°C，攪拌轉(zhuǎn)速200rpm培養(yǎng)6、h后，開始流加補料液，流速50mL/min，發(fā)酵至17 24h，停止發(fā)酵。麩皮和質(zhì)量比的葡萄籽提取物采用微波干燥殺菌，功率IOkW時間30min水分含量5%， 按照質(zhì)量比廣10%的比例將發(fā)酵產(chǎn)物與微波處理后的固體培養(yǎng)基混合，充分拌勻，得到發(fā)酵曲，將發(fā)酵曲在37°C條件下靜置廣3h，進行快速固體發(fā)酵，使菌種成熟并產(chǎn)生芽孢，得到固體發(fā)酵產(chǎn)物。將發(fā)酵產(chǎn)物粉碎，過40飛0目篩，得到地衣芽孢桿菌微生態(tài)制劑。
權(quán)利要求
1.一種微生態(tài)制劑，由枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌活菌分別與固體載體組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種微生態(tài)制劑，其特征在于使用的固體培養(yǎng)基中含有麩皮和(質(zhì)量比)的葡萄籽提取物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述微生態(tài)制劑，其制備方法包括以下步驟1)一級種子培養(yǎng)一級液體種子培養(yǎng)基蛋白胨16g/L，酵母粉10g/L，NaCl 5g/L， PH 6. (Γ7. 0，121°C滅菌20min ；培養(yǎng)條件將枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌分別接種于固體LB培養(yǎng)基平板，37°C培養(yǎng)Mh，挑取單菌落接種于IOml液體種子培養(yǎng)基，于旋轉(zhuǎn)式搖床 200rpm，37°C培養(yǎng)14 1他，得到一級種子液；2)二級種子培養(yǎng)二級液體種子培養(yǎng)基蛋白胨16g/L，酵母粉10g/L，NaCl 5g/L，pH 6. (Γ7. 0，121°C滅菌20min ；培養(yǎng)條件于IL三角瓶中裝入200ml 二級液體種子培養(yǎng)基，分別接種上述一級種子液，37°C，200rpm培養(yǎng)，發(fā)酵10 1他，得到二級種子液；3)高密度液體發(fā)酵補料液葡萄糖500g/L，蛋白胨200g/L；液體培養(yǎng)基蛋白胨16g/ L，酵母粉10 g/L，NaCl 5 g/L，pH 6. 0 7· 0，121°C滅菌20min ；培養(yǎng)條件于5 50L發(fā)酵罐中裝入50%體積的液體培養(yǎng)基，接種培養(yǎng)基體積的上述二級種子液，370C，攪拌200rpm 培養(yǎng)6、h后，開始流加補料液，流速50ml/min，發(fā)酵至17 24h，停止發(fā)酵，得到高密度菌體發(fā)酵液；4)固相載體處理固相培養(yǎng)基(麩皮和質(zhì)量比的葡萄籽提取物)采用微波干燥殺菌，功率IOkff時間30min，水分含量彡5% ；5)液固混配將步驟3)中所得的菌體發(fā)酵液按照重量比廣10%與步驟4)中處理后的固相培養(yǎng)基分別混合，充分拌勻，得到發(fā)酵曲；6)快速固體發(fā)酵將步驟5)中所得發(fā)酵曲在35 37°C條件下靜置廣3h，進行快速固體發(fā)酵，使菌種成熟并產(chǎn)生芽孢，得到固體發(fā)酵產(chǎn)物；7)粉碎將步驟6)中得到的上述固體發(fā)酵產(chǎn)物粉碎，過4(Γ60目篩，經(jīng)過分袋包裝得到成品微生態(tài)制劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述微生態(tài)制劑的制備方法，其特征在于使用液體培養(yǎng)基高密度發(fā)酵枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌后，按照重量比廣10%分別與經(jīng)滅菌后的固體培養(yǎng)基進行混勻接種，隨后在35 37°C條件下進行超短期(廣3小時)固體發(fā)酵。
全文摘要
本發(fā)明提供一種微生物飼料添加劑及其制備方法。主要工藝過程是以液體培養(yǎng)基在35~37℃條件下分別培養(yǎng)枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌17~24小時，與經(jīng)滅菌后的含有麩皮和葡萄籽提取物的固體培養(yǎng)基進行混勻接種，隨后在35~37℃條件下進行短期(1~3小時)固體發(fā)酵，利用芽孢桿菌在環(huán)境變化時容易產(chǎn)生芽孢的特點，使代謝活躍的菌體經(jīng)短期固體發(fā)酵后迅速成熟并生成芽孢。隨后進行粉碎、包裝，制成微生物飼料添加劑，有效菌數(shù)≥1×108CFU/g，以0.1%的量添加于畜禽類飼料中，用于降低畜禽腹瀉率，降低染病率，提高采食量，提高日增重。
文檔編號C12R1/125GK102409007SQ201110184359
公開日2012年4月11日 申請日期2011年7月4日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月4日
發(fā)明者劉晉生, 劉陽, 吳雅倩, 孫駿躍, 宋詼, 徐健勇, 李麗, 譚明, 鄭雯 申請人:天津工業(yè)生物技術研究所, 天津市育琪生物技術有限公司