專利名稱：少動鞘氨醇單胞菌的crtZ基因、crtG基因及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及動鞘氨醇單胞菌的β-胡蘿卜素羥化酶基因(crtz)和2，2' -β羥化酶基因(crtG)、基因敲除的重組菌株及應用。
背景技術：
結冷膠是由少動鞘氨醇單胞菌產生的新型微生物胞外多糖。與同類產品相比， 結冷膠具有很多優越性能，如用量少；形成的凝膠透明度高；凝固點、熔點、彈性等可調；耐酸、耐堿、耐高溫；良好的水溶性、呈味性、保濕性等。其諸多優良特性決定了其廣闊的市場前景。目前，結冷膠已被用作乳化劑、懸浮劑、增稠劑、穩定劑、凝膠劑、緩釋劑、成膜材料等廣泛應用于食品和醫藥行業。此外，結冷膠還可與其他食品膠復配使用，以滿足食品最佳的感官、質構和穩定性要求。結冷膠應用前景廣闊，然而較高的生產成本限制了其進一步地推廣應用。少動鞘氨醇單胞菌是具單極鞭毛的革蘭氏陰性菌，其在發酵產結冷膠的同時產生黃色類胡蘿卜素-念珠藻黃素。類胡蘿卜素合成途徑已被廣泛研究并取得了巨大進展，大量關鍵酶基因得到克隆。所有的類胡蘿卜素均通過類異戊二烯化合物或萜類化合物途徑合成。IPP (異戊烯焦磷酸)是合成途徑的前體物質。IPP在IPP異構酶作用下生成DMAPP (二甲基丙烯基二磷酸)，然后再與3個IPP分子縮合生成GGPP (櫳牛兒基櫳牛兒基焦磷酸)。2 分子GGPP在八氫番茄紅素合成酶作用下形成第一個無色的類胡蘿卜素-八氫番茄紅素。八氫番茄紅素經過連續的脫氫步驟生成番茄紅素。番茄紅素在不同環化酶的作用下分別生成
胡蘿卜素、胡蘿卜素，并在羥化酶、酮化酶的作用下引入酮基和(或)羥基。胡蘿卜素在β-胡蘿卜素羥化酶的作用下生成玉米黃質，進而在2，2' -β羥化酶的作用下生成念珠藻黃素。β -胡蘿卜素是維生素A的前體，具有清除自由基、抗氧化和抑制腫瘤形成的生理作用。目前，其主要用作食品添加劑、調色劑、營養增補劑和化妝品助劑。另外胡蘿卜素還作為藥物、治療紅細胞生成性原卟啉癥、維生素缺乏癥以及抑制腫瘤形成的抗癌藥物。 人體自身無法合成胡蘿卜素，需要從外界補充。作為功能性天然色素，胡蘿卜素在食品、保健品、化妝品和醫藥等方面的應用日趨廣泛，需求量越來越大，市場前景廣闊。玉米黃質(3，3' - 二羥基胡蘿卜素)是胡蘿卜素的衍生物，具有淬滅單線態氧、清除自由基等抗氧化活性。流行病學研究顯示，玉米黃質在視覺保護、降低患癌癥、 心血管疾病和增強免疫功能等方面具有獨特的生理功效。目前，玉米黃質作為天然著色劑、 抗氧化劑已被應用于食品、保健品、化妝品、醫藥及飼料等行業。目前尚未有少動鞘氨醇單胞菌胡蘿卜素羥化酶基因和2，2' -β羥化酶基因序列以及利用基因敲除技術在少動鞘氨醇單胞菌中敲除該兩種基因從而結冷膠發酵聯產所需類胡蘿卜素的報道。
發明內容
本發明的目的是提供少動鞘氨醇單胞菌的胡蘿卜素羥化酶基因、2，2' -β羥化酶基因的DNA序列和兩種酶都缺失的重組菌株、2，2' -β羥化酶缺失的重組菌株及其這兩株菌株的應用。本發明采用的技術方案是少動鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas sp.)的β -胡蘿卜素羥化酶基因(crtZ)，核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。該序列長度為501bp，編碼一個由166個氨基酸組成的蛋白質。少動鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas sp.)的2，2' -β羥化酶基因(crtG)，核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。該序列長度為798bp，編碼一個由265個氨基酸組成的蛋白質.一種crtZ基因和crtG基因缺失的重組鞘氨醇單胞菌，由少動鞘氨醇單胞菌經基因敲除去除SEQ ID NO. 1所示的crtZ基因和SEQ ID N0. 2所示的crtG基因獲得。所述基因敲除借助SEQ ID N0. 3和SEQ ID N0. 4所示的核苷酸片段進行。一種crtG基因缺失的重組鞘氨醇單胞菌，由少動鞘氨醇單胞菌經基因敲除去除 SEQ ID N0. 2所示的crtG基因獲得。所述基因敲除借助SEQID N0. 4所示的核苷酸片段進行。基因敲除為本領域常規技術，在已知被敲除的基因序列情況下，本領域普通技術人員可根據常識選擇常規方法進行基因敲除操作。具體可按如下進行1、以少動鞘氨醇單胞菌基因組為模板，利用PCR方法擴增目的基因的上、下游片斷，分別將上、下游片斷插入常規敲除載體pL03(來自德國的Oliver Lenz博士)構建目的基因敲除載體；2、將目的基因敲除載體通過三親接合方法導入少動鞘氨醇單胞菌中；3、第一次同源重組時整個敲除質粒插入基因組中的同源位點、四環素抗性篩選得到陽性重組子，并用PCR方法擴增sacB基因鑒定。將篩選得到的同源重組第一次交換陽性重組子接種入預培養培養基中傳代三次，然后涂布在含8%蔗糖的篩選平板上以篩選第二次同源重組交換體。篩選得到的第二次同源重組體影印至含四環素的抗性平板并用PCR方法進一步鑒定，從而獲得目的基因缺失的少動鞘氨醇單胞菌。本發明中，crtZ基因的敲除借助SEQ ID N0. 3核苷酸片斷經兩次同源重組敲除去除SEQ ID NO. 1所示的核苷酸片段獲得，具體是分別將SEQID N0. 3中上游(SEQ ID N0. 3 第240 784位堿基)下游(SEQ ID N0. 3第1250 762位堿基)片斷插入敲除載體pL03 構建crtZ基因敲除載體pL03- Δ Z ；然后將crtZ基因敲除載體pL03_ Δ Z通過三親接合方法導入少動鞘氨醇單胞菌中，經篩選得到crtZ基因缺失的重組少動鞘氨醇單胞菌。SEQ ID N0. 3的DNA序列包括crtZ基因在內共177!3bp，由如下方法獲得通過與少動鞘氨醇單胞菌親緣關系較近的9種菌的β-胡蘿卜素羥化酶基因(crtZ)的氨基酸序列進行比對分析，分析保守序列，設計C0DEH0P簡并引物，利用PCR的方法擴增出少動鞘氨醇單胞菌ATCC31461 crtZ的部分序列，進而通過SiteFinding-PCR技術獲得包括crtZ基因的完整序列及基因敲除所需的部分側翼序列。crtG基因的敲除借助SEQ ID N0. 4核苷酸片斷經兩次同源重組敲除去除SEQ ID N0. 2所示的核苷酸片段獲得，具體是分別將SEQ ID N0. 4中上游(SEQ ID N0. 4第617 1260位堿基)下游(SEQ ID N0. 4第2041 M46位堿基)片斷插入敲除載體pL03構建crtG基因敲除載體pL03- Δ G ；然后將crtG基因敲除載體pL03_ Δ G通過三親接合方法導入少動鞘氨醇單胞菌中，經篩選得到crtG基因缺失的重組少動鞘氨醇單胞菌。SEQ ID NO. 4的DNA序列包括crtG基因在內共2471bp，由如下方法獲得根據少動鞘氨醇單胞菌 ATCC 31461 crtY的部分序列(NCBI登錄號HQ2(^920)設計基因特異性引物，進而通過 SiteFinding-PCR技術獲得包括crtG基因的完整序列及基因敲除所需的部分側翼序列。本發明還涉及所述的crtZ基因和crtG基因缺失的重組鞘氨醇單胞菌在微生物發酵制備結冷膠和胡蘿卜素中的應用。本發明還涉及所述的crtG基因缺失的重組鞘氨醇單胞菌在微生物發酵制備結冷膠和玉米黃質中的應用。具體的，所述應用為將所述重組少動鞘氨醇單胞菌菌株經活化、種子培養后，接種至適用于少動鞘氨醇單胞菌的發酵培養基，觀 32°C、pH6. 8 7. 2搖床培養32 60h， 獲得含有所需胡蘿卜素的黃色發酵液。crtZ和crtG基因缺失的重組少動鞘氨醇單胞菌β _胡蘿卜素含量為13. 12 14. 08mg/l, crtG基因缺失的重組少動鞘氨醇單胞菌玉米黃質含量為11. 58 12. 08mg/l。本發明提供的少動鞘氨醇單胞菌β-胡蘿卜素羥化酶基因(crtZ)和2，2' -β 羥化酶基因(crtG)的DNA序列為少動鞘氨醇單胞菌類胡蘿卜素生物合成途徑進行遺傳改造奠定基礎。另外，本發明通過基因敲除的方法構建的重組少動鞘氨醇單胞菌重組菌株與野生型菌株相比，結冷膠產量基本不變并產所需的類胡蘿卜素，從而可以結冷膠發酵聯產 β -胡蘿卜素或玉米黃質，同時，該菌株還可以應用于進一步的代謝工程改造。
圖1為pL03質粒的結構示意圖；圖2為PCR法鑒定crtZ基因敲除的電泳圖1以構建的crtZ基因和crtG基因缺失的少動鞘氨醇單胞菌基因組為模板(796bp)，2以野生型少動鞘氨醇單胞菌基因組為模板作對照(1255bp)；圖3為PCR法鑒定crtG基因敲除的電泳圖1以野生型少動鞘氨醇單胞菌基因組為模板作對照(1690bp)，2以構建的crtZ基因和crtG基因缺失的少動鞘氨醇單胞菌基因組為模板(916bp)，3以構建的crtG基因缺失的少動鞘氨醇單胞菌基因組為模板(916bp)。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護范圍并不僅限于此實施例1 少動鞘氨醇單胞菌crtZ基因DNA序列的獲得對來自少動鞘氨醇單胞菌所屬Sphingomonadales目的Erythrobacter gaetbuli>Erythrobacter litoralis HTCC 2594>Erythrobacter sp. NAPKBrevundimonas sp. SD 212、Brevundimonas bacteroides、Brevundimonas vesicularis、Aurantimonas manganoxydans SI85-9A1、Xanthobacter autotrophicus Py2 共 8 禾中菌的 β -古月蘿卜素羥化酶蛋白序列(數據來自NCBI蛋白數據庫)采用Block Maker (http://blocks, fhcrc. org/blocks/make_blocks. html)比對分析，設計多條CodeHop簡并引物。其中如下1對引物能擴增出一致性較好，特異性較強的條帶。上游引物crtZ sense 5' -GCCTGGTCGATGCACAAGTAYRTNATGCAYG-3‘下游引物crtZ anti 5' -CGGCGTGGTGCAGCYKRTGNGCYTG-3‘從少動鞘氨醇單胞菌Sphmgomonas paucimobilis ATCC 31461 (從 ATCC 購買)中提取基因組DNA(使用AxyPr印細菌基因組DNA小量制備試劑盒)作為PCR模板利用上述的簡并引物擴增出少動鞘氨醇單胞菌crtZ基因的部分序列。PCR反應程序為95°C預變性 5min進入循環過程；94°C變性30sec，55°C退火30sec，72°C延伸30sec，30個循環；最后以 72°C延伸lOmin。瓊脂糖凝膠電泳分析。擴增出的條帶(大小約為322bp)，割膠回收(使用AxyPr印DNA凝膠回收試劑盒) 后連接到PMD19-T (Takara)載體上，轉化大腸桿菌ToplO感受態細胞，挑取氨芐抗性克隆， 菌落PCR鑒定pMD19-T中是否插入回收的PCR片段。對陽性克隆測序(Invitrogen公司測定)，并用BLAST程序對序列進行同源性分析。該片段與Sphingobium japomcum UT26S β-胡蘿卜素羥化酶基因的同源性為85%，初步確定它是少動鞘氨醇單胞菌β-胡蘿卜素羥化酶基因的DNA片段。crtZ基因完整序列及側翼未知序列的獲取采用SiteFinding-PCR方法。根據已知的該段序列分別在上下游設計了兩條基因特異性引物進行SiteFinding-PCR。所用的基因特異性引物、SiteFinder, SFP引物序列如下上游序列特異性引物upl 5' -CAGGTCGTGAAAGGCGAAATAGA-3‘up2 5' -GAACGACGGCACCGCAAAGA-3‘下游序列特異性引物 down1:5' -AAACTGGGAGCTGAACGACCTG-3‘down2 5' -TCCATTTCGGCTTTCACGACCTG-3‘SiteFinder SiteFl 5 ‘ -CACGACACGCTACTCAACACACCACCACGCACAGCGTCCTCAANNNNNNCATGG-3‘SiteF2 5 ‘ -CACGACACGCTACTCAACACACCACCACGCACAGCGTCCTCAANNNNNNCATGC-3‘SiteF3 5 ‘ -CACGACACGCTACTCAACACACCACCACGCACAGCGTCCTCAANNNNNNGCCT-3‘SiteF4 5 ‘ -CACGACACGCTACTCAACACACCACCACGCACAGCGTCCTCAANNNNNNGCCACG-3‘SFP 引物SFPl 5' -CACGACACGCTACTCAACAC-3‘SFP2 5' -ACTCAACACACCACCACGCACAGC-3‘擴增得到的目標DNA片斷經類似的克隆和測序后作BLAST分析，發現得到的上游目標DNA片段(848bp)包含起始密碼子，下游目標DNA片段(659bp)包含終止密碼子，將上述序列與crtZ基因的部分序列拼接后獲得一段長1773bp的DNA序列，如SEQ ID No. 3所示，其中包含的crtZ基因(SEQ ID No. 1)全長為501bp (SEQ ID No. 3第758位 第1258 位堿基)。實施例2 少動鞘氨醇單胞菌crtG基因DNA序列的獲得根據少動鞘氨醇單胞菌ATCC 31461 crtY的部分序列(NCBI登錄號HQ2(^920) 設計上游基因特異性引物，通過幾次SiteFinding-PCR方法獲得包括crtG基因的完整序列及基因敲除所需的部分側翼序列。所用的基因特異性引物根據已知序列設計，SiteFinder、 SFP引物序列同上。將所得到的序列拼接后獲得包含crtG基因在內的序列，如SEQ ID No.4所示，其中包含的crtG基因(SEQ ID No. 2)全長為798bp (SEQ ID No. 4第1255位堿基 第2052 位堿基)。實施例3 β -胡蘿卜素羥化酶和2,2' -β羥化酶兩種酶缺失的少動鞘氨醇單胞菌重組菌株及2，2' -β羥化酶缺失的少動鞘氨醇單胞菌重組菌株的構建1、基因敲除載體？11)3-八2、？11)3-八6的構建 根據獲得的DNA序列設計引物。從少動鞘氨醇單胞菌Sphingonmonas paucimobilis ATCC 31461 (ATCC購買)中提取基因組DNA(使用AxyPr印細菌基因組DNA小量制備試劑盒)作為PCR模板。Z1、Z2為引物Taq酶(Takara)擴增crtZ基因上游同源序列，PCR反應程序為95°C預變性5min進入循環過程；94°C變性30sec，63°C退火30sec，72°C 延伸45sec，30個循環，最后以72°C延伸IOmin。Z3、Z4為引物Taq酶(Takara)擴增crtZ基因下游同源序列，PCR反應程序為95°C預變性5min進入循環過程；94°C變性30seC，63°C 退火308沈，721延伸458，30個循環，最后以721延伸IOmin0上述引物序列如下Zl 5' -GACGAGCTCATCGATCCCGGCTATTAT-3‘下劃線為 SacI 酶切位點Z2 5' -GGCTCTAGACAGCAAAAAGGCGTTGAG-3‘下劃線為 XbaI 酶切位點Z3 5' -TGTCTAGACCGGATTGAGGGCCATCC-3‘下劃線為 XbaI 酶切位點Z4 5' -TGCTGCAGGTGGTCGATTACAGGCTC-3‘下劃線為 PstI 酶切位點PCR產物瓊脂糖凝膠電泳，然后用AxyPr印DNA凝膠回收試劑盒割膠回收。回收的上游片斷(SEQ ID NO. 3第240 784位堿基)、基因敲除質粒pL03經Mel、 XbaI 37°C雙酶切過夜后，上游片斷PCR清潔回收(使用AxyPr印PCR清潔回收試劑盒)，質粒瓊脂糖凝膠電泳并割膠回收后T4DNAligaSe 4°C連接過夜，轉化大腸桿菌S17-1感受態細胞。LB平板(添加25 μ g/ml的四環素)篩選陽性克隆。篩選所得陽性克隆菌落PCR 驗證，提取質粒進一步酶切驗證并測序。通過驗證的克隆提取質粒，命名為PL03-Z1。pL03-Zl、回收的下游片段(SEQ ID NO. 3第1250 1762位堿基)經XbaI、 I^tI37°C雙酶切過夜后進行類似的克隆和驗證，構建好的基因敲除載體命名為pL03- Δ Ζ。crtG基因敲除載體pL03_ Δ G的構建過程與pL03_ Δ Z基本相同，所不同的是由于上游片段包含有I3StI酶切位點，因此先連接下游片斷(SEQ ID NO. 4第2041 M46位堿基)，再連接上游片斷(SEQ ID NO. 4第617 1260位堿基)。所用的引物序列如下Gl 5' -GCTGAGCTCGTTGATGAAGGGAGTCTA-3‘下劃線為 SacI 酶切位點G2 5' -TATCTAGAGTTCATGCGCCGATCTGC-3‘下劃線為 XbaI 酶切位點G3 5' -GCATCTAGAGCTGGAGCTTGATTTCACC-3'下劃線為 XbaI 酶切位點
G4 5' -TACTGCAGCAGACGATCAGAAACCCC-3‘下劃線為 PstI 酶切位點2、基因敲除載體轉化基因敲除載體采用三親接合方法導入少動鞘氨醇單胞菌ATCC 31461和DSM 6314 中。三親接合過程需要三種細菌①含有敲除載體的大腸桿菌供體菌(按前述方法可得)； ②含有常規輔助質粒PRK2013的大腸桿菌“協助”(helper)菌HB101/pRK2013 (來自中國科學院遺傳研究所)；③少動鞘氨醇單胞菌ATCC 31461或者DSM 6314 (來自菌種保藏中心 DSM)(受體菌)。當三種菌混合時，協助質粒PRK2013游動進入大腸桿菌內，提供游動(mob) 和轉移(tra)功能，把供體的重組質粒轉移進入少動鞘氨醇單胞菌內。該系統中重組載體質粒需要帶有一個特定的轉移起始點(oirT)，以使協助質粒的tra和mob基因對它起作用， 被驅動轉移。PL03質粒為四環素抗性，含有蔗糖反向篩選標記sacB基因、pBR322_origin 復制起點和oriT_RP4轉移起點。該質粒能夠在大腸桿菌中復制，但不能在少動鞘氨醇單胞菌中復制，因此PL03質粒進入少動鞘氨醇單胞菌時，只能經同源同組整合入染色體，和染色體一起復制，而不能以游離形式存在于染色體外。利用PL03質粒的這些特點，將欲敲除基因兩側的同源片斷克隆入PL03質粒從而定位pL03質粒的整合位點。利用同源性DNA片斷可發生重組的原理，構建基因缺失菌株。三親接合具體方法如下所述少動鞘氨醇單胞菌于預培養培養基中30°C、200rpm培養過夜。以10%接種量轉接預培養培養基30°C、200rpm培養他。供體菌、HB101/pRK2013于加相應抗生素的LB液體培養基(抗生素添加量四環素25yg/ml、卡那霉素50yg/ml)中37°C培養過夜。取供體菌、HB101/pRK2013菌液各2ml離心收集菌體(3000rpm、5min)；取少動鞘氨醇單胞菌5ml， 6000rpm離心5min，棄上清，分別用無菌去離子水洗滌兩次，離心。將上述3種菌合并，用 5ml無菌去離子水重懸混勻后用0. 45 μ m孔徑直徑5cm的濾膜抽濾。濾膜菌體朝上貼在LB 平板中，37°C靜置培養幾后用5ml無菌去離子水將濾膜上的菌體洗下，梯度稀釋至合適濃度后涂布含25 μ g/ml鏈霉素、5 μ g/ml四環素的YM平板。所用的培養基組成如下預培養培養基酵母膏0.2%，牛肉膏0.3%，蛋白胨0.5%，NaCl 0.1%，葡萄糖 0.5%，溶劑為蒸餾水，pH7.2 ；YM固體培養基酵母粉0.3%，麥芽粉0.3%，蛋白胨0.5%，葡萄糖1%，瓊脂粉 1.5%，溶劑為蒸餾水，pH7.2 ；注本發明中培養基濃度均指質量體積百分比濃度，某組分濃度表示IOOmL培養基中含有Ig該物質。3、少動鞘氨醇單胞菌重組菌株的篩選第一次同源重組時，質粒整合入基因組。四環素抗性篩選得到的克隆提取基因組， sacB引物PCR擴增sacB基因鑒定陽性重組子。PCR反應程序為95°C預變性5min進入循環過程；94°C變性30sec，50°C退火30sec，72°C延伸90sec，30個循環，最后以72°C延伸 IOmin0 PCR產物為1151bp片斷的為陽性重組子。上述驗證引物序列如下sacBsense 5' -CGAACCAAAAGCCATATAAG-3‘sacBanti 5' -AGCGAAGTGTGAGTAAGTAA-3‘第二次同源重組質粒脫離基因組DNA，產生兩種交換類型缺失突變菌株和野生型菌株。第一次同源重組篩選得到的陽性克隆接種入預培養培養基中傳代三次，然后涂布在8%蔗糖篩選平板上以篩選第二次同源重組交換體。由于sacB基因編碼的蔗糖果聚糖酶能使蔗糖轉化為果聚糖。果聚糖對細胞有毒性，在高濃度蔗糖存在下只有丟失sacB基因才能生長。因此能利用高濃度蔗糖可反向篩選得到去除整合敲除質粒的野生型菌株或者缺失突變菌株。篩選得到的第二次交換體影印含有5 μ g/ml四環素的YM平板培養基，以進一步確認第二次交換抗性標記已丟失。隨機選擇第二次同源重組交換體用PrimeSTAR HS DNA Polymerase酶(Takara) PCR進一步確認目的基因是否已敲除。PCR反應程序為95°C預變性5min進入循環過程； 98°C變性10seC，59°C退火15seC，72°C延伸2min，30個循環。同時以野生型菌株基因組為模板作PCR對照，電泳結果如圖2和圖3所示，敲除crtZ基因時(以Z5、Z6為引物)，以野生型菌株基因組為模板的PCR產物為1255bp，而以構建的crtZ基因和crtG基因缺失的少動鞘氨醇單胞菌基因組為模板的PCR產物為796bp。敲除crtG基因時(以G5、G6為引物)， 以野生型菌株基因組為模板的PCR產物為1690bp，而以構建重組少動鞘氨醇單胞菌基因組為模板的PCR產物為916bp。所用的引物序列如下Z5 5' -CGCGCCTGCCGGAACTGA-3‘Z6 5' -CGTGGAACTGCTCGGGGGAG-3‘G5 5' -TGGCGACCACTCCCAACAG-3‘G6 5' -CGGAATGCCCATGAAGGTG-3‘實施例4 重組少動鞘氨醇單胞菌菌株產膠能力的測定1、野生型菌株(Sphingomonas paucimobilis ATCC 31461)、crtZ 和 crtG 基因缺失的少動鞘氨醇單胞菌(Δ ZGl AZG7，其中AZGl Δ ZG4來源于少動鞘氨醇單胞菌 ATCC 31461，而AZG5 Δ ZG7則來源于少動鞘氨醇單胞菌DSM 6314)、crtG基因缺失的少動鞘氨醇單胞菌(AGl Δ G7，其中AGl Δ G4來源于少動鞘氨醇單胞菌ATCC31461，而 AG5 AG7則來源于少動鞘氨醇單胞菌DSM 6314)接YM培養基斜面上，30°C培養72h ；2、一級種子培養分別將斜面種子接入50ml —級種子培養基(盛于250ml三角瓶)，于30°C，200rpm振蕩培養24h，即為一級種子液；3、二級種子培養分別將一級種子液以5%體積比的接種量接入IOOml 二級種子培養基(盛于500mL三角瓶)，于30°C，200rpm振蕩培養12h，即為二級種子液；4、發酵將二級種子液以5%體積比的接種量接入IOOml級發酵培養基中(盛于 500mL三角瓶)，于30°C，200rpm振蕩發酵48h ；5、分別測定對照(野生型菌株)和重組少動鞘氨醇單胞菌的發酵液的粘度及出膠率，結果如表1 表1、野生菌株和突變菌株發酵48h出膠率、粘度
權利要求
1.少動鞘氨醇單胞菌(Sphingomonassp.)的β -胡蘿卜素羥化酶基因(crtZ)，核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2.少動鞘氨醇單胞菌(Sphingomonassp.)的2，2' -β羥化酶基因(crtG)，核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3.—種crtZ基因和crtG基因缺失的重組鞘氨醇單胞菌，由少動鞘氨醇單胞菌經基因敲除去除SEQ ID NO. 1所示的crtZ基因和SEQ ID NO. 2所示的crtG基因獲得。
4.如權利要求3所述的重組鞘氨醇單胞菌，其特征在于所述基因敲除借助SEQID NO. 3和SEQ ID NO. 4所示的核苷酸片段進行。
5.一種crtG基因缺失的重組鞘氨醇單胞菌，由少動鞘氨醇單胞菌經基因敲除去除SEQ ID NO. 2所示的crtG基因獲得。
6.如權利要求5所述的重組鞘氨醇單胞菌，其特征在于所述基因敲除借助SEQID NO. 4所示的核苷酸片段進行。
7.如權利要求3所述的重組鞘氨醇單胞菌在微生物發酵制備結冷膠和β-胡蘿卜素中的應用。
8.如權利要求5所述的重組鞘氨醇單胞菌在微生物發酵制備結冷膠和玉米黃質中的應用。
全文摘要
本發明提供了一種少動鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas sp.)的β-胡蘿卜素羥化酶基因(crtZ)和2，2′-β羥化酶基因(crtG)的DNA序列和該兩種酶缺失的重組菌株、2，2′-β羥化酶缺失的重組菌株及其這兩株菌株的應用。所述crtZ基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；crtG)基因具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。本發明提供的少動鞘氨醇單胞菌β-胡蘿卜素羥化酶基因和2，2′-β羥化酶基因的DNA序列為少動鞘氨醇單胞菌類胡蘿卜素生物合成途徑進行遺傳改造奠定基礎。另外，本發明通過基因敲除的方法構建的少動鞘氨醇單胞菌重組菌株與野生型菌株相比，結冷膠產量基本不變，可以在發酵產結冷膠的同時聯產β-胡蘿卜素或玉米黃質。同時，該菌株還可以應用于進一步的基因敲除或代謝工程改造。
文檔編號C12P19/04GK102286495SQ20111018360
公開日2011年12月21日 申請日期2011年7月1日 優先權日2011年7月1日
發明者吳雪昌, 朱亮, 李歐 申請人:浙江大學