專利名稱：免疫刺激RNA和肝癌靶基因Pim-3沉默RNA的雙表達載體及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種免疫刺激RNA和肝癌靶基因Pim-3沉默RNA的雙表達載體，及其構建方法與應用，屬于基因工程和生物治療的技術領域。
背景技術：
肝癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，自20世紀90年代以來肝癌的年病死率已上升為城市和農村惡性腫瘤病死率的第二和第一位。而對于肝癌的治療，目前仍然以放射療法、化學療法和手術治療為主，其中外科治療起了決定性的作用，特別是手術切除仍占主導地位.但由于肝癌惡性程度高，極易發生早期播散和轉移等原因，上述療法都有一定的局限性。近年來隨著分子生物學、病毒學、免疫學等基礎研究向肝癌領域的滲透，許多學者逐漸把基因治療和生物治療引入到肝癌治療中，RNAi技術就是研究的比較廣泛的一種。近年來，科學家們采用生物信息學等技術已經發現了與肝癌的發生以及發展密切相關的一些原癌基因，但并未見有關Pim-3這樣一種原癌基因的報道。
發明內容
針對上述現有技術，本發明的發明人尋找到了 Pim-3這樣一種原癌基因，該基因在人的肝癌組織以及癌旁組織中的表達明顯高于正常肝組織，Pim-3能通過磷酸化一些促凋亡蛋白如Bad使其失活，從而抑制腫瘤細胞的凋亡，因此采用RNAi技術去靶向沉默 Pim-3，就會在一定程度上延緩肝癌的發展進程，達到治療肝癌的目的；而另一方面，在腫瘤的發生過程中，腫瘤細胞可以通過許多機制，比如增加IL-10等抑制性細胞因子的產生來逃逸免疫系統的監視，使機體免疫系統處在相對低下的狀態，本發明就找到某些RNA序列， 他們能夠激活免疫系統，進而引起自身免疫系統對于肝癌細胞的殺傷以及清除。故設計并構建能夠表達靶向沉默Pim-3基因的RNA和能夠激活免疫系統的RNA這樣一種雙表達載體，就能達到對肝癌雙管齊下的治療作用。基于上述發現，針對肝癌靶基因Pim-3的特點，本發明提供了一種免疫刺激RNA和肝癌靶基因Pim-3沉默RNA的雙表達載體，及其在治療肝癌過程中的應用。本發明是通過以下技術方案實現的一種免疫刺激RNA和肝癌靶基因Pim-3沉默RNA的雙表達載體，是由轉錄shRNA 的DNA序列、轉錄ssRNA的DNA序列與pTZTO+Ι載體組成的重組載體，其序列如seq. 12所不。所述免疫刺激RNA和肝癌靶基因Pim-3沉默RNA的雙表達載體是通過以下方法構建制得(1)針對Pim-3基因的序列，通過shRNA設計軟件設計合成shRNA相對應的DNA序列，并在序列的兩端添加雙酶切位點Ml I和)(bal I，得seq. 1-8所示的序列；(2)將步驟(1)制得的序列與PTZU6+1載體連接，構建pTZU_shRNA重組載體；分別表示為 pTZU-shRNAl、pTZU-shRNA2、pTZU_shRNA3、pTZU_shRNA4 ；(3)通過km-qPCR和Real-Time PCR對步驟O)中四對shRNA的沉默作用進行初步篩選，篩選得到沉默作用較明顯的載體，如圖2所示；(4)將步驟(3)中沉默作用較明顯的pTZU-shRNAl載體進行EcoR I和Hind III 雙酶切，得到TO+shRNA的表達框，其序列如seq. 9所示；(5)根據能夠激活免疫系統的RNA病毒序列，設計編碼具有潛在免疫刺激作用序列的RNA的DNA序列，并在序列的兩端添加雙酶切位點序列EcoR I和BamH I，得seq. 10、 11所示的序列；(6)將步驟(5)制得的序列與pSIREN載體連接，構建pSIREN-ssRNA重組載體；(7)將步驟(6)中制得的重組載體進行EcoR I單酶切，得線性片段；(8)將步驟(4)制得的TO+shRNA表達框和步驟(7)制得的線性片段平端化，連接， 并經過菌落PCR篩選同時表達shRNA和ssRNA的雙表達載體，序列見seq. 12。本發明的免疫刺激RNA和肝癌靶基因Pim-3沉默RNA的雙表達載體，轉染小鼠肝癌H印al-6細胞，24h后檢測，通過km-qPCR和flfestern-blot檢測發現能夠下調H印al_6 細胞中Pim-3的表達；轉染!fepal-6細胞，24h后檢測，發現能夠明顯增加!fepal-6細胞的凋亡；轉染H印al-6細胞，能明顯上調H印al-6細胞上清中I型干擾素(IFN- α和IFN- β ) 的分泌，由此可見，本發明的免疫刺激RNA和肝癌靶基因Pim-3沉默RNA的雙表達載體有可能成為治療肝癌的新的生物學手段。上述實驗方法，如無特別說明，均采用本領域常規實驗方法，上述實驗試劑均為市
售產品。本發明利用構建的shRNA和ssRNA的雙表達載體能夠誘導細胞因子的分泌，相較于shRNA的表達載體，雙表達載體對H印al-6細胞具有更好的抑制作用，能夠明顯的抑制 Hepal-6細胞的增殖，并且能夠增強小鼠脾淋巴細胞對H印al_6細胞的殺傷，具有較好的應用前景。
圖1為km-qPCR檢測Pim_3基因在小鼠肝癌細胞H印al_6和H22以及正常的小鼠肝細胞BNL. cl2中的表達示意圖。圖2為對shRNA的沉默作用進行初步篩選的示意圖，其中A為km-qPCR的檢測結果，B為Real-time PCR的檢測結果。圖3為pSIREN-shRNA和雙表達載體均能夠明顯的下調H印al_6細胞Pim_3基因的表達示意圖。圖4為pSIREN-shRNA和雙表達載體均能夠明顯的下調H印al_6細胞Pim_3蛋白的表達示意圖。圖5為雙表達載體能夠明顯上調!fepal-6細胞上清中I型干擾素的分泌表達，其中A為IFN-α的分泌水平，B為IFN-β的分泌水平。圖6為雙表達載體能夠更明顯的增加H印al-6細胞的凋亡，其中Armexin V和PI 雙陽性的細胞即處于晚期凋亡，如圖所示用pSIREN-shRNA和雙表達載體轉染!fepal-6細胞后，發生凋亡的細胞比例明顯增加。
圖7為雙表達載體能夠更明顯的抑制!fepal-6細胞的增殖。
具體實施例方式以下實施例將有助于本領域的普通技術人員進一步理解本發明，但不以任何形式限制本發明。實施例中的實驗方法，如無特別說明，均采用本領域常規技術，實驗試劑均為市售產品。實施例1，一種雙表達載體構建(1)針對Pim-3基因的序列，設計針對Pim_3基因的特異性沉默RNA及相對應的 DNA序列，并且在序列的兩端添加雙酶切位點序列Ml I和)(bal I，退火形成雙鏈結構，序列見 seq. 1-8 ；(2)將pTZU6+l載體進行Ml I和)(bal I的雙酶切，并回收載體骨架；(3)將步驟(1)制得的序列與步驟(2)制得的PTZU6+1載體連接構建成 pTZU-shRNA ；分別表示為 pTZU-shRNAl、pTZU-shRNA2、pTZU_shRNA3、pTZU_shRNA4。(4)利用陽離子脂質體Lipofectamine2000(購自invitrogen)將步驟(3)中構建的pTZU-shRNA轉染到小鼠的肝癌細胞系H印al-6，并檢測Pim_3基因的表達水平，結果表明 pTZU-shRNA 1具有更明顯的沉默能力(如圖2所示)。將pTZU-shRNAl進行EcoR I和Hind III雙酶切，并回收TO+shRNA的表達框，其序列見seq. 9 ；(5)根據能夠激活免疫系統的RNA病毒序列，設計編碼具有潛在免疫刺激作用序列的RNA的DNA序列，并在序列的兩端添加雙酶切位點序列EcoR I和BamH I，退火形成雙鏈結構ssRNA，序列見seq. IOUl ；(6)將pSIREN載體進行EcoR I和BamH I雙酶切，并回收載體骨架；(7)將步驟(5)制得的ssRNA序列和步驟(6)制得的pSIREN載體鏈接，構建成 pSIREN-ssRNA ；(8)將步驟(7)中制得的重組載體進行EcoR I單酶切，得線性片段；(9)將步驟(4)制得的pTZU-shRNAl表達框和步驟(8)制得的線性pSIREN-ssRNA 平端化，連接。篩選得到同時表達shRNA和ssRNA的雙表達載體，序列見seq. 12。(10)用陽離子脂質體lipofectamine2000(購自invitrogen)將雙表達載體轉染到小鼠的肝癌細胞系H印al-6，并檢測細胞因子I型干擾素的基因水平和蛋白水平，如圖1 和圖5所示，結果表明其能夠激活免疫系統，具有刺激作用。2雙表達載體的應用①沉默作用pSIREN-shRNA和雙表達載體轉染小鼠的肝癌細胞系H印al-6 24h 后，提取RNA和細胞的總蛋白，分別檢測Pim-3的基因水平和蛋白水平，發現兩者均有很好的沉默作用(如圖3和圖4所示)。②免疫刺激作用雙表達載體轉染小鼠的肝癌細胞系H印al-6 24h后，在基因水平和蛋白水平檢測I型干擾素的表達，發現雙表達載體能明顯上調ifepal-6上清中IFN-α 和IFN-β的表達，如圖1和圖5所示。由此綜合前面兩個結果，認為該載體的構建是成功的。
③體外治療利用pTZU-shRNAl和雙表達載體轉染小鼠的肝癌細胞系!fepal-6 24h后，能夠增加Hepal-6細胞的凋亡(如圖6所示)，且利用雙表達載體轉染小鼠的肝癌細胞系H印al-6細胞24h后能更明顯的抑制H印al_6細胞的增殖(如圖7所示)；此外，雙表達載體轉染后能更明顯的增強小鼠脾淋巴細胞對ifepal-6細胞的殺傷。
權利要求
1.一種免疫刺激RNA和肝癌靶基因Pim-3沉默RNA的雙表達載體，其特征在于是由轉錄shRNA的DNA序列、轉錄ssRNA的DNA序列與pTZTO+Ι載體組成的重組載體，其序列如 seq. 12 所不。
2.權利要求1所述的免疫刺激RNA和肝癌靶基因Pim-3沉默RNA的雙表達載體的構建方法，其特征在于，步驟如下(1))針對Pim-3基因的序列，通過shRNA設計軟件設計合成shRNA相對應的DNA序列， 并在序列的兩端添加雙酶切位點Ml I和)(bal I，得seq. 1-8所示的序列；(2)將步驟(1)制得的序列與PTZU6+1載體連接，構建pTZU-shRNA重組載體；分別表示為 pTZU-shRNAl、pTZU-shRNA2、pTZU_shRNA3、pTZU_shRNA4 ；(3)通過km-qPCR和Real-TimePCR對步驟O)中四對shRNA的沉默作用進行初步篩選，篩選得到沉默作用較明顯的載體；(4)將步驟(3)中篩選得到的沉默作用較明顯的pTZU-shRNAl載體進行EcoRI和Hind III雙酶切，得到TO+shRNA的表達框，其序列如seq. 9所示；(5)根據能夠激活免疫系統的RNA病毒序列，設計編碼具有潛在免疫刺激作用序列的 RNA的DNA序列，并在序列的兩端添加雙酶切位點序列EcoR I和BamH I，得seq. 10、11所示的序列；(6)將步驟(5)制得的序列與pSIREN載體連接，構建pSIREN-ssRNA重組載體；(7)將步驟(6)中制得的重組載體進行EcoRI單酶切，得線性片段；(8)將步驟(4)制得的TO+shRNA表達框和步驟(7)制得的線性片段平端化，連接，即得同時表達shRNA和ssRNA的雙表達載體，序列見seq. 12。
3.權利要求1所述的免疫刺激RNA和肝癌靶基因Pim-3沉默RNA的雙表達載體在制備抗HBV的藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種免疫刺激RNA和肝癌靶基因Pim-3沉默RNA的雙表達載體，是由轉錄shRNA的DNA序列、轉錄ssRNA的DNA序列與pTZU6+1載體組成的重組載體，其序列如seq.12所示。本發明的免疫刺激RNA和肝癌靶基因Pim-3沉默RNA的雙表達載體，轉染小鼠肝癌Hepa1-6細胞，24h后檢測，通過Sem-qPCR和Western-blot檢測發現能夠下調Hepa1-6細胞中Pim-3的表達；轉染Hepa1-6細胞，24h后檢測，發現能夠明顯增加Hepa1-6細胞的凋亡；轉染Hepa1-6細胞，能明顯上調Hepa1-6細胞上清中I型干擾素(IFN-α和IFN-β)的分泌，由此可見，本發明的免疫刺激RNA和肝癌靶基因Pim-3沉默RNA的雙表達載體有可能成為治療肝癌的新的生物學手段，具有較好的應用前景。
文檔編號C12N15/66GK102321652SQ201110179548
公開日2012年1月18日 申請日期2011年6月29日 優先權日2011年6月29日
發明者蘭培祥, 張彩, 田志剛, 郭切 申請人:山東大學