專利名稱：一種微生物酶法轉化白藜蘆醇苷為白藜蘆醇的方法
技術領域：
本發明涉及微生物酶法轉化虎杖提取物為白藜蘆醇的工藝方法，屬于天然活性物質提取及轉化的技術領域。
技術領域在此處鍵入技術領域描述段落。
背景技術：
白藜蘆醇(resveratroLRes)。學名為3，4，5_三羥基二苯乙烯，是蒽醌萜類化合物，物理性質為無味、白色晶體粉末；難溶于水，易溶于乙醇，丙酮等有機溶劑。白藜蘆醇主要存在于虎杖、葡萄、花生、松樹等植物。白藜蘆醇具有抑制腫瘤、抗氧化、抗自由基、抗血栓、抗過敏、抗動脈粥樣硬化和具有冠心病、缺血性心臟病、高血脂癥的防治作用，白藜蘆醇已被列為抗心血管、抗癌最有前途的藥物之一。目前國際上白藜蘆醇已被廣泛應用，導致了白藜蘆醇需求的大幅增加。由于化學合成白藜蘆醇的工藝還不成熟，其所需白藜蘆醇仍源于天然植物。當今國內學者優選的白藜蘆醇的提取方法多是用有機溶劑或水從虎杖 {Polygonum cusp i da turn Sieb. et Zucc.， P. cusp i datum)中提取白藜戸酉享苷(polydatin, PD)，又叫虎杖甙，虎杖甙物理性質為白色針狀結晶粉末，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯，微溶于水。再用酸、堿或酶法解去甙上的糖，轉化為甙元而成。虎杖甙的含量隨產地不同差異較大，一般含量在1 4%。經文獻和專利查新，已有文獻和專利報道從虎杖甙制備白藜蘆醇苷的方法。如中國專利申請號201010022075. 1采用專用固定化酶對虎杖材料粗提液進行生物轉化，短時間內使其中白藜蘆醇類似物轉化為白藜蘆醇，然后采用萃取分離技術獲得高純度的白藜蘆醇。本發明可提高虎杖材料中白藜蘆醇含量10-20倍，避免了同類技術中轉化時間過長、催化時間不易控制以及反應完成后酶無法回收造成成本提高的問題，同時采用層析、結晶等分離、精制技術，獲得大于95%的白藜蘆醇和一定純度的副產物大黃素兩種產品。田天麗的論文(四川大學學報，2008)從中藥材虎杖中篩選到一株具有轉化虎杖苷能力的根霉菌株 T234，利用該菌株產生的葡萄糖苷酶能將虎杖苷轉化為白藜蘆醇.轉化率達98 %。盡管相關專利申請和研究論文較多，但仍然不能很好解決酶催化活性不高，轉化率低，時間過長，成本高的問題，難以有效應用生產實際。
發明內容
本發明的目的就針對上述缺陷，從虎杖內生菌中篩選到一株高效轉化虎杖苷為白藜蘆醇的微生物菌株。從根本上解決酶催化活性不高，轉化率低，時間過長，成本高的問題，促進生產實踐應用。發明內容之一.提供一種能發酵生產虎杖糖苷水解酶并高效轉化虎杖苷為白藜蘆醇的微生物菌株，該菌株經分子生物學和形態學鑒定為棘孢曲霉 acWmim)，該菌株2010年5月觀日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號，CGMCC No. 3876。在一個實施方案中，其中說述菌株的篩選過程從各地采野生虎杖樣品，采用虎杖提取物配制不同的培養基，從虎杖內生菌中進行篩選，將剛采集的新鮮虎杖的根狀莖在自來水下沖洗干凈，浙干水分，切割成2 3 cm小段，按常規無菌操作進行如下表面消毒處理 75%酒精漂洗；Γ5 s，0. 1%升汞漂洗壙5 min，無菌水沖洗4飛次。將上述處理過的根狀莖在無菌條件下剝開取其韌皮部，將韌皮部外圍剪去，再剪切成0.5 cmX0.5 cm的小片，放置于PDA平板上，每個平板放置4塊，30°C培養3 7 d后，即見樣品剪切過的邊緣有真菌菌絲長出，真菌菌絲經純化后轉接到PDA斜面上培養好后備用。將保存至斜面上的菌種發酵，檢測其粗酶液轉化PD生成Res的效果，進行復篩。篩選到多個菌株，逐一復篩進行虎杖糖苷水解實驗，得虎杖糖苷水解酶高活性菌株，進行菌種簽定。在另一個具體實施方案中，所述菌株棘孢曲霉Usper識7ΛΛ5. acWeaim)，CGMCC No. 3876的形態特征為菌絲無色、淡色或表面凝集有色物質，有隔膜。分生孢子梗從壁厚而膨大的菌絲細胞垂直生出，大多數無隔膜，光滑或粗糙，上部較粗大，頂端膨大成球形、橢圓形、半圓形或棍棒形的泡囊；從泡囊的全部表面以放射狀生出小梗或僅在泡囊頂部產生小梗；小梗單層或在頂部再分枝成2個至多個的小梗。分生孢子串生于小梗頂端，作輻射狀排列或叢集成柱形，著褐色、形狀、大小和紋飾的變化很大。發明內容之二 . 提供所述菌株棘孢曲霉(Aspergillus, aculeatus)，CGMCC No. 3876發酵制備的胞外酶。所述菌株胞外酶是一組復合酶，其中包括纖維素內切酶，纖維素外切酶，木聚糖酶以及虎杖糖苷水解酶等。在一個實施方案中，所述菌株胞外酶發酵制備方法是，用無菌培養基(配方3% 6%麩皮、0. 5 1. 0%蛋白胨、起始pH 5 6)接種棘孢曲霉CGMCC No. 3876，在沘 30°C 條件下好氧發酵3 3. 5天，發酵一層紗布液經過濾、5000 10000轉/min離心，上清液用截留分子量為5000 Da中空纖維膜濃縮5倍，濃縮液為胞外酶粗酶液。發明內容之三.采用所述菌株發酵制備的胞外酶，提供一種酶法提取虎杖苷及其類似物，并結合常規醇提和水提方法獲得虎杖苷及其類似物粗提液的方法及其用途。所述菌株胞外酶法酵制備工藝包括用棘孢曲霉CGMCC No. 3876胞外酶粗酶液與 60 80目的虎杖干粉調漿，胞外酶粗酶液與虎杖干粉比例為1.5 mL:l g;在35 40°C條件下酶法水解3 4小時；再補充5 6倍體積用95%工業酒精浸提3次，每次1. 5 2小時，合并浸提液；將浸提液用常規方法揮干，獲得虎杖苷及其類似物粗品。酶法提取虎杖苷及其類似物，提取率為2. 3% ；未加所述菌株棘孢曲霉的胞外酶(對照)提取虎杖苷及其類似物，提取率僅為1. 2%，處理提高了 91. 7%。在另一個具體實施方案中，用于提取的植物材料可以是富含白藜蘆醇苷的虎杖、 花生、葡萄等。發明內容之四.從所述菌株發酵制備的胞外酶中提供高效轉化虎杖苷為白藜蘆醇的虎杖糖苷水解酶及其用途。包括
⑴所述菌株棘孢曲霉CGMCC No. 3876的虎杖糖苷水解酶的需分離純化，分離純化方法可以是硫酸銨沉淀、離子交換層析、葡聚糖凝膠層析、親和層析，也可以是活性凝膠電泳二步循環法(NGGEE) [1]，-40°C凍干并獲得純度為98%以上的虎杖糖苷水解酶。該酶的酶學特性為由一個亞基組成，亞基分子量為27. 3 kDa，等電點pi 4. 65，最適反應度40°C，最適反應pH 5. 0, K =5 mg/mL虎杖苷。虎杖糖苷水解酶比活力達1783. 6 IU/ (mg protein)
⑵用蒸餾水配制1% 5%過飽和的虎杖糖苷水溶液(虎杖糖苷原料含量98%以上)， 加入0. 5% 1%，純度為98%以上的所述虎杖糖苷水解酶，在pH 5. 0，40°C條件下水解虎杖糖苷，并不斷攪拌，水解3 6 h，獲得過飽和的白藜蘆醇過飽和水溶液。虎杖糖苷在水溶液中溶解度很低，在過飽和狀態下，虎杖糖苷被所述虎杖糖苷水解酶源源不斷水解為白藜蘆醇。由于白藜蘆醇溶解度比虎杖糖苷溶解度更低，過飽和的白藜蘆醇水溶液不斷有白藜蘆醇析出，在此機制下，虎杖糖苷幾乎完全水解為白藜蘆醇，轉化率達99. 5%以上。經常規的離心過濾，蒸發濃縮獲得高純度的白藜蘆醇，純度達98. 5%。在一個具體實施方案中，底物還可以是富含白藜蘆醇苷的虎杖、花生、葡萄等浸提的白藜蘆醇苷粗品，酶液可以是純化的說所述虎杖糖苷水解酶，也可以是未純化說所述菌株復合酶，水解產物為白藜蘆醇。
虎杖糖苷被虎杖糖苷水解酶水解為白藜蘆醇薄層色譜圖，lane PD為虎杖糖苷標樣，lane Res為白藜蘆醇標樣，lane 1虎杖糖苷被杖糖苷水解酶水解反應3 min, lane 2 反應6 min, lane 3反應9 min, lane 4反應12 min, lane 5反應15 min分別為虎杖糖苷水解時間，展開劑(正丁醇醋酸水=4:1:1)，紫外365nm顯色。技術效果
用所述菌株棘孢曲霉Usper識7ΛΛ5. acWeaim)，CGMCC No. 3876發酵制備的胞外酶。 酶法提取虎杖苷及其類似物，提取率為2. 3% ；未加所述菌株棘孢曲霉的胞外酶(對照)提取虎杖苷及其類似物，提取率僅為1. 2%，處理提高了 91. 7%。可為生產實踐提供制備白藜蘆醇專用復合酶。用所述菌株棘孢曲霉的純化的虎杖糖苷水解酶水解虎杖糖苷，產物為白藜蘆醇， 轉化率高達99. 5%以上。為生產白藜蘆醇提供專一性水解酶。
具體實施例方式
下面，本發明將用實施例進行進一步的說明，但是它并不限于這些實施例的任一個或類似實例。實施例1，高效轉化虎杖苷為白藜蘆醇的微生物菌株菌株的獲得
從各地采野生虎杖樣品，采用虎杖提取物配制不同的培養基，從虎杖內生菌中進行篩選，將剛采集的新鮮虎杖的根狀莖在自來水下沖洗干凈，浙干水分，切割成2 3 cm小段，按常規無菌操作進行如下表面消毒處理75%酒精漂洗;Γ5 s，0. 1%升汞漂洗Γ5 min，無菌水沖洗4飛次。將上述處理過的根狀莖在無菌條件下剝開取其韌皮部，將韌皮部外圍剪去， 再剪切成0.5 cmX0.5 cm的小片，放置于PDA平板上，每個平板放置4塊，30°C培養;Γ7 d 后，即見樣品剪切過的邊緣有真菌菌絲長出，真菌菌絲經純化后轉接到PDA斜面上培養好后備用。將保存至斜面上的菌種發酵，檢測其粗酶液轉化PD生成Res的效果，進行復篩。 篩選到多個菌株，逐一復篩進行虎杖糖苷水解實驗，得虎杖糖苷水解酶高活性菌株，進行菌種簽定。該菌株經分子生物學和形態學鑒定為棘孢曲霉(Aspergillus, aculeatus),該菌株 2010年5月觀日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號，CGMCC No.3876。
實施例 2，棘孢曲霉(Aspergillus, aculea tus ) CGMCC No. 3876 的形態特征
"^MWMl^(.Aspergillus, aculeatus), CGMCC No. 3876 在 PDA 培養基培養 3 4 天，用光學顯微鏡觀察其形態特征，該菌株菌絲無色、淡色或表面凝集有色物質，有隔膜。分生孢子梗從壁厚而膨大的菌絲細胞垂直生出，大多數無隔膜，光滑或粗糙，上部較粗大，頂端膨大成球形、橢圓形、半圓形或棍棒形的泡囊；從泡囊的全部表面以放射狀生出小梗或僅在泡囊頂部產生小梗；小梗單層或在頂部再分枝成2個至多個的小梗。分生孢子串生于小梗頂端，作輻射狀排列或叢集成柱形，著褐色、形狀、大小和紋飾的變化很大。實施例3，棘孢曲霉(Aspergillus, aculeatus)CGMCC No. 3876的胞外酶的發酵制備
配制培養基(配方4%麩皮、1.0%蛋白胨、起始pH 5.0)，接種棘孢曲霉CGMCC No. 3876， 在觀 301條件下用100 L發酵罐好氧發酵3. 5天，發酵一層紗布液經過濾、三足式離心機5000轉/min離心20min，上清液用截留分子量為5000 Da中空纖維膜濃縮5倍，濃縮液為胞外酶粗酶液復合酶12 L ；分別測定該菌株的纖維素酶活力，木聚糖酶活力，β-葡萄糖苷酶活力，該菌株發酵液的纖維素酶濾紙酶活力(Filter Paper Activity, FPA)達到3. 8 IU/mL (其中，一個FPA酶活力國際單位，是指在pH 4. 8，50 ° C，每min由濾紙生成1. 0 μπιο 還原糖的酶量，以IU/mL表示)；β-葡萄糖苷酶活力達713 IU/mL (其中，一個β-葡萄糖苷酶活力國際單位，是指在PH 4. 8，50 ° C，每min由纖維二糖生成1.0 μ mol葡萄糖的酶量，以IU/mL表示)木聚糖酶活力達179 IU/mL (其中，一個木聚糖酶活力國際單位， 是指在PH 4. 8，50 ° C，每min由木聚糖生成1.0 μ mol木糖的酶量，以IU/mL表示)。實施例4，酶法提取虎杖苷及其類似物
用棘孢曲霉CGMCC No. 3876胞外酶粗酶液與80目的虎杖干粉調漿，胞外酶粗酶液與虎杖干粉比例為1. 5 mL: 1 g ；在40°C條件下酶法水解3小時；再補充5倍體積用95%工業酒精浸提3次，每次1. 5 2小時，合并浸提液；將浸提液用常規方法揮干，獲得虎杖苷及其類似物粗品。酶法提取虎杖苷及其類似物，提取率為2. 3% ；未加所述菌株棘孢曲霉的胞外酶 (對照)提取虎杖苷及其類似物，提取率僅為1. 2%，處理提高了 91. 7%。實施例5，從花生殼中酶法提取白藜蘆醇苷及其類似物
用棘孢曲霉CGMCC No. 3876胞外酶粗酶液與60目的花生殼干粉調漿(其中花生殼為市售花生去花生仁的廢棄物)，胞外酶粗酶液與花生殼干粉比例為2 mL:l g;在40°C條件下酶法水解4小時；再補充6倍體積用95%工業酒精浸提3次，每次2小時，合并浸提液；將浸提液用常規方法揮干，獲得白藜蘆醇苷及其類似物粗品。酶法提取白藜蘆醇苷及其類似物，提取率為0. 4%ο實施例6，從葡萄皮中酶法提取白藜蘆醇苷及其類似物
用棘孢曲霉CGMCC No. 3876胞外酶粗酶液與葡萄皮調漿(其中葡萄皮為市售葡萄去仁的廢棄物，，如巨峰葡萄等)，胞外酶粗酶液與葡萄皮比例為1.5 mL:l g;在40°C條件下酶法水解3小時；再補充5倍體積用95%工業酒精浸提3次，每次2小時，合并浸提液；將浸提液用常規方法揮干，獲得白藜蘆醇苷及其類似物粗品。酶法提取白藜蘆醇苷及其類似物，提取率為1. 7%。實施例7，菌株棘孢曲霉CGMCC No. 3876的虎杖糖苷水解酶的分離純化
(1)將棘孢曲霉 Usper^iV^As. acWeatos) CGMCC No. 3876 的胞外酶粗酶液 2000 mL,用15%飽和度的硫酸銨沉淀，收集上清，在用80%飽和度的硫酸銨沉淀，收集沉淀；
⑵沉淀用G25脫鹽，收集β-葡萄糖苷酶活性峰，收集液用截留分子量為5000 Da中空纖維膜濃縮至1000 mL，得濃縮酶液Lys — 1 ；
(3)濃縮酶液Lys— 1用DEAE C-52離子交換進一步分離純化，用0 0. 8 mol/L的氯化鈉-20 mmol/L pH 5. 0檸檬酸緩沖液梯度洗脫，收集β -葡萄糖苷酶活性峰，收集液用截留分子量為5000 Da中空纖維膜濃縮至200 mL，得濃縮液Lys — 2 ；
(4)濃縮酶液Lys- 2，用葡聚糖凝膠G75層析，用20 mmol/L pH 5. 0檸檬酸緩沖液洗脫，收集β-葡萄糖苷酶活性峰，收集液用截留分子量為5000 Da超濾膜(Millipore，MW 10000, 50 ml, USA)濃縮至100 mL，得濃縮酶液Lys — 3，濃縮酶液Lys — 3為菌株棘孢曲霉CGMCC No. 3876的β -葡萄糖苷酶，即為本發明的虎杖糖苷水解酶；
(5)濃縮酶液Lys- 3經-40°C凍干并獲得純度為98%以上的虎杖糖苷水解酶固體粉劑。實施例8，菌株棘孢曲霉CGMCC No. 3876的虎杖糖苷水解酶濃縮酶液Lys — 3的酶學特性
⑴菌株棘孢曲霉CGMCC No. 3876的虎杖糖苷水解酶的亞基分子量，將濃縮酶液Lys — 3用10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，以及上海生化所蛋白質marker (14. 1 - 97. 4 KDa)測定亞基分子量[2]，該虎杖糖苷水解酶由一個亞基組成，亞基分子量為27. 3 kDa ；虎杖糖苷水解酶比活力達1783. 6 IU/(mg protein)。(2)虎杖糖苷水解酶等電點，將所述虎杖糖苷水解酶濃縮酶液Lys — 3，用5%的聚丙烯酰胺凝膠以及兩性電解質(Ampholine 0.4% pH 4 - 6以及pH 3-10, Sigma)按 0' Farrell方案等電聚焦[3]，測定等電點，等電點pi 4. 65 ；
⑶虎杖糖苷水解酶最適反應溫度，將所述虎杖糖苷水解酶濃縮酶液Lys — 3，分別在 250C，30°C。35°C，40°C，45°C，50°C，55°C，60°C，65°C，70°C溫度條件下水解 8 mg/mL 的虎杖糖苷水溶液，反應水解5min，用HPLC測定水解產物白藜蘆醇的含量，最適反應度40°C ；
(4)虎杖糖苷水解酶最適反應pH，將所述虎杖糖苷水解酶濃縮酶液Lys— 3，分別在 pH3. 5，pH4. 0，pH4. 5，pH5. 0，pH5. 5，pH6. 0，pH6. 5，pH7. 0 條件下水解 8 mg/mL 的虎杖糖苷水溶液，反應水解5min，用HPLC測定水解產物白藜蘆醇的含量，最適反pH為6. 0 ；
(5)虎杖糖苷水解酶反應常數，將所述虎杖糖苷水解酶濃縮酶液Lys— 3，在pH5. 0， 40°C條件下，分別水解1 10 mg/mL的虎杖糖苷水溶液，測定反應初速度，經雙倒數作圖法測定該酶米氏常數為·=5 mg/mL虎杖苷。實施例9，菌株棘孢曲霉CGMCC No. 3876虎杖糖苷水解酶水解虎杖糖苷為白藜蘆醇的轉化率
用蒸餾水配制0. 5%虎杖糖苷水溶液(虎杖糖苷原料含量98%)，加入0. 5%濃縮酶液 Lys-3 (純度為98%以上的所述虎杖糖苷水解酶)，在pH 5. 0，40°C條件下水解虎杖糖苷， 并不斷攪拌，水解0 20min，在不同水解時間測定虎杖糖苷的轉化率，其中3 min轉化率為44%，6 min轉化率為78%，9 min轉化率為93%，12 min轉化率為96%，15 min轉化率為 99% (見附圖1)，在20 min內虎杖糖苷幾乎完全水解為白藜蘆醇轉化率。經常規的離心過濾，蒸發濃縮獲得高純度的白藜蘆醇，純度達99. 0%。實施例10，菌株棘孢曲霉CGMCC No. 3876虎杖糖苷水解酶水解虎杖糖苷為白藜蘆醇的轉化率
用蒸餾水配制3%過飽和的虎杖糖苷水溶液(虎杖糖苷原料含量98%)，加入1%濃縮酶液Lys — 3 (純度為98%以上的所述虎杖糖苷水解酶)，在pH 5. 0，40°C條件下水解虎杖糖苷，并不斷攪拌，水解4 h，獲得過飽和的白藜蘆醇過飽和水溶液。虎杖糖苷在水溶液中溶解度很低，在過飽和狀態下，虎杖糖苷被所述虎杖糖苷水解酶源源不斷水解為白藜蘆醇。由于白藜蘆醇溶解度比虎杖糖苷溶解度更低，過飽和的白藜蘆醇水溶液不斷有白藜蘆醇析出， 在此機制下，虎杖糖苷幾乎完全水解為白藜蘆醇，轉化率達99. 7%。經常規的離心過濾，蒸發濃縮獲得高純度的白藜蘆醇，純度達98. 5%。實施例11，菌株棘孢曲霉CGMCC No. 3876的復合酶水解虎杖苷的為白藜蘆醇的轉化率
用蒸餾水配制5%過飽和的虎杖糖苷水溶液(虎杖糖苷原料含量50%)，加入菌株棘孢曲霉CGMCC No. 3876的復合酶，在pH 5. 0，40°C條件下水解虎杖糖苷，并不斷攪拌，水解6 h，獲得過飽和的白藜蘆醇過飽和水溶液。虎杖糖苷在水溶液中溶解度很低，在過飽和狀態下，虎杖糖苷被所述虎杖糖苷水解酶源源不斷水解為白藜蘆醇。虎杖糖苷幾乎完全水解為白藜蘆醇，經HPLC測定，轉化率達99. 5%。參考文獻Yuanshan Lin, Guiguang Chen , Min Ling , Zhiqun Liang. A method of purification, identification and characterization of β-glucosidase from Trichoderma koningii AS3. 2774. Journal of Microbiological Methods 83 (2010), 74 - 81.Laemmli, U. K. , . Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227(1970)，680 - 685.0' Farrel1, P. , High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J. Biol. Chem. 250(1975)，4007 - 4021.
權利要求
1.一種用于發酵生產虎杖糖苷水解酶并高效轉化虎杖苷為白藜蘆醇的微生物菌株，該菌株經分子生物學和形態學鑒定為棘孢曲霉識7ΛΛ5. acWeatos)，該菌株2010年5 月28日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號，CGMCC No. 3876。
2.權利要求1所述的微生物菌株發酵制備的復合酶，其特征在于(1)復合酶為胞外酶，含纖維素內切酶、纖維素外切酶、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶；⑵復合酶發酵制備方法為，用培養基(配方3% 6%麩皮、0. 5 1. 0%蛋白胨、起始ρΗ 5 6)，無菌條件下接種棘孢曲霉CGMCC No. 3876，在觀 30°C條件下好氧發酵3 3. 5 天，發酵經過濾、5000 10000 r/min離心，上清液用截留分子量為5000 Da中空纖維膜濃縮5倍，濃縮液為胞外酶粗酶液。
3.權利要求1-2所述的微生物菌株及其發酵制備的復合酶，用于從富含白藜蘆醇苷的植物材料中提取白藜蘆醇苷及其類似物的方法和用途，其特征在于⑴富含白藜蘆醇苷的植物材料可以是虎杖、花生殼、葡萄皮；⑵提取白藜蘆醇苷及其類似物的方法和用途為用權利要求1-2所述的菌株復合酶與60 80目的虎杖干粉調漿，胞外酶粗酶液虎杖干粉=1.5 mL:l g;在35 40°C條件下酶法水解3 4小時；再用5 6倍體積95%工業酒精浸提3次，每次1. 5 2小時，合并浸提液；結合常規方法揮干浸提液，獲得白藜蘆醇及其類似物的粗品。
4.權利要求1-2的菌株復合酶方法和用途還可以是用于轉化白藜蘆醇苷(虎杖苷)為白藜蘆醇的工藝用菌株棘孢曲霉CGMCC No. 3876復合酶，在ρΗ 5. 0，55°C條件下水解催化用蒸餾水配制1% 5%虎杖糖苷粗品懸濁液，將虎杖苷轉化為白藜蘆醇的方法。
5.權利要求1-2所述的微生物菌株及其發酵制備的復合酶中，從中分離純化獲得虎杖糖苷水解酶及其用途，其特征在于(1)菌株棘孢曲霉CGMCC No. 3876虎杖糖苷水解酶，由一個亞基組成，亞基分子量為 27.3 kDa，等電點pi 4. 65，最適反溫度40°C，最適反應pH 5. 0,Km=5 mg/mL虎杖苷，虎杖糖苷水解酶比活力達1783.6 IU/(mg protein)⑵用含量0. 5% 1%，純度為98%以上菌株棘孢曲霉CGMCC No. 3876虎杖糖苷水解酶， 在ρΗ 5.0, 55°C條件下水解催化用蒸餾水配制1% 5%過飽和的虎杖糖苷懸濁液(虎杖糖苷原料含量98%以上)，水解虎杖糖苷，并不斷攪拌，水解3 6 h，獲得過飽和的白藜蘆醇過飽和懸濁液；虎杖糖苷在水溶液中溶解度很低，在過飽和狀態下，虎杖糖苷被所述虎杖糖苷水解酶源源不斷水解為白藜蘆醇；由于白藜蘆醇溶解度比虎杖糖苷溶解度更低，過飽和的白藜蘆醇懸濁液不斷有白藜蘆醇析出，在此機制下，虎杖糖苷幾乎完全水解為白藜蘆醇的方法。
全文摘要
本發明提供一種從虎杖、花生殼、葡萄皮等植物材料中高效提取白藜蘆醇苷及其類似物所用的微生物菌株棘孢曲霉(Aspergillus.aculeatusCGMCCNo.3876)及其發酵制備的復合酶；用所述菌株的復合酶酶法提取虎杖苷及其類似物，提取率為2.3%；比未加所述菌株棘孢曲霉的胞外酶(對照)提取虎杖苷及其類似物，處理提高了91.7%。用所述菌株的復合酶轉化白藜蘆醇苷(虎杖苷)為白藜蘆醇的轉化率達99.5%以上；從所述菌株的復合酶中純化的虎杖糖苷水解酶，并轉化98%的虎杖苷為白藜蘆醇，轉化率達99.7%。白藜蘆醇純度達98.5%。本發明為生產實際提供一種新型復合酶制劑，從根本上解決當前生產升級中酶催化活性不高，轉化率低，時間過長，成本高的問題，促進生產實踐應用。
文檔編號C12N9/42GK102408999SQ20111017932
公開日2012年4月11日 申請日期2011年6月29日 優先權日2011年6月29日
發明者龐一林, 楊祖佑, 林元山, 鄒冬生 申請人:林元山