專利名稱：新型重組雙功能融合蛋白及其制法和用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物醫藥領域。更具體地，本發明涉及新型重組雙功能融合蛋白及其制法和用途。本發明還涉及一種生產新型重組雙功能融合蛋白藥的基因工程技術平臺及其應用。
背景技術：
腫瘤、肝纖維化、風濕病、艾滋病等每年奪走幾千萬人的生命，造成數億美元的經濟損失。細胞膜表面的受體和相應配體的結合，是此類疾病產生和發展的重要原因，因此開發相應的蛋白配體藥物具有良好的應用前景。 目前公知的蛋白藥包括生長因子、激素類蛋白、酶類蛋白、細胞因子、干擾素、促紅細胞生成素、以及融合蛋白等。除融合蛋白以外，其它蛋白藥均屬于均質蛋白，即只含有一種蛋白成分。而現有的融合蛋白藥(如依那西普Etanercept、列洛西普rilonacept)由受體蛋白的膜外區與人IgG Fe段融合而成，雖然含有兩種蛋白成分，但仍然只發揮一種功能，即阻斷細胞膜內源性受體與相應配體的結合。如依那西普可以阻斷腫瘤壞死因子(TNF-α )與二型腫瘤壞死因子受體(TNFRII)結合，從而發揮對類風濕病的治療作用。列洛西普則可以阻斷細胞因子白介素I(IL-I)的生物學活性，用以治療家族性寒冷型自身炎癥綜合征和穆-韋(Muckle-Wells)兩氏綜合征。然而，迄今為止尚沒有重組雙功能融合蛋白藥治療此類疾病的報道。因此，開發具有雙功能融合蛋白藥對延長患者的生存時間、改善患者的生存質量、降低死亡率具有重要意義。
發明內容
本發明的目的在于提供一個基因工程技術平臺，利用該平臺可生產重組雙功能融合蛋白類藥物如T β RII-FC-CLEC2，并闡明其用途。在本發明的第一方面，提供了一種蛋白單體，所述蛋白單體具有式Ia或式Ib所述結構A-B-C (Ia)，或C-B-A (Ib)其中，A為I型穿膜蛋白膜外區元件；B為免疫球蛋白元件；C為II型穿膜蛋白膜外區元件；表示連接上述元件的肽鍵或肽接頭。在另一優選例中。所述的蛋白單體具有選自下組的一個或多個特征所述的I 型穿膜蛋白選自下組TGF-@RI、TGF-β RH、SIRPla、RANK、VEGFRl、VEGFR2、CTLA4 或其組合。
在另一優選例中，所述的I型穿膜蛋白具有抑制免疫功能、促進腫瘤細胞的轉移和侵襲、促進腫瘤組織的血管發生、促進腫瘤轉移等功能。所述的II 型穿膜蛋白選自下組CLEC-2、DECTIN-l、NKG2D、DC-SIGN、Mincle。在另一優選例中，所述的II型穿膜蛋白具有激活血小板、促進血小板凝集、促進HIV對樹突狀細胞(DC)感染等功能。在另一優選例中，A為TGF-β II型受體(Τβ RII)膜外區元件。在另一優選例中，B為人免疫球蛋白IgGl的Fe片段。在另一優選例中，C為CLEC2膜外區元件。在另一優選例中，上述的肽接頭的長度為1-30個氨基酸，較佳地2-15個氨基酸。在另一優選例中，所述單體具有以下多種功能a)可以同時與兩種配體結合；b)可抑制TGF-β所誘導的Smad2的磷酸化；c)可抑制單克隆抗體18H5與podoplanin陽性腫瘤細胞的結合；d)可抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲。在本發明的第二方面，提供了一種雙功能蛋白二聚體，所述二聚體由兩個本發明第一方面所述的蛋白單體構成。
在另一優選例中，所述二聚體具有式IIa或式IIb所述結構
A-B-CC-B-A
Il或Il
A-B-C (IIa)，C-B-A(IIb)其中，A為I型穿膜蛋白膜外區，B為免疫球蛋白元件，C為II型穿膜蛋白膜外區，“I I”表示二硫鍵。在本發明的第三方面，提供了一種分離的多核苷酸，所述多核苷酸編碼本發明第一方面所述的蛋白單體。在本發明的第四方面，提供了一種載體，所述載體含有本發明第三方面所述的多核苷酸。在本發明的第五方面，提供了一種宿主細胞，所述宿主細胞含有本發明第四方面所述載體或基因組中整合有本發明第三方面所述的多核苷酸。在另一優選例中，所述宿主細胞為CHO細胞。在本發明的第六方面，提供了一種產生融合蛋白的方法，它包括步驟在適合表達的條件下，培養本發明第五方面所述的宿主細胞，從而表達出本發明第一方面所述的蛋白單體；和分離所述蛋白單體或由所述單體形成的二聚體。在本發明的第七方面，提供一種藥物組合物，所述組合物含有本發明第一方面所述的蛋白單體和/或本發明第二方面所述的雙功能蛋白二聚體，以及藥學上可接受的載體。在本發明的第八方面，提供了如本發明第一方面所述的蛋白單體和/或本發明第二方面所述的雙功能蛋白二聚體的用途，所述單體或二聚體用于制備治療疾病的藥物。在另一優選例中，所述的疾病選自腫瘤、肝臟纖維化或艾滋病。本發明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。應理解，在本發明范圍內中，本發明的上述各技術特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特征之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
圖I顯示了重組雙功能融合蛋白Τβ RII-Fc-CLEC2構造。圖2顯示了重組雙功能融合蛋白的工作原理，一方面，TPRII與TGF-β結合，阻斷其與細胞膜表面TGF-β受體的結合，抑制TGF-β的生物學活性；另一方面，CLEC-2與腫瘤細胞膜上的podoplanin結合,阻斷其與血小板表面的CLEC-2結合,從而抑制腫瘤細胞誘導的血小板凝集。圖3顯示了重組雙功能蛋白T0RII-Fc_CLEC2表達載體的結構。TPRII位于氨基端，CLEC2位于羧基端，Fe片段處于二者之間。 圖4A顯示了 Τβ RII-Fc-CLEC2包含三種蛋白成分如果用抗Fe的抗體進行雜交，雙功能融合蛋白Ti3RII-Fc-CLEC2與單功能融合蛋白T β RII-Fc均出現雜交帶，如果用抗CLEC2的抗體檢測，只有TRII-Fc-CLEC2出現雜交帶，如果用抗T β RII的抗體檢測，兩種蛋白均出現雜交帶。圖4Β顯示了 T β RII-Fc-CLEC2單體和二聚體SDS-PAGE電泳圖。圖5Α顯示了重組雙功能蛋白可以與TGF-β I結合，50%的有效結合濃度(ED5tl)為3ηΜ。圖5Β為流式細胞儀檢測結果,表明重組雙功能蛋白可以與表達podoplanin的腫瘤細胞結合，結合程度與抗podoplanin的單克隆抗體(18H5)類似。圖6顯示了 T β RII-Fc-CLEC2可抑制TGF- β所誘導的Smad2的磷酸化。圖7顯示了 T β RII-Fc-CLEC2可抑制TGF-β所誘導的腫瘤細胞的遷移。圖8顯示了 T β RII-Fc-CLEC2可抑制TGF-β所誘導的腫瘤細胞的侵襲。圖8Α顯示了在沒有TGF-β I存在的條件下，PC-3細胞沒有侵襲能力，因此基底膜下層幾乎沒有細胞，加入TGF-β I以后則顯著誘導PC-3細胞從基底膜上層向下層侵襲。如果在基底膜上層加入TeRII-Fc-CLEC2，由于其可以與TGF-β I結合，阻斷了 TGF-β I與PC-3細胞膜表面TGF-β受體的結合，所以則抑制了 TGF-β I所誘導的PC-3細胞的侵襲能力，hlgG與TGF-β I結合能力很弱。圖SB顯示了各處理組的侵襲細胞數計數結果。圖9顯示了不同濃度Τβ RII-Fc-CLEC2處理組流式細胞結果。圖10顯示了不同濃度的T 0RII-Fc_CLEC2處理后細胞表面podoplanin強度結果O
具體實施例方式為了克服現有融合蛋白類藥物功能單一的缺陷，本發明人經過廣泛而深入的研究，首次建立了一個基因工程技術平臺，利用該平臺可生產重組雙功能融合蛋白類藥物，例如T β RII-FC-CLEC2。在此基礎上完成了本發明。以T β RII-Fc-CLEC2為例，它具有以下功能1)可以同時與TGF-β和podoplanin (CLEC-2的配體)結合；2)可抑制TGF-β所誘導的Smad2的磷酸化；3)可抑制單克隆抗體18H5與podoplanin陽性腫瘤細胞的結合；4)可劑量依賴性的抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲。在一個實施例中，本發明人改良plg-Fc載體，分別PCR擴增二型TGF-β受體的膜外區和CLEC-2的膜外區，形成新載體？18-1^1 114(3-0^02。本發明人通過試驗證實，表達
的TPRII-Fc-CLEC2可以同時與兩種靶點(TGF-β和podoplanin)結合。由于TGF-β可以促進腫瘤的轉移、刺激腫瘤內血管生成、促進腫瘤的骨轉移、激活肝臟的星狀細胞，誘導產生各種細胞外基質、細胞骨架蛋白、細胞因子及膜表面受體，因此Τβ RII-Fc-CLEC2可以用以治療腫瘤和肝臟纖維化。由于CLEC-2是結合HIV附件因子，可以介導血小板對HIV的捕獲以及HIV向T細胞的傳播，所以Ti3RII-Fc-CLEC2有望用于治療艾滋病。此外，除了誘導腫瘤轉移以外，TGF-β還抑制機體的免疫功能，所以通過抑制TGF- β的活性，T β RII-Fc-CLEC2還可以增強機體的免疫功能。I型穿膜蛋白及其膜外區I型穿膜蛋白的特點是蛋白質序列的氨基端在細胞膜外，羧基端在細胞膜內。I型穿膜蛋白通常包括免疫球蛋白超級家族成員(⑶4、⑶8、⑶28、CTLA4、⑶80、⑶86、SIRPla等)、激酶樣受體(TGF-β受體、EGFR、VEGFR、PDGFR, HGF受體等)、細胞因子受體(TNF受體、RANK、IL-6受體、CSFl受體、c_kit等)。當與其相應配體結合以后，根據其相應的受體特性，I型穿膜蛋白可誘導一系列不同的生物學功能反應。可用于本發明的I型穿膜蛋白沒有特別限制，可以是所有具有生物學功能的I型穿膜蛋白。一類優選的I型穿膜蛋白包括(但并不限于)TGF-@ RH、TNF-aR、SIRPla、RANK、VEGFRl、VEGFR2、CTLA4 或其組合。II型穿膜蛋白及其膜外區II型穿膜蛋白的特點是蛋白質序列的羧基端在細胞膜外，氨基端在細胞膜內。通常II型穿膜蛋白多為C型凝集素、或C型凝集素樣受體。該類受體的膜外區含有糖結合域(Carbohydrate-binding domain),也稱作 C 型凝集素樣區域(C-Type Lectin Domain,CTLD)。具有糖結合域的蛋白往往有多種功能，可參與細胞間的粘附、參與激活血小板、參與對致病菌的免疫功能、以及誘導細胞凋亡等。可用于本發明的II型穿膜蛋白沒有特別限制，可以是所有具有生物學功能的II型穿膜蛋白。一類優選的II型穿膜蛋白包括(但并不限于)CLEC_2、DECTIN-I、NKG2D、DC-SIGN、Mincle 或其組合。免疫球蛋白G元件在本發明中，適用的免疫球蛋白G元件沒有特別限制，可以是來自人或其他哺乳動物的免疫球蛋白元件，或其突變物和衍生物。優選來自人的免疫球蛋白的元件。人免疫球蛋白G包括四個亞類IgGl、IgG2、IgG3、IgG4。這四個亞類的蛋白結構有很大的相似性，都有四個區域一個可變區(VH)，三個恒定區(CH1、CH2、CH3)。Fe片段由兩個恒定區(CH2-CH3)所組成，其中在CH2區域有一個二硫鍵，使得兩個Fe片段單體組成共價結合的同源二聚體。正常生理條件下，人體血漿內IgG的濃度以IgGl最高，IgG2次之，IgG3和IgG4濃度較低。一種優選的G元件是人IgGl Fe片段，或其突變物、衍生物。雙功能蛋白及其制備在本發明中，“重組雙功能蛋白”、“本發明雙功能蛋白”、“本發明蛋白”、“雙功能蛋白”可互換使用，指具有式Ia或Ib所述結構，含有I型穿膜蛋白膜外區元件、免疫球蛋白元件、和II型穿膜蛋白膜外區元件的融合蛋白。一個代表性的例子是Ti3RII-Fc-CLEC2。本 發明蛋白可以是單體或由單體形成的多聚體(如二聚體)。此外，應理解，所述術語還包括重組雙功能蛋白的活性片段和衍生物。如本文所用，“分離的”是指物質從其原始環境中分離出來(如果是天然的物質，原始環境即是天然環境)。如活體細胞內的天然狀態下的多核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多核苷酸或多肽如從天然狀態中同存在的其他物質中分開，則為分離純化的。如本文所用，“分離的重組雙功能蛋白”是指重組雙功能蛋白基本上不含天然與其相關的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質。本領域的技術人員能用標準的蛋白質純化技術純化重組雙功能蛋白。基本上純的蛋白在非還原聚丙烯酰胺凝膠上能產生單一的主帶。本發明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。本發明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發明有相同的氨基酸序列的蛋白質片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發生的等位變異體或非天然發生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質上改變其編碼多肽的功能。如本文所用，術語“引物”指的是在與模板配對，在DNA聚合酶的作用下能以其為起點進行合成與模板互補的DNA鏈的寡居核苷酸的總稱。引物可以是天然的RNA、DNA，也可以是任何形式的天然核苷酸。引物甚至可以是非天然的核苷酸如LNA或ZNA等。引物“大致上”(或“基本上”)與模板上一條鏈上的一個特殊的序列互補。引物必須與模板上的一條鏈充分互補才能開始延伸，但引物的序列不必與模板的序列完全互補。比如，在一個3’端與模板互補的引物的5’端加上一段與模板不互補的序列，這樣的引物仍大致上與模板互補。只要有足夠長的引物能與模板充分的結合，非完全互補的引物也可以與模板形成引物-模板復合物，從而進行擴增。本發明融合蛋白的各元件(如TPRII和CLEC2)的核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據已公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，并用市售的cDNA庫或按本領域技術人員已知的常規方法所制備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然后通過常規方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關序列。此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。應用PCR技術擴增DNA/RNA的方法被優選用于獲得本發明的基因。用于PCR的引物可根據本文所公開的本發明的序列信息適當地選擇，并可用常規方法合成。可用常規方法如通過凝膠電泳分離和純化擴增的DNA/RNA片段。本發明也涉及包含本發明的多核苷酸的載體 ，以及用本發明的載體或融合蛋白編碼序列經基因工程產生的宿主細胞，以及經重組技術產生本發明所述蛋白質的方法。通過常規的重組DNA技術，可利用本發明的多核苷酸序列可用來表達或生產重組蛋白。一般來說有以下步驟(I).用本發明的編碼本發明蛋白的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達載體轉化或轉導合適的宿主細胞；(2).在合適的培養基中培養的宿主細胞；(3).從培養基或細胞中分離、純化蛋白質。本領域的技術人員熟知的方法能用于構建含本發明蛋白的編碼DNA序列和合適的轉錄/翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、體內重組技術等。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當啟動子上，以指導mRNA合成。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結合位點和轉錄終止子。此外，表達載體優選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用于選擇轉化的宿主細胞的表型性狀，如真核細胞培養用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環素或氨芐青霉素抗性。包含上述的適當DNA序列以及適當啟動子或者控制序列的載體，可以用于轉化適當的宿主細胞，以使其能夠表達蛋白質。宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如哺乳動物細胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬的細菌細胞；真菌細胞如酵母；植物細胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細胞；CH0、COS、或293細胞的動物細胞等。用重組DNA轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規技術進行。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態細胞可在指數生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉染方法磷酸鈣共沉淀法，常規機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質體包裝等。獲得的轉化子可以用常規方法培養，表達本發明的基因所編碼的多肽。根據所用的宿主細胞，培養中所用的培養基可選自各種常規培養基。在適于宿主細胞生長的條件下進行培養。當宿主細胞生長到適當的細胞密度后，用合適的方法(如溫度轉換或化學誘導)誘導選擇的啟動子，將細胞再培養一段時間。在上面的方法中的蛋白質可在細胞內、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化蛋白。這些方法是本領域技術人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規的復性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術及這些方法的結合。抗體本發明中，“抗體”、“配體”可互換使用，是指對本發明蛋白具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能分別結合于本發明蛋白或其片段。較佳地，指那些能與本發明蛋白或片段結合但不識別和結合于其它非相關抗原分子的抗體。本發明的抗體可以通過本領域內技術人員已知的各種技術進行制備。本發明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab’或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子；或嵌合抗體。肽接頭 本發明提供了一種雙功能融合蛋白，它可任選地含有肽接頭。肽接頭大小和復雜性可能會影響蛋白的活性。通常，肽接頭應當具有足夠的長度和柔韌性，以保證連接的兩個蛋白在空間上有足夠的自由度以發揮其功能。同時避免肽接頭中形成α螺旋或β折疊等對融合蛋白的穩定性的影響。過短的肽接頭可在融合蛋白內部造成空間位阻，影響蛋白的正確折疊，過長的肽接頭可能增加融合蛋白的免疫原性，還可能影響融合蛋白的活性和功能。連接肽的長度一般為4-44個氨基酸，較佳地6-27個氨基酸，更佳地2-15個氨基酸。藥物組合物及施用方法本發明還提供了一種組合物，它含有有效量的本發明的融合蛋白，以及藥學上可接受的載體。通常，可將本發明的融合蛋白配制于無毒的、惰性的和藥學上可接受的水性載體介質中，其中PH通常約為5-8，較佳地，pH約為6-8。如本文所用，術語“有效量”或“有效劑量”是指可對人和/或動物產生功能或活性的且可被人和/或動物所接受的量，如O. 000001-90wt% ;較佳的O. l-50wt% ;更佳的，5-40wt% ο如本文所用，“藥學上可接受的”的成分是適用于人和/或哺乳動物而無過度不良副反應(如毒性、刺激和變態反應)的，即具有合理的效益/風險比的物質。術語“藥學上可接受的載體”指用于治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。本發明的藥物組合物含有安全有效量的本發明的融合蛋白以及藥學上可接受的載體。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。通常藥物制劑應與給藥方式相匹配，本發明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規方法進行制備。所述的藥物組合物宜在無菌條件下制造。活性成分的給藥量是治療有效量。本發明的藥物制劑還可制成緩釋制劑。本發明所述的融合蛋白的有效量可隨給藥的模式和待治療的疾病的嚴重程度等而變化。優選的有效量的選擇可以由本領域普通技術人員根據各種因素來確定(例如通過臨床試驗)。所述的因素包括但不限于所述的融合蛋白的藥代動力學參數例如生物利用率、代謝、半衰期等；患者所要治療的疾病的嚴重程度、患者的體重、患者的免疫狀況、給藥的途徑等。通常，當本發明的融合蛋白每天以約O. 00001mg-50mg/kg動物體重(較佳的O. 0001mg-10mg/kg動物體重)的劑量給予,能得到令人滿意的效果。例如，由治療狀況的迫切要求，可每天給予若干次分開的劑量，或將劑量按比例地減少。本發明所述的融合蛋白單體及其二聚體或多聚體的主要優點包括I)可以同時與TGF- β和podoplanin (CLEC-2的配體)結合；2)可抑制TGF- β所誘導的Smad2的磷酸化；3)可抑制單克隆抗體18H5與podoplanin陽性腫瘤細胞的結合；4)可劑量依賴性的抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲；5)可阻止HIV與樹突狀細胞(DC)的結合； 6)可阻斷TGF- β的免疫抑制活性，從而增強免疫功能；7)可阻斷TGF- β誘導肝臟纖維化。下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New York Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數是重量百分比和重量份數。實施例I構建plg-T β RII-Fc-CLEC2 載體I.改良plg-Fc載體，去除Fe羧基端的終止密碼。利用引物I (SEQ ID NO 1)和2 (SEQ ID Ν0:2)(見表I)擴增Fe編碼基因，擴增產物克隆至原始Plg-Fc載體(購自CL0NETECH公司)的EcoRI和XhoI克隆位點。2. PCR擴增II型TGF-β受體的膜外區。利用引物3(SEQID NO 3)和4(SEQ ID NO 4)，以乳腺癌細胞株(MDA-MB-231)(中科院細胞庫)來源的cDNA為模板，PCR擴增II型TGF-β受體的膜外區，擴增產物克隆至改良的Plg-Fc載體的HindIII和EcoRI克隆位點，形成pIg-Τβ RII-Fc。3. PCR擴增CLEC-2的膜外區利用引物5 (SEQ ID NO 5)和6 (SEQ ID NO :6)，以人外周血單個核細胞(PBMC)來源的cDNA為模板，PCR擴增CLEC-2的膜外區，擴增產物克隆至pIg_T β RII-Fc載體的XhoI和 XbaI 克隆位點，形成 plg-T β RII-Fc-CLEC2。表I
權利要求
1.一種蛋白單體，其特征在于，所述蛋白單體具有式Ia或式Ib所述結構 A-B-C (Ia),或 C-B-A (Ib) 其中， A為I型穿膜蛋白膜外區元件； B為免疫球蛋白元件； C為II型穿膜蛋白膜外區元件； 表示連接上述元件的肽鍵或肽接頭。
2.如權利要求I所述的蛋白單體，其特征在于，具有選自下組的一個或多個特征 所述的 I 型穿膜蛋白選自下組TGF-e RI、TGF-β RII、SIRPla、RANK、VEGFRl、VEGFR2、CTLA4或其組合；和/或 所述的II型穿膜蛋白選自下組CLEC-2、DECTIN-l、NKG2D、DC-SIGN、Mincle或其組合。
3.如權利要求I所述蛋白單體，其特征在于，所述單體具有以下多種功能 a)可以同時與兩種配體結合； b)可抑制TGF-β所誘導的Smad2的磷酸化； c)可抑制單克隆抗體18H5與podoplanin陽性腫瘤細胞的結合； d)可抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲。
4.一種雙功能蛋白二聚體，其特征在于，所述的二聚體由兩個權利要求1-3中任一所述的蛋白單體構成。
5.如權利要求4所述的二聚體，其特征在于，所述二聚體具有式IIa或式IIb所述結構 A-B-CC-B-A Il或IlA-B-C (IIa)，C-B-A(IIb) 其中， A為I型穿膜蛋白膜外區， B為免疫球蛋白元件， C為II型穿膜蛋白膜外區， “I I”表示二硫鍵。
6.一種分離的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸編碼權利要求I所述的蛋白單體。
7.—種載體，其特征在于，它含有權利要求6所述的多核苷酸。
8.一種宿主細胞，其特征在于，它含有權利要求7所述的載體或基因組中整合有權利要求6所述的多核苷酸。
9.一種產生蛋白的方法，其特征在于，它包括步驟 在適合表達的條件下，培養權利要求8所述的宿主細胞，從而表達出權利要求I所述的蛋白單體；和 分離所述蛋白單體或由所述單體形成的二聚體。
10.一種藥物組合物，其特征在于，所述組合物含有權利要求I所述的蛋白單體和/或權利要求4所述的雙功能蛋白二聚體，以及藥學上可接受的載體。
11.如權利要求I所述的蛋白單體和/或權利要求4所述的雙功能蛋白二聚體的用途，其特征在于，用于制備治療疾病的藥物。
全文摘要
本發明提供了一種新型重組雙功能融合蛋白及其制法和用途。具體地，該融合蛋白包括以下結構I型穿膜蛋白的膜外區和II型穿膜蛋白的膜外區，二者通過免疫球蛋白串聯在一起，該雙功能蛋白可以同時阻斷兩種配體與相應內源性受體的結合，從而抑制配體的生物學活性。本發明還提供了新型重組雙功能融合蛋白藥在疾病治療中的作用。通過本發明的基因工程技術平臺，可以生產新型重組雙功能融合蛋白藥物。
文檔編號C12N5/10GK102850458SQ20111017834
公開日2013年1月2日 申請日期2011年6月28日 優先權日2011年6月28日
發明者田文志 申請人:華博生物醫藥技術(上海)有限公司