小麥脫水素基因的啟動子及其應用的制作方法

專利名稱：小麥脫水素基因的啟動子及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于植物基因工程技術領域，涉及一種小麥脫水素基因的啟動子及其應用。
背景技術：
近年來，各種非生物脅迫嚴重影響作物的產量。在各種非生物脅迫中，鹽脅迫和冷脅迫常常由于引起細胞的脫水而導致作物產量的降低。特別是隨著工業的發展，土壤鹽漬化愈來愈嚴重，已成為一個全球關注的社會問題。因此，通過基因工程培育耐逆農作物新品種已成為當前一個十分迫切的任務。在基因工程育種中，常用的是組成型表達的啟動子，例如花椰菜花葉病毒CaMV 35S啟動子⑴biquitin啟動子等。但組成型表達的啟動子在整個生長發育過程中均能高效地啟動目的基因的轉錄，這種高效表達經常是以大量的營養消耗為代價，從而直接影響了植株的生長發育，表現為植物生長延滯、植株矮小、產量降低等。而誘導型啟動子只在某些物理或化學信號的刺激下或者植物發育到特定的階段，才啟動外源基因的轉錄。它不僅能使目的基因的表達產物在一定時空積累，增加區域表達量，提高植株的抗逆性，同時可避免由組成型啟動子啟動外源基因超表達引起的對植物發育的負面影響，是基因工程育種中的理想啟動子。脫水素又稱胚發育后期豐富蛋白，在鹽、旱、冷等引起的細胞脫水過程中大量表達，因此脫水素基因的啟動子是抗逆基因工程育種中很好的候選誘導型啟動子。目前脫水素基因的啟動子已在擬南芥等幾種植物中被克隆，但有關小麥脫水素基因啟動子的克隆及應用還未見報道。

發明內容
本發明的目的是提供一種在單子葉植物中能被非生物脅迫(鹽、冷)誘導表達的啟動子Τ·ΝΡ。本發明的技術方案在于首先根據小麥的表達譜芯片數據選出在小麥幼苗根中顯著受鹽誘導表達的脫水素基因，然后根據基因序列設計基因特異性引物，利用 Genomeffalker方法克隆目的基因的啟動子，然后在擬南芥中進行功能驗證。本發明所提供的啟動子來自小麥脫水素基因的上游序列，命名為TaDHNP0 可以是下述核苷酸序列之一
1)序列表中序列的SEQ ID No. IDNA序列。2)在高嚴謹條件下可與序列表中序列SEQ ID No. 1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。上述高嚴謹條件為可在0. IXSSC (或SSPE)、0. P/oSDS溶液中，65°C雜交并洗膜。本發明還提供了含上述啟動子的植物表達載體TaDHNP。本發明所述啟動子7 / °在培育耐鹽、耐冷植物中的應用。所述植物所述植物為小麥或擬南芥，優選是普通小麥。所述的小麥脫水素基因的啟動子的植物表達載體在培育耐鹽、耐冷植物中的應用，所述植物為小麥或擬南芥。將任何植物逆境相關基因連接到本發明所述誘導型啟動子的下游均可被誘導轉錄。而且任何一種可以將外源基因導入植物中表達的載體都可以應用。本發明的有益效果通過轉基因實驗表明，本發明所克隆的啟動子能被鹽和冷誘導表達。該啟動子可以啟動任何植物逆境相關基因的表達，可廣泛用于培育耐鹽、耐冷農作物新品種。TaDHNP啟動子序列分析；
其中，帶有下劃線的序列為順式作用元件序列；順式作用元件名稱分別為 CGGGGG-GC-motif, CAGTTG-MBS, TTATTACGAA-WUNiotif, TGACG-CGTCAiotif, TACGTG-ABRE, ACGTGGC-ABRE, CACGTA-ABRE ；
CACGGCCCGGGCTGGTAAAAACGAAGAGAGTATTGTGCATGGCGTTTCATACTTGCTTTTCATGGAAGTTCA TACCAGGCTGTTGTCTCTCTCATTCATCTTGAATCTTGACAAATGCCATCCCGACAAGTTACAAGTCAGCTCAAATC TCGTCCGGAAACTTCAGCATAATGACAGTCCTGTTCTAGGCTCCTAGCTCAGATCACCGACCTCCTTTCCTCGATTA CTTGTTCTCCTAACCAAAACTGAATGAAGTAACATGAGTCTTGCTTGTGGCTGGCCTACAACCGCACGCCCGCGACG GAGCTCCCATCGTGGTGACACCGCGCTGCGCACAAGCGACTAGCGCTGCCACAATCGAGGACGCCGCCGTGAAGACG AGCTCCGGACTATCACCAGCCGCCTGAGATCTCCCCATCAAAAGAGCAGCCGGCGAGGAGCACGAGCCCCGCCGCCG CCGGCTCCACGCATGCTTTGCATGTCAGAGGCCACCGGCGATGGCGAGGGGGTGGATGGGATGGGTGAGGCGAGGAG AGGCTGGTGTTTTTCGCCACCCGTGTCGCCCTGGGGAGGGCGCGACGCGGGGGCAGATGGGATCCACTAGTTCGATC AGTTGAAGCCCTACGTATATTTTTTCCGATATGAAATATAAAATATTGGGAAGATATTTATTACTCAAATGCATAGA ACAACATTATTACGAAAGGAAGAAGAAAAAAAGGTGAACAACACCCCCAGCAAACGACAACAACAATGACGACAAGC ATCAATGATAGCACCCATAGGTAACAGTATACGTGCTTTAACAATGATGCTTTTAGGGAGGTATAGGTGCTTCAACA ATGATGCTTTCAGGAAGAGAACAACACATGAGCGCTGTCGTCGTTGTAACCAACCACTAAGGTTAGATCGTGAATTT TCACCTCGAAGAGGAGTTTGAGTAAACTTCATGCAATGTCTTCAACTAGAGAATGTCATATGAACAACAACATTCCC ATGTTCAACCAATGAAGGTGGATCATAAGTTTTCACCCTGAGACTCAGCCCTTGCACTCAACTTCTGTCACCTAACC TACTTCGCCTTGTGTTGCTAGCATACCATCACCTGCCGACCCATTTTCCCATTTTTAATGAGCAGGGTTATGATTTT CAGTCGATGCATATTTTCATGGACGTGCGATGGACATCCTCGCGGGCATAAAAATGAATTTGATATTGCTCGATCAT AATAACCCGAACGCGCCTACTTTTAATGATAGGATACCTTTGGTCCATATAGTTCCATTTTTGTTCCATGCCGACGC TTCGAGCTGTCAGTTTCCGAAGCAAACAAGACGACTTTTGGAAGTGTCCCTTGTGTGTCATCACCTCTTCGAGAACA AGCTCAGACGTGGCAACCCGAAGGCGCCCAGTAGCTGCACACGTCCGACCTCTCTTTATGGGCTAGTCATCAGTCAC CGGCAACCCGCTCCCGCGAGCACACGTAGCGCCTCCGACGATCCTATCCCGTCGGCTATAAATTGTGCCTCGTGCTG GACCTGCCTACACAACACAGCCACGAGTAGCAGCCAAGTCGGGAAGACAACCAAGATCAACACCTGTGCAAGTCTGC AAGATG。


圖1鹽脅迫條件下脫水素基因Ti^iW在小麥山融3號幼苗根和葉中的RT-PCR分析；
其中，Actin為內參；leaf 葉；root 根；
圖2從小麥山融3號基因組DNA中擴增7 / °啟動子的電泳圖； 其中，M :DNA分子量marker (下同)；
4圖3pCAM1391Z/TaDHNP啟動子表達載體的酶切驗證； 圖4轉化pCAM1391Z/TaDHNP載體的轉基因擬南芥的PCR鑒定； 其中，Tl為轉基因擬南芥株系；
圖5轉化pCAM1391Z/TaDHNP載體的轉基因擬南芥⑶S染色結果； 其中，A 轉化pCAM1391Z/TaDHNP的轉基因擬南芥株系在對照條件下的GUS染色結果； B、C、D 轉化pCAM1391Z/TaDHNP的轉基因擬南芥株系經IOOmM NaCl處理48小時后的GUS 染色結果，C、D為B圖放大效果；F 轉化pCAM1391Z/TaDHNP的轉基因擬南芥經4°C處理48 小時后的GUS染色結果。
具體實施例方式實施例1、小麥脫水素基因TaDHN的表達分析 1. 1材料處理
小麥品種山融3號的種子正常萌發，一周后去掉胚乳，在Hangload培養液中培養至兩周，轉入含有200mM NaCl的Hangload培養液中進行脅迫處理。處理后的0、0. 5、3、12、24， 48小時取幼嫩的葉片和根系，液氮中保存。1. 2 Trizol 法提取小麥 iTotal RNA
1.將組織材料放入液氮預冷的研缽中，在液氮中充分研磨成粉末；
2.待液氮揮發干，立即轉移到2ml的離心管中，每IOOmg材料約加入Iml的^witrogen 公司的TRIzoI提取液，劇烈振蕩混勻樣品，使樣品充分裂解，室溫放置5分鐘；
3.加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩混勻15秒，室溫放置10分鐘；
4.40C，12000rpm 離心 15 分鐘；
5.用移液器小心吸出上層水相，加入新的1.5ml的離心管中，加入500μ 1的異丙醇 (1:1體積)，充分混勻，-20 0C，沉淀30min ；
6.4°C,12000rpm離心IOmin,小心棄去上清液；
7.RNA沉淀用Iml的75%乙醇洗滌。4°C，8000rpm離心IOmin收集沉淀；
8.重復用75%乙醇洗滌一次RNA沉淀；
9.去上清，RNA沉淀于無菌操作臺上晾干約10-15分鐘至RNA略顯透明，加入適當體積 (30-50 μ 1)的RNase-free水充分溶解(可放于_80°C長期保存)；
10.紫外分光光度計及PMgrose凝膠電泳檢測RNA濃度及質量。注a)用紫外分光光度計檢測RNA的產量，在^Onm處的吸光度，10D=40ug/ml。根據在260nm和280nm處的吸光值，檢測RNA的純度，純RNA的0D26(1/0D28(1比值應接近2. O (比值最好在1. 9 2. 1之間)。b)用l%AgroSe凝膠電泳檢側RNA的質量及大小。吸取Iul RNA加入3 μ 1的 RNase-free水，加1 μ 1上樣緩沖液6 5°C變性5分鐘。電泳后用EB染色，另取3 μ 1的11Λ DNAMarker作為對照。1. 3第一鏈cDNA的合成
采用Prim必cript RT-PCR Kit進行。反應步驟如下 1.在Microtube管中配制下列混合液。dNTP Mixture (10 mM) 1 μ 1Oligo dT Primer (2. 5 μ Μ) 1 μ 1
Total RNA Rnase free H9O
4μ 1 4μ 1
2.在PCR儀上進行變性、退火反應。
65 "C 5 min
4 0C 1 min
3.離心數秒鐘使RNA/引物等的混合液聚集于Microtube管底部。4.在上述Microtube管中配制下列反轉錄反應液。上述變性、退火后反應液 10 μ 1 5XPrimerScript Buffer 4 μ 1 RNase Inhibitor (40U/μ 1) 0. 5 μ 1 PrimScript RTase0. 5 μ 1 Rnase Free dH20 5 μ 1
5.在PCR儀上按下列條件進行反轉錄反應 42 0C 15-30 min 95 0C 5 min 4 0C
1.4 PCR反應及電泳
1.以⑶嫩為模板，進行PCR反應。引物如下 TaAct-S 5’ - GTTCCAATCTATGAGGGATACACGC -3’ TaAct-A: 5’ - GAACCTCCACTGAGAACAACATTACC -3’ TaDHN-S: 5' -CAGCCAAGTCGGGAAGACAAC-3‘ TaDHN-A5‘ -TGGCCACCAGGGAGCTTCTC-3‘
2.PCR體系
ddH204. 7 μ 1
IOX buffer2μ 1
Primerl (2 μ Μ)1 μ 1
Primer2 (2 μ Μ)1 μ 1
dNTP (IOmM each)0. 2 μ 1
rTaq polymerase (5U/μ 1)0. 1 μ 1
逆轉錄cDNA模板1 μ 1
Total Volume10 μ 1
3.PCR程序
94°C 5min, 25 30 cycles 94°C 20s, 57°C 60s, 72°C 45s ；72°C 5min. 根據內參Actin的擴增情況確定PCR的循環數，調整cDNA模板的加入量。4. 1 %瓊脂糖凝膠電泳。結果見圖1。實施例2、小麥脫水素基因啟動子TaDHNP的克隆 2. 1小麥基因組DNA的提取
1.采用CTAB法提取小麥基因組DNA。步驟為(1)取小麥根系約0.5g在液氮中磨碎，置于1. 5ml離心管中，加入700μ1提取緩沖液 (100 mmol/L Tris_HCl，50 mmol/L EDTA-Na2, IOOmmo 1/L NaCl，1. 5%CTAB，2%巰基乙醇)，65 0C水浴中溫育30-60min，其間顛倒混勻3_4次；
(2)取出離心管，向每管中加入700μ1苯酚氯仿異戊醇(25: :1)溶液，混勻IOmin ；
(3)IOOOOrpm 離心 IOmin ；
(4)用槍頭(剪去前端1/3)緩緩抽取上清液至另一1. 5ml離心管中；
(5)加入等體積的氯仿異戊醇(24:1)重復上述抽提過程。緩緩取出上清液；
(6)加入0.6倍體積的異丙醇沉淀，輕輕混勻，靜置一段時間；
(7)用200μ 1槍頭挑出DNA沉淀；
(8)70%的乙醇沖洗2 3次，DNA在室溫干燥10分鐘；
(9)加入500μ1去離子水，在40C溶解。
2.小麥基因組DNA的純化
(1)在溶解的DNA 中加入 1-5P1RNA 酶(10mg/ml)，37 0C 保溫 Ih ；
(2)加入等體積的苯酚氯仿異戊醇(25 M 1)溶液，混勻；
(3)40C IOOOOrpm 離心 IOmin ；
(4)取上清液到另一離心管中；
(5)加入等體積氯仿異戊醇(24:1)重復上述抽提過程；
(6)取上清液移到一新的1.5ml離心管；
(7)加入1/10體積的3mol/LNaAc，混勻后加入2倍體積的冷無水乙醇，輕輕混勻；
(8)室溫靜置10分鐘，用牙簽挑出DNA沉淀；
(9)用70%的乙醇沖洗2 3次，室溫放置至無酒精味；
(10)DNA加入ΙΟΟμΙ去離子水溶解，用紫外分光光度計測定DNA濃度，并通過瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質量，樣品在_20°C保存。最后根據DNA濃度，將一部分稀釋，4 0C保存待2. 2小麥脫水素基因啟動子(7 / ^)的克隆
采用GenomeWalker的方法(Clontech，CA，USA)克隆小麥脫水素基因啟動子TaDHNP，具體過程按說明書進行。基因特異性的引物序列為 Dspl: 5，-TTGGTCGCCTGGCCGTGCTGCTGCTGT-3， Dsp2 5，-GCACAGGTGTTGATCTTGGTTGTCTTC-3， 2.3 PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳檢測及回收
PCR擴增產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測發現擴增出一條約21Λ的條帶(圖2)，對擴增條帶采用Tiangen公司的瓊脂糖膠回收試劑盒，步驟按說明書進行。2. 4 PCR 產物與 pGEM-T (Promega)載體連接在PCR管中依次加入下列組分
回收的PCR產物7μ1
10 X Τ4連接酶緩沖液 μ
pGEM-T 載體(50ng/ μ 1) μ
T4DNA 連接酶(3U/ μ 1) (Takara) μ dH20 至 10μ1于16°C水浴連接過夜。2. 5回收片段的克隆與測序 1.大腸桿菌感受態細胞的制備
(1)從-80°C冰箱中拿出保存于甘油中的五cWi Dffia菌株(購自天為時代生物公司)， 放在冰上緩慢解凍。(2)在超凈工作臺上用接種環劃線(LB固體培養基，不含Amp)。(3)將平板于37°C恒溫培養箱倒置培養過夜。(4)挑取平板上的單菌落接種于含5ml LB液體培養基的試管中，37°C振蕩培養 14 — 16小時。(5)取0. 5ml菌液接種于含50ml LB液體培養基的250ml的三角瓶中，37°C振蕩 (260rpm)培養 2 — 3 小時(0D260=0. 5)。(6)將培養的菌液置冰上1小時。(7) 4°C離心 4 分鐘(4000rpm)，去上清。(8)用25ml冰預冷的溶液A將菌體輕輕懸浮起來，再在冰上放置40 — 45分鐘。(9)重復步驟(8)。(10)用2. 5ml冰預冷的溶液B將菌體輕輕懸浮起來，然后將菌液分裝到1. 5ml離心管中(每管ΙΟΟμΙ)，放入_80°C冰箱備用。2.連接產物的轉化
(1)從_80°C冰箱中取出1管(ΙΟΟμΙ)感受態細胞，置冰上緩緩解凍30分鐘。(2)超凈工作臺上向管中加入5μ1連接反應物，輕輕搖勻，置冰上30分鐘。
(3) 42 V水浴熱激90秒，迅速置冰上3 — 5分鐘。(4)在超凈工作臺上向離心管中加入Iml LB液體培養基(不含Amp)，混勻后37°C 振蕩培養1小時(260rpm)。(5)室溫下5000rpm離心6分鐘，棄掉900μ1上清液，將剩余ΙΟΟμΙ上清液重新懸浮菌體，加入40μ1的X-gal和4μ1的IPTG，混勻，然后用涂布器將其均勻涂到準備的平板上，放置30分鐘。(6)倒置平板于37°C恒溫培養箱中過夜，待出現明顯單菌落時拿出。(7)放入4°C冰箱數小時，使藍白斑顏色分明。(8)用滅菌的牙簽挑取白斑于裝有10ml LB液體培養基(含6(^g/mlAmp)的試管中，37°C搖菌過夜。3.重組質粒的PCR鑒定及測序
本實驗所用的PGEM-T載體的克隆位點的上游有T7啟動子，下游有SP6啟動子，所以可以用這兩個啟動子序列做引物對插入片段進行擴增，對重組質粒進行鑒定，鑒定程序如下
(1)超凈工作臺上用移液器取所搖的菌液50μ1于1. 5ml離心管，再向離心管中加入 50μ1超純水。(2) 100°C煮沸變性10分鐘后，置于冰上。(3斤0 擴增總體積2(^1 包括質粒模板 l(^l，10Xbuffer 2μ1 (含 Mgcl2)，dNTP 10mmol/L，T7和SP6引物各20ngAa，lU Taq酶。反應條件為94 °C，5分鐘；30個循環94°C, Imin ；56°C, Imin ；72°C，2min ；72°C延伸 5min。PCR擴增產物用瓊脂糖電泳檢測，取陽性克隆的菌液送公司進行測序。測序結果表明PCR擴增獲得的片段具有序列表中序列1的核苷酸序列。對序列進行序列比對，結果表明該序列的3'端含有擴增啟動子時所用的基因特異性引物，且3'端與本實驗室克隆的小麥脫水素基因TaDHN卿端序列完全相同，證實上述所克隆的序列片段為TaDHN基因的啟動子序列。利用PlantCARE數據庫對所得啟動子序列進行順式作用元件預測，發現啟動子區含有ABRE、MBS等響應逆境的順式作用元件(圖3)。這與所克隆的TaDHNP啟動子受鹽、冷等脅迫誘導表達是一致的。實施例3、小麥脫水素基因啟動子表達載體(pCAM1391Z/TaDHNP)的構建
根據啟動子TaDHNP序列設計分別含有Hindi 11和EcoRl的啟動子上下游引物， 引物名稱及序列為 Dhy2pl 5 ‘ -CCCAAGCTTCCCGGGCTGGTAAAAACGAAG-3 ‘ (.HincIllO Dhy2p2 5' -CGGAATTCCTTGCAGACTTGCACAGGTGTTG-3‘ (McoKl)。以含有啟動子序列的質粒為模板進行PCR擴增，PCR擴增產物經電泳、回收后與pGEM-T easy載體連接，轉化大腸桿菌，提取質粒。用Hindlll和分別對pCAM1391Z載體和含有7 / °啟動子的pGEM_T easy載體進行雙酶切，分別回收PCAM1391Z載體大片段和7 / °啟動子小片段，用T4 DNA 連接酶連接后轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞，提取重組質粒后進行酶切鑒定重組子，酶切產物經電泳檢測后可見合適大小的目的啟動子條帶和切開的載體條帶，表明所構建的植物表達載體正確(圖4)。3. 1 質粒 pCAM1391Z 載體和 pGEM-T easy 載體的 Hindm 和 EcoRY 雙酶切堿裂解法提取PCAM1391Z空載體和pGEM-T easy質粒，各取10 μ g酶切，酶切體系如
下
Hind III1 μ 1
EcoRl1 μ 1
PCAM1391Z 載體 / pGEM-T easy 質粒 4 μ 1 IOXBuffer M1 μ 1
ddH20 To20 μ 1
于37°C恒溫水浴鍋酶切3小時以上。雙酶切后以IXTAE為電泳緩沖液，將酶切產物進行0. 8%瓊脂糖凝膠電泳。在紫外透射儀下用潔凈刀片切下中PCAM1391Z載體的大片段和pGEM-T中大約1. 6 1Λ的目的基因條帶，回收該條帶。3. 2酶切產物的連接
經酶切的PCAM1391Z載體載體片段和pGEM-T easy雙酶切回收片段(約1. 61Λ)以摩爾比1:4的比例進行16°C連接過夜。3. 3連接產物的轉化
連接產物熱激法轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞，轉化菌在含Kan 50 μ g/ml的LB固體平板上37°C培養16小時左右。3. 4重組子的鑒定質粒酶切鑒定
提取陽性克隆質粒，對質粒進行歷·ζ /ΠΙ和雙酶切，酶切體系同上。0. 8%瓊脂糖凝膠電泳檢測被切開的啟動子目的條帶和切開的載體片段，兩條帶大小正確，表明載體構建正確(圖4)。實施例4、農桿菌感受態的制備與轉化
4.1農桿菌GV3101感受態的制備
(1)從YEP平板(含50yg/ml利福平)上挑取根癌農桿菌單菌落，接種于含50 μ g/ml 利福平的YEP液體培養基中，200rpm/minJ8°C培養過夜。(2)取aiil過夜培養液接種于50ml含相同抗生素的YEP液體培養基中在相同條件
下培養至OD6tltl達0. 5。(3)菌液冰浴 3Omin, 4°C，5OOOrpm 離心 lOmin，收集菌體。(4)將菌體重懸于冰浴的IOml 0. 15mol/L的NaCl中，離心收集菌體。(5)再懸浮于Iml 20mmol/L冰預冷的CaC12溶液中，以200 μ 1/管將菌液分裝在 1. 5ml
Eppendorf管中，置液氮中速凍lmin，_70°C保存備用。4. 2凍融法轉化根癌農桿菌GV3101
(1)在室溫下融化農桿菌感受態細胞，加入Iyg表達載體質粒DNA，混勻后冰浴 30mino(2)置液氮速凍lmin，迅速移至37°C保溫:3min。(3)加入無抗生素的YEP 800μ震蕩培養3hr。(4) 7000rpm離心30s收集菌體，涂于含50 μ g/ml利福平、50 μ g/ml Kan的 YEP平板上，28°C倒置暗培養2-3天。4.3菌體PCR鑒定及電泳
菌體PCR方法及程序及電泳同1.4，根據擴增片段長度調整PCR72°C延伸時間aiiin。實施例5、啟動子的功能驗證一擬南芥轉化及轉基因株系的鑒定
5.1擬南芥種植
將野生型擬南芥種子用7. 5%次氯酸鈉溶液(包括7. 5%次氯酸鈉和0. 01% Triton-X 100)消毒15分鐘，然后用無菌水漂洗5-6次，點播于MS平板上，于4° C春化2_3天。 然后移植到營養缽中(營養土與蛭石按等比例混合)，23° C培養，16/8 h光周期，光強 30-40ymolm-2 s-1 ；待植株開花后，剪去其主枝頂端，促進側枝發展。在剪枝后的4_6天內，進行農桿菌轉化。5. 2農桿菌的制備
分別接種含有pCAM1391Z/TaDHNP載體的GV3101農桿菌于IOmLYEB培養基(100 mg/L 利福平，25 mg/L慶大和100 mg/L卡那)中，28°C培養振蕩過夜。然含后轉接種于500 ml 含相同抗生素的YEB培養基中擴大培養。5 OOO rpm離心15 min沉淀菌體。將農桿菌重懸于200 ml轉化緩沖液中(MS大量元素，3%蔗糖，0. 03%Silwet-77)，0D600 0.8-1。5. 3擬南芥轉化
把200 ml菌液倒入淺盤中。將修剪好的擬南芥倒扣并使所有花序浸入懸浮菌液中， 輕輕攪動沾花30 sec-1 min。取出花盆側放于托盤中，用保鮮袋包裹以保濕。將托盤置暗處培養M h。然后取出營養缽并直立放置，恢復光照，繼續培養植株至成熟。5.4陽性植株的篩選TO代種子用7. 5%次氯酸鈉溶液(包括7. 5%次氯酸鈉和0.01% Triton-X 100)消毒后， 點播在MS選擇培養板(30 mg/L潮霉素)上。于4°C下春化2-3天。移入培養室中培養。 大約10天左右，挑選潮霉素抗性植株(長出真葉1-2對，根伸長至培養基中)并移栽到營養缽中。培養直至種子成熟。同樣方法篩選Tl代種子得到T2代植株。5. 5轉基因擬南芥的PCR鑒定擬南芥基因組DNA的提取同2. 1
PCR體系、程序及電泳條件同4. 3。檢測結果表明在轉基因擬南芥株系中可見到合適大小的外源基因條帶(圖5)。表明外源啟動子已轉入擬南芥植株。6. GUS 染色
(1 )取材收集生長1-2周的T2代整株幼苗，迅速放入裝有預冷的90%丙酮中試管中。 室溫脫色30 min。(2 )將材料轉入預冷的不含X-gluc的染色緩沖液(0.2% Triton X-100,2 mmol/ L亞鐵氰化鉀，2mmol/L鐵氰化鉀，50 μ mol/L磷酸鈉緩沖液，pH7. 2)中洗滌。(3)染色去除洗滌染色緩沖液，加入含X-gluc的染色緩沖液(0.2% Triton X-100,2 mmol/L 亞鐵氰化鉀，2 mmol/L 鐵氰化鉀，2 mmol/L X-gluc, 50 μ mol/L 磷酸鈉緩沖液，PH7. 2)，并將樣品放到冰上真空抽濾15-20 min，直至所有材料都浸沒在溶液中。(4)將材料轉移到37°C染色過夜或染色兩天。(5)脫水等組織出現藍色時，去除染色液，用20%，35%，50%的乙醇梯度脫水，每步 30 min。(6)固定將材料放在FAA(50%乙醇，10%冰乙酸，5%甲醛)中于室溫固定30 min。(7)去除FAA，加入70%乙醇。(8)直接在顯微鏡下觀察材料并照相。染色結果表明正常培養條件下，TaDHNP 啟動子不能啟動外源基因表達，轉基因擬南芥株系未見有GUS染色(圖5A);在100 mM NaCl 處理和4°C處理48h，TaDHNP啟動子被誘導啟動外源基因表達，⑶S染色成陽性(圖5 B、C、 D、E)。
1權利要求
1.一種小麥脫水素基因的啟動子TaDHNP其特征在于(1)所述啟動子的核苷酸序列如SEQID No. 1所示；(2)在高嚴謹條件下可與序列表中序列SEQID No. 1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
2.含有權利要求1所述小麥脫水素基因的啟動子的植物表達載體pCAM1391Z/TaDHNP。
3.權利要求1所述小麥脫水素基因的啟動子在培育耐鹽、耐冷植物中的應用。
4.如權利要求3所述的小麥脫水素基因的啟動子在培育耐鹽、耐冷植物中的應用，其特征在于所述植物為小麥或擬南芥。
5.權利要求2所述小麥脫水素基因的啟動子的植物表達載體在培育耐鹽、耐冷植物中的應用。
6.如權利要求5所述的小麥脫水素基因的啟動子的植物表達載體在培育耐鹽、耐冷植物中的應用，其特征在于所述植物為小麥或擬南芥。
全文摘要
本發明公開了一種小麥脫水素基因的啟動子TaDHNP及其應用，其目的是提供一種在單子葉植物中能被非生物脅迫(鹽/冷)誘導表達的啟動子，所述啟動子的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。該啟動子受鹽、冷脅迫誘導表達，可用該啟動子與一些耐鹽、耐冷基因融合，構建誘導表達載體，對植物特別是小麥耐鹽、耐冷基因工程育種具有重要的意義。
文檔編號C12N15/113GK102277354SQ201110177709
公開日2011年12月14日 申請日期2011年6月29日 優先權日2011年6月29日
發明者夏光敏, 秦余香 申請人:山東大學, 濟南大學