控制花粉雄性不育鈣波動的分子開關及其應用的制作方法

專利名稱：控制花粉雄性不育鈣波動的分子開關及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域，具體地涉及控制花粉雄性不育鈣波動的分子開關及其應用。
背景技術：
花粉的正常萌發生長是精子細胞順利到達胚囊、并實現受精作用的前提，并且對高等植物有性生殖起至關重要的作用。花粉管的生長涉及一系列復雜的過程，各種礦質元素在這其中起著重要的作用，大量研究表明花粉的離體萌發和花粉管生長需要適當的鈣離子濃度。Ca2+可通過多種途徑影響花粉萌發和花粉管的生長，其中涉及細胞骨架的組裝、分泌小泡的運輸、融合花粉管頂端脈沖式生長以及花粉管生長方向調控等各個方面。那么在這些現象的背后究竟存在什么樣的分子機制來做到植物極性生長的精確調控。Ca2+作為植物細胞中最重要的第二信使，參與植物的極性生長發育以及對逆境信號的轉導。在非生物逆境條件下，植物細胞質內的鈣離子在時間、空間及濃度上會出現特異性變化，即誘發產生鈣信號。鈣信號再通過其下游的鈣結合蛋白進行感受和轉導，進而在細胞內引起一系列的生物化學反應來調節植物生長或者適應或抵制各種逆境脅迫。目前在植物細胞中發現Ca27CDH(、Ca27CaM和Ca2+/CBL 3類鈣信號系統。其中CaM是植物細胞中最重要的一類鈣信號傳感元件，含有150個左右的氨基酸殘基，并且不同鈣調素之間結構非常保守。每個鈣調素中都含有4個長度為12個氨基酸殘基的EF手型結構，它們各與一個鈣離子結合，引起鈣調素構像發生變化從而激活鈣調素行使信號轉導功能。鈣調素作為一類重要的信號傳遞信使主要是通過與CaM結合蛋白(CaMBP)結合來調節細胞內的一些生理生化反應。我們通過研究Ca2+、鈣調蛋白、通道蛋白來說明介紹一種具有普遍生物學意義的鈣信號波動控制與解碼的分子開關。

發明內容
本發明的目的是提供一種Ca27Mg2+通道分子CAC-I。本發明的再一目的是提供上述Ca27Mg2+通道分子CAC-I的抑制劑CAC-2。本發明的另一目的是提供一種與上述Ca27Mg2+通道分子CAC-I和抑制劑CAC-2相互作用的鈣結合蛋白CMA。本發明的另一目的是提供鈣信號開關分子。根據本發明的Ca27Mg2+通道分子CAC-1，其氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示；其核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。根據本發明的所述Ca2+/Mg2+通道分子CAC-I的抑制劑CAC-2，其氨基酸序列如SEQ ID No. 3所示；其核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示。根據本發明的鈣結合蛋白CMA，其氨基酸序列如SEQ ID No. 5所示；其核苷酸序列如 SEQ ID No. 6 所示。根據本發明的鈣信號開關分子，包含上述Ca27Mg2+通道分子CAC-l、Ca27Mg2+通道分子CAC-I的抑制劑CAC-2、以及鈣結合蛋白CMA，其中，CAC-2抑制Ca2+/Mg2+通道分子CAC-I 的鈣通道活性，CMA與CAC-2和CAC-I同時相互作用，解除了 CAC-2對CAC-I鈣離子轉運活性的抑制。本發明還提供了上述鈣信號開關分子調節植物體內鈣流波動的應用。本發明還提供了上述鈣信號開關分子用于調控植物雄性不育的應用。根據本發明的具體實施例，以調節植物花粉管的極性生長的分子開關為例，進行詳細描述，兩個同源基因編碼的蛋白互相調控與第三個鈣結合蛋白組成精巧的鈣信號開關分子，共同調節花粉管鈣離子通道的活性和鈣離子信號的波動與解碼，從而精確控制植物花粉管的延伸或縮短，以調控植物的雄性不育，這不僅有重大的應用價值，更有普遍的生物學意義。發明的發明人經研究發現基因CAC-I是植物花粉管中的鈣離子通道，并且同源體 CAC-2能抑制CAC-I的活性，但是在CMA存在的情況下能解除這種抑制，具體地1、CAC-I具有內向整流的鈣離子和鎂離子通道特性；2、同源體CAC-2能夠與CAC-I相互作用并且抑制CAC-I鈣通道的活性；3、根據本發明的鈣信號開關分子的各個元件的相互作用有兩種方式CAC_2與 CAC-I通過C-端直接作用，從而抑制CAC-I鈣通道的活性；CAC-2通過CMA與CAC-I作用；4、CMA與CAC-2和CAC-I同時相互作用，解除了 CAC-I對CAC-I鈣離子轉運活性的抑制；5、鈣離子內流可以與CMA結合，反饋調節CAC-I與CAC-2的親和性，而導致鈣離子內流的波動；6、兩個同源基因編碼的蛋白CAC-I、CAC_2互相調控與第三個鈣結合蛋白CMA組成精巧的開關分子，由此控制的花粉管延伸或縮短，精確調控植物雄性不育；7、上述鈣信號波動機制及解碼，同樣存在于植物根毛的延伸、保衛細胞的發育、病理的反應或其他的生理過程，具有普遍的生物學意義及其應用。


圖1顯示了 CAC-I和CAC-2的離子轉運特性；圖2顯示CAC-2抑制了 CAC-I的鈣離子轉運活性，CMA解除了這種抑制作用；圖3顯示了 CAC-1、CAC-2和CMA之間的相互作用與作用特異位點。圖4顯示CAC-I與CAC-2相互作用維持花粉管的延長，CMA解除CAC-2抑制CAC-I 的作用，抑制花粉管延長；
具體實施例方式實施例1、CAC-1、CAC-2、CMA基因的克隆1、擬南芥的培養土壤中培養擬南芥時，將吸水飽和并經4°C處理2-3天后的種子均勻地播種于按照1/3比例混合蛭石的營養土上，黑暗避光萌芽生長，待長出真葉后移至正常光照下培養。 生長期間澆水保持土壤濕潤。培養皿中無菌培養擬南芥時，要先對種子進行表面消毒。將適量干燥的擬南芥種子置于1.5mL小離心管中，先用適量的無水乙醇消毒30sec，再用ImL 10-15%的次氯酸鈉溶液浸泡5-lOmin，然后用無菌水漂洗3_5次，置于4°C同步化處理2 3天后，均勻地點種于1/2MS培養基上。培養條件溫度20_23°C，光照強度80-200 μ mol n^sec—1，光周期為16h光照/8h黑暗交替或者連續光照，濕度約為70%。2、總RNA的提取3、總RNA逆轉錄1)按hvitrogen Super ScripIII操作說明書進行，第一步反應體系為dNTP 混和物(各 IOmM)Ιμ OligodT-接頭引物 Ιμ
模板RNA l-5ug (根據分光光度儀測的濃度計算需要的體積數)
水_
13.0μ1加熱到65°C，5min。2)冰上放置至少Imin3)第二步反應體系為
5XFirst-strand buffer4μ1
0. IM DTTΙμ
RNase InhibitorIul
Super ScriptIIIIul
第一步反應產物_Iul_
20.0μ1反應條件為50°C90min ；70 °C 15min。4、CAC-I基因全長的獲得 if 弓I · Primerl 5-CGGGATCCATGAATAAAATCCGGTCT-3, Primer2 5-GGAATTCTTAAACGTCTTCTTTATC-3，將上述反轉錄產物稀釋50倍為摸板，反應體系及條件如下
RT模板 10XPCR緩沖 dNTP
TaKaRa ExTaq Primer 1 Primer 2
Ιμ 5μ1 5μ1 Ιμ 2ul 2ul
H2O
34ul
50μ1
反應參數
94 °C 94 °C 55 °C
72 °C
10 min 30sec 40sec 2 min
IOmin
1個循環
33個循環
1個循環
72 °C5、PCR產物的回收將PCR產物在1 %瓊脂糖上電泳，紫外燈下切取目的條帶并切碎膠塊后，按OMEGA Gel Extraction Kit 操作(由 OMEGA 生產)。6、PCR產物的連接和轉化取純化后的PCR產物各1 μ 1，與Promega公司的pGEM -T easy vector連接(按照其產品說明書操作)。將連接產物熱擊轉化入E. coli DH5 α感受態細胞，挑選陽性克隆測序。CAC-I基因的測序結果顯示，該基因全長^07bp，具有2121bp的開放閱讀框，編碼 707個氨基酸的蛋白質。CAC-I基因具有以下開放閱讀框核苷酸序列ATGAATAAAATCCGGTCTCTCCGCTGCCTCCTCCCGGAGACCATAACCTCCGCCTCCACCGCCGCCTCAAATCGAGGATCTGACGGTAGCCAATTCAGCGTCCTATGGCGGCATCAGATCCTGGACCCGGACAGCAACATCGTCACCTATTGGAACCACGTCTTTCTCATTACCTCAATCCTCGCTCTCTTCCTCGATCCTTTCTATTTCTACGTCCCTTACGTCGGTGGTCCGGCGTGTCTCTCCATCGACATCAGCCTCGCCGCTACTGTCACTTTCTTCCGTACAGTCGCCGATATCTTCCACCTCTTGCACATTTTCATGAAATTCAGAACTGCGTTCGTCGCGAGGAGTTCTCGTGTTTTTGGTCGCGGTGAGCTTGTTATGGATTCTAGAGAGATTGCTATGAGATACTTGAAGACAGATTTCCTCATTGATGTCGCCGCCATGCTTCCCCTTCCTCAGCTTGTTATTTGGCTAGTAATTCCAGCGGCCACAAATGGAACTGCTAATCATGCCAATAGCACTCTCGCACTTATCGTTCTTGTTCAATACATTCCAAGATCATTCATCATATTCCCACTCAACCAAAGGATTATC
AAAACAACCGGGTTTATCGCCAAGACTGCTTGGGCAGGAGCTGCATACAACCTCCTATTGTACATCCTTGCTAGTCACGTGTTAGGAGCAATGTGGTATCTGTCATCAATCGGGCGGCAGTTTTCGTGCTGGTCCAACGTATGCAAGAAAGACAACGCTTT
GAGAGTTTTGGATTGTCTTCCTAGCTTCTTGGATTGCAAGAGTTTAGAACAACCAGAGCGCCAGTATTGGCAGAACGTTACTCAGGTCCTTTCTCATTGTGATGCTACAAGCAGCACTACCAATTTCAAATTCGGAATGTTTGCTGAAGCCTTTACCACTCAAGTTGCTACAACAGATTTTGTGTCCAAGTACTTGTATTGTCTTTGGTGGGGTTTAAGAAATCTAAGTTCTTATGGACAGAATATAACCACAAGTGTATACCTTGGCGAGACCTTGTTCTGTATAACAATTTGTATTTTTGGGTTGATTCTCTTCACACTCCTGATTGGTAACATGCAATCTTCTCTGCAATCGATGTCAGTAAGAGTTGAGGAATGGAGAGTTAAGAGAAGAGACACTGAAGAATGGATGAGACATCGTCAACTACCTCCAGAGCTTCAAGAACGTGTCCGAAGATTTGTCCAATACAAATGGCTTGCAACCAGAGGTGTCGATGAAGAATCAATCCTCCATTCATTACCTACAGATTTACGCCGTGAAA
TCCAACGTCATCTTTGTCTCTCCCTTGTTCGCCGGGTCCCGTTCTTCTCTCAAATGGATGATCAACTTCTTGATGCTATATGCGGATGCCTTGTCTCATCTTTAAGCACGGCCGGGACATACATATTCCGTGAAGGTGATCCGGTGAATGAGATGCTATTTGTGATCCGAGGACAAATAGAGAGCTCAACAACAAATGGAGGAAGATCTGGTTTCTTCAACTCCACTACTCTACGACCTGGCGATTTCTGTGGGGAAGAACTTCTTACATGGGCCTTAATGCCAAACTCTACACTCAATCTTCCGTCTTCAACACGAAGCGTCCGTGCCCTCTCTGAAGTAGAAGCCTTTGCATTAAGCGCAGAGGATCTTAAGTTTGTTGCTCATCAGTTCAAACGTCTTCAAAGCAAAAAGCTTCAACACGCTTTCAGGTACTACTCACATCAATGGAGAGCATGGGGAGCATGTTTTGTCCAATCTGCATGGAGAAGATACAAGCGAAGAAAGCTTGCGAAAGAGCTCAGCCTTCACGAGAGTAGCGGATACTATTACCCGGATGAAACAGGTTACAATGAAGAAGACGAAGAAACTAGAGAGTATTACTATGGAAGTGACGAGGAAGGCGGATCAATGGACAACACAAATCTGGGAGCAACGATCTTAGCATCTAAATTTGCGGCGAACACGAGAAGAGGAACAAATCAAAAGGCTTCAAGTAGTAGTACTGGTAAGAAAGATGGATCTTCCACCAGTTTGAAGATGCCTCAACTATTCAAACCAGATGAGCCTGATTTCTCTATAGATAAAGAAGACGTTTAA2121其編碼的蛋白質的氨基酸序列為MNKIRSLRCLLPETITSASTAASNRGSDGSQFSVLWRHQILDPDSNIVTYWNHVFLITSILALFLDPFY FYVPYVGGPACLSIDISLAATVTFFRTVADIFHLLHIFMKFRTAFVARSSRVFGRGELVMDSREIAMRYLKTDFLID VAAMLPLPQLVIWLVIPAATNGTANHANSTLALIVLVQYIPRSFIIFPLNQR11KTTGFIAKTAWAGAAYNLLLYIL ASHVLGAMWYLSSIGRQFSCWSNVCKKDNALRVLDCLPSFLDCKSLEQPERQYWQNVTQVLSHCDATSSTTNFKFGM FAEAFTTQVATTDFVSKYLYCLWWGLRNLSSYGQNITTSVYLGETLFCITICIFGLILFTLLIG匪QSSLQSMSVRV EEWRVKRRDTEEWMRHRQLPPELQERVRRFVQYKWLATRGVDEESILHSLPTDLRREIQRHLCLSLVRRVPFFSQMD DQLLDAICGCLVSSLSTAGTYIFREGDPVNEMLFVIRGQIESSTTNGGRSGFFNSTTLRP⑶FCGEELLTWALMPNS TLNLPSSTRSVRALSEVEAFALSAEDLKFVAHQFKRLQSKKLQHAFRYYSHQWRAWGACFVQSAWRRYKRRKLAKEL SLHESSGYYYPDETGYNEEDEETREYYYGSDEEGGSMDNTNLGATILASKFAANTRRGTNQKASSSSTGKKDGSSTS
7LKMPQLFKPDEPDFSIDKEDV7、CAC-2基因全長的獲得設計5，端引物 Primerl :5-CGGGATCCATGTCATCTAATGCTACG_3，3，端引物 Primer2 5-GCTCTAGATTAGTTCAAGTCATCTGT-3，將上述反轉錄產物稀釋50倍為摸板，反應體系及條件如下
RT模板Ιμ
10XPCR 緩沖5μ1
dNTP5μ1
TaKaRa ExTaq1 μ
Primer 1 2ul Primer 2 2ul H2O_34ul
50μ1反應參數
94 0C10 min1個循環94 0C30sec55 0C40sec33個循環72 0C2 minlOsec72 0CIOmin1個循環CAC-2基因的測序結果顯示，該基因全長^94bp，具有2262bp的開放閱讀框，編碼 753個氨基酸的蛋白質。CAC-2基因具有以下開放閱讀框核苷酸序列ATGTACAAATCTCAATATATAAGTGGCCATAGAGAAAAATTCGTAAGATTAGATGATACAGATTCGAGGGTTTCAATGTCATCTAATGCTACGGGAATGAAGAAGCGATCATGTTTTGGATTGTTTAACGTAACTAGTCGTGGAGGAGGAAAGACAAAGAACACATCAAAATCATTTCGAGAAGGTGTTAAAATCGGATCAGAGGGTCTAAAAACGATCGGAAAATCATTCACATCAGGTGTAACAAGAGCTGTTTTCCCTGAAGATCTAAGAGTCTCCGAGAAGAAAATCTTTGATCCTCAAGACAAAACACTTTTATTATGGAACAGAATGTTTGTTATCTCTTGCATTCTTGCTGTCTCTGTTGATCCTCTGTTCTTCTATCTCCCTATTGTCGATAACTCAAAGAACTGCATTGGGATTGACTCTAAATTAGCTGTGACAACTACTACTCTAAGAACGATCATCGATGTTTTTTATCTTACACGAATGGCTCTTCAGTTCCGTACCGCTTACATTGCTCCTTCTTCTCGTGTGTTTGGAAGAGGTGAGCTTGTGATCGACCCTGCAAAGATCGCTGAACGGTATTTGACTCGTTATTTCATTGTCGATTTCCTCGCGGTTCTTCCTTTACCTCAGATTGCTGTGTGGAAGTTTCTTCACGGATCTAAAGGAACAGATGTATTACCAACAAAACAGGCGCTATTACACATTGTCATCACACAGTACATACCAAGATTCGTTAGGTTTATTCCATTAACT
TCAGAGCTCAAGAAAACAGCAGGAGCTTTCGCTGAAGGTGCTTGGGCTGGTGCTGCTTATTACCTCCTCTGGTATATGCTTGCAAGTCACATAACTGGAGCGTTCTGGTACATGTTGTCAGTGGAACGTAACGATACATGCTTGAGATCCGCTTGTAAAGTCCAGCCTGATCCCAAGGTCTGTGTTCAGATTCTTTATTGTGGCAGCAAATTAATGAGCAGTCGCGAAACCGACTGGATCAAATCAGTCCCTGATCTTTTTAAGAACAATTGTTCTGCTAAAAGCGATGAGTCTAAATTCAACTACGGGATCTATAGCCAGGCTGTGTCTTCCGGTATTGTATCTTCGACAACGTTTTTCTCCAAGTTTTGTTATTGTCTATGGTGGGGTCTCCAAAATCTCAGCACGTTAGGTCAAGGGCTGCAAACAAGTACATATCCAGGAGAAGTTTTGTTTTCAATTGCAATTGCTGTAGCTGGACTTCTTTTGTTTGCTCTTCTCATTGGGAATATGCAAACTTATCTTCAGTCACTTACGGTTCGCTTAGAGGAAATGAGGATTAAAAGACGTGATTCCGAACAGTGGATGCATCACAG GTCACTTCCACAAAACCTGAGGGAACGAGTCAGACGTTATGATCAATACAAATGGTTGGAAACAAGAGGAGTCGACGAAGAAAACATAGTCCAGAGTTTACCAAAAGATCTTAGAAGAGACATCAAACGCCATCTCTGTCTAAATTTAGTTCGCAGGGTTCCTCTGTTTGCTAATATGGATGAGAGATTACTAGACGCAATATGTGAGAGACTAAAGCCAAGTCTATACACAGAGAGCACTTACATAGTGCGAGAAGGAGACCCGGTTAACGAAATGCTCTTCATAATCCGAGGCCGGTTAGAGAGTGTAACAACAGATGGTGGAAGAAGCGGTTTCTTTAACAGAGGTTTATTGAAAGAAGGTGACTTTTGTGGTGAAGAGCTTCTGACTTGGGCACTTGACCCTAAAGCAGGCTCAAACTTACCTTCTTCCACACGAACAGTGAAGGCTCTAACTGAAGTAGAGGCTTTCGCTTTAGAAGCGGAAGAGCTCAAGTTTGTGGCTAGTCAGTTCAGGCGTCTTCACAGTCGTCAGGTTCAACAAACTTTCAGGTTTTACTCTCAACAATGGAGGACTTGGGCTGCTTGTTTCATCCAAGCCGCTTGGCGTAGACATTTAAGAAGGAAAATCGCAGAGCTTAGACGTAAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAATGGATTATGAAGATGATGAATATTATGATGATAATATGGGTGGTATGGTTACAAGGAGTGATAGTTCTGTTGGATCAAGTTCTACATTACGTTCCACGGTATTTGCATCAAGATTTGCTGCTAACGCGCTTAAGGGTCATAAACTAAGGGTCACCGAGAGTTCAAAGAGTTTAATGAATTTAACAAAGCCATCAGAACCTGACTTTGAGGCTCTTGATACAGATGACTTGAACTAA其編碼的蛋白質的氨基酸序列為MYKSQYISGHREKFVRLDDTDSRVSMSSNATGMKKRSCFGLFNVTSRGGGKTKNTSKSFREGVKIGSE GLKTIGKSFTSGVTRAVFPEDLRVSEKKIFDPQDKTLLLWNRMFVISCILAVSVDPLFFYLPIVDNSKNCIGIDSK LAVTTTTLRTIIDVFYLTRMALQFRTAYIAP S SRVFGRGELVIDPAKIAERYLTRYFIVDFLAVLPLPQIAVWKF LHGSKGTDVLPTKQALLHIVITQYIPRFVRFIPLTSELKKTAGAFAEGAWAGAAYYLLWYMLASHITGAFWYMLSVE RNDTCLRSACKVQPDPKVCVQILYCGSKLMSSRETDWIKSVPDLFKNNCSAKSDESKFNYGIYSQAVSSGIVSSTTF FSKFCYCLWWGLQNLSTLGQGLQTSTYPGEVLFSIAIAVAGLLLFALLIG匪QTYLQSLTVRLEEMRIKRRDSEQWM HHRSLPQNLRERVRRYDQYKffLETRGVDEENIVQ SLPKDLRRDIKRHLCLNLVRRVPLFANMDERLLDAICERLKP SLYTESTYIVRE⑶PVNEMLFIIRGRLESVTTDGGRSGFFNRGLLKE⑶FCGEELLTWALDPKAGSNLPSSTRTVKA LTEVEAFALEAEELKFVASQFRRLHSRQVQQTFRFYSQQWRTWAACFIQAAWRRHLRRKIAELRRKEEEEEEMDYED DEYYDDNMGGMVTRSDSSVGSSSTLRSTVFASRFAANALKGHKLRVTESSKSLMNLTKPSEPDFEALDTDDLN
8、CMA基因全長的獲得設計5，端引物 Primerl :5_ATGTCAGAAA CATCAAAGTC AGAGTC_3，3，端引物 Primer2 :5-CTATGAGTGGCTATCTTGTCCTGAACCTTG_3，將上述反轉錄產物稀釋 50 倍為摸板，反應體系及條件如下
RT模板 10XPCR緩沖 dNTP
TaKaRa ExTaq Primer 1 Primer 2
Ιμ 5μ1 5μ1 Ιμ 2ul 2ul
H2O
34ul反應參數
94 °C 94 °C 55 °C
72 °C 72 °C
10 min
30sec
40sec
2 min IOmin
50μ1
1個循環
33個循環
1個循環CMA基因的測序結果顯示，該基因全長1165bp，具有486bp的開放閱讀框，編碼162 個氨基酸的蛋白質。CMA基因具有以下開放閱讀框核苷酸序列ATGGCGGATCAGCTCACAGACGATCAGATCTCAGAATTCAAGGAAGCCTTCAGCTTATTCGACAAGGATGGTGATGGTATGCTTCATCCTCCCTTTCCCTCTATCATCGTAGGTTGCATTACCACAAAGGAGCTTGGTACCGTGATGCGTTCCCTCGGTCAAAACCCAACCGAAGCTGAGCTTCAGGACATGATCAACGAAGTTGATGCGGATGGTAACGGAACCATTGATTTCCCGGAGTTCTTGAACCTAATGGCTAGGAAAATGAAGGACACTGACTCTGAGGAAGAACTCAAGGAAGCTTTCAGAGTTTTCGACAAAGACCAGAACGGTTTCATCTCAGCTGCTGAATTGAGACATGTGATGACTAACCTCGGCGAGAAGCTTACTGATGAAGAAGTTGATGAGATGATTAAGGAAGCTGATGTTGATGGTGATGGTCAGATCAACTACGAAGAGTTTGTGAAGGTTATGATGGCTAAGTGA其編碼的蛋白質的氨基酸序列為MADQLTDDQISEFKEAFSLFDKD⑶GMLHPPFPSIIVGCITTKELGTVMRSLGQNPTEAELQDMINEVD ADGNGTIDFPEFLNLMARKMKDTD SEEELKEAFRVFDKDQNGFISAAELRHVMTNLGEKLTDEEVDEMIKEADVDG DGQINYEEFVKVMMAK
實施例2、CAC-2、CMA調節CAC-I鈣離子轉運活性驗證1、pGEMHE載體構建及Capping RNA的制備pGEMHE質粒上有T7啟動子，將CAC-I、CAC_2、CMA基因構建到該質粒中，可以利用體外轉錄試劑盒 mMESSAGE mMACHINE High Yield Capped RNA Transcription Kit，得到 CAC-I、CAC-2、CMA基因全長的mRNA。具體方法是將CAC-1和CAC-2基因分別插入pGEMHE 質粒中，獲得pGEMHE- CAC-I、CAC-2、CMA。并且作為PCR為模板，用引物M13/M13R擴增目的片斷，使得純化后的DNA約1 2 μ g進行體外轉錄，按照體外轉錄試劑盒mMESSAGE mMACHINE High Yield Capped RNA Transcription Kit 所提供的試劑和步驟進行。一次轉錄可獲得20 μ 1約15 20 μ gmRNA,取1 μ 1用biophotometer測量其濃度，然后用經DEPC 處理并經高溫高壓的雙蒸水稀釋至需要的濃度(0. 5 μ g/ μ 1)，分裝到1. 5mL離心管中，每管2-3yL，-80°C保存備用。2、非洲爪蟾的培養與蛙卵的制備非洲爪蟾的來源為美國Nasco公司1)冰塊麻醉非洲蟾蜍后，外科手術取出適量的卵塊；2)在室溫條件下用I型膠原蛋白酶消化取出的卵塊1. 5h，酶解過程中置于低速搖床上，以促進卵塊的解離；3)用無鈣ND96培養液沖洗后，移入盛有ND96的培養皿中。置于18°C培養過夜。3、電壓鉗浴液的配方1)蛙卵培養溶液配方ND96
NaCl96mmolMgCl1.8mmolKCl2mmolCaCl2mmolHEPES5mmolNaOH 調節 PH 至Ij 7. 42)、Bath Solution 配方CaCl 30mmolMgCl 30mmolMES IOmmol4、雙電極電壓嵌電壓鉗紀錄與分析首先向取出的蛙卵中注射CAC-I和CAC-2基因的mRNA，每個卵母細胞注射46nl cRNA，對照組注射等體積的去離子水。注射后，卵母細胞被放回18°C孵箱培養48 72h，然后記錄電信號。注射有CAC-I基因mRNA的卵母細胞在30mM氯化鈣溶液中可以記錄到一個內向的電流，并且在-HOmV的電壓刺激下會激發出IOOOrnA的電流。這個電流就是由CAC-I 基因的鈣離子內向轉運特性引起的，具有電壓和時間的依賴性。而對照細胞只有卵母細胞本底電流大約300mA。注射有CAC-2基因mRNA的卵母細胞在30mM氯化鈣溶液中記錄到的電流大小與對照細胞一致。所以CAC-2基因不具有鈣離子轉運特性。在30mM氯化鈣溶液中記錄CAC-1，CAC-2基因mRNA同時表達的卵母細胞，我們發現原先由CAC-I產生的鈣離子電流消失，表現出和對照細胞同樣的整流特性，可以看出CAC-2能抑制CAC-I的鈣離子電流。CAC-I和CAC-2具有CMA結合位點，那么是否他們三者之間有什么關系呢？我們將這三者同時表達在卵母細胞中，通過電壓鉗記錄我們發現由于CMA的表達CAC-I的鈣離子轉運特性被恢復，也就是說CMA解除了 CAC-2對于CAC-I的抑制。實施例3、CAC-I、CAC-2、CMA相互作用的驗證酵母雙雜交實驗1、誘餌基因轉化篩庫宿主菌AH1091)3個Imm克隆接種于;3mlYPD液體培養基30°C振蕩培養20小時(過夜)，0D600 達到1. 2左右；2)將此3ml菌液接入大體積(體積視轉化個數定)YPD中培養4小時左右，使培養液0D600達到0. 6 ；3)50ml 離心管收集菌液(Falcon, BD), Eppendorf Centrifuge 5810R, 700g(1865rpm)，5分鐘離心收集菌體，棄上清；4) 20ml ddH20 重懸菌體，Eppendorf Centrifuge 5810R，700g，5 分鐘離心收集菌
體，棄上清；5) 20ml ΙΧΤΕ/LiAc 重懸菌體，Eppendorf Centrifuge 5810R，700g5 分鐘離心收集
菌體，棄上清；6)根據每個轉化需要50 μ 1菌液的量加入ΙΧΤΕ/LiAc重懸菌體，分裝到 Eppendorf管中，每管50 μ 1菌液；7)每管加約 IOOng Bait 基因質粒，5 μ 1 預變性的 Carrier DNA, 500 μ 1 IXTE/ LiAc/PEG ；8)放置于30°C培養箱或者水浴中孵育30分鐘，15分鐘時混勻一次；9) 30分鐘后，每管加入15 μ 1 DMSO (DIMETHYL SULFOXIDE)，輕輕上下顛倒混勻；10) 42°C水浴熱激20分鐘，每10分鐘上下顛倒混勻一次；11)冰浴5分鐘;12) 700g, 5分鐘離心收集菌體，棄上清；13) ddH20 洗滌一次菌體；14)利用殘余液體重懸菌體，涂布于SD/_Trp平板上；15. 30°C培養箱培養。第2天即可觀察到克隆長出，第3天克隆即長到所需大小；Carrier DNA =Herring Testes Carrier DNA, Denatured。Clontech。10mg/mlo未使用過的Carrier DNA先100。C變性10分鐘，立即置于冰浴2分鐘，然后再100°C變性10分鐘，之后置于冰浴上備用。已經使用過的Carrier DNA只需要100°C 變性一次即可。ΙΧΤΕ/LiAc :V10XTE VlOXLiAc VH20 = 1 1 81XTE/LiAc/PEG VlOXTE VlOXLiAc V50% PEG = 1 1 850% PEG :50%為質量體積比。PEG3350 溶于 ddH20 中一般需要加熱溶解 10XTE :0. IM Tris-HCl, IOmM EDTA，pH7. 5IOXLiAc :1M LiAc， ρΗ7· 52、含Bait基因質粒的AH109保種Bait基因長出克隆后，一般用誘餌基因特異性引物直接在酵母菌落中PCR鑒定是否轉入正確的Bait基因的質粒，然后把經鑒定正確的克隆進行保種。3、酵母菌落PCR1)用含Bait基因的質粒作為陽性對照，用宿主菌AH109作為陰性對照。2)按照下列反應體系進行 PCR =ExTaq Premix (Takara) 10 μ 1 (2X)5' Primer 0· 5 μ 1 (10 μ Μ) 3，Primer 0· 5 μ 1 (10 μ Μ) ddH208. 9 μ 1 菌 0· 1 μ 13)按照下列反應條件進行PCR:95°C5 分鐘94°C30 秒58°C30 秒72°C2 分鐘30個循環72°C 10分鐘72°C延伸2分鐘是針對小于Ib的Bait基因，對于長于Ib的Bait 基因要相應延長時間。4) PCR產物進行電泳檢測。4、陽性克隆保種1)將陽性克隆接種到3ml相應液體培養基中，30°C振蕩培養2_3天；2) 700g, 5分鐘，離心收集菌體；3)加入1 1的液體培養基和Sterile Glycerol Solution混合溶液；4)充分懸浮菌體，放于 _80°C 保存。Sterile Glycerol Solution 65 % (V/V) glycerol,0. IM MgS04，0. 5mM Tris-HCl, pH7.45、Bait基因的自激活檢測一般采用膜檢的方法，檢測LacZ基因的表達情況。膜檢方法如下1)將陽性克隆菌落影印于濾紙上；2)將濾紙完全浸于液氮中，時間長于30秒，取出后晾干。3)培養皿加入適量顯色液(新鮮配制)，墊一層濾紙，讓其完全濕潤，將凍溶后的濾紙鋪在上面，使顯色液滲透到表層。9CMa培養皿加2ml顯色液，15CMa培養皿加5ml顯色液；4)蓋上皿蓋，放置在37 °C培養箱中，避光放置；5)20分鐘后開始觀察有無變藍的陽性結果并記錄，一般以3小時為準，特殊情況下可以看過夜是否變藍；6)反應過后打開皿蓋，將濾紙烘干，保存并記錄；顯色液100ml Z buffer, 0.27ml β -mercaptoethanol,1. 67ml X-gal Z buffer :16.lg/L Na2HPO4 · 7H20,5.50g/ LNaH2PO4 · H20,0. 75g/LKCl，0. 246g/L MgS04 · 7H20, pH7. 0。室溫可以存放一年。 X-gal :X-gal(5-bromo-4-chloro-3-indoly-β-D-galactopyranoside)溶于 DMF(N, N-dimethylformamide)中，終濃度為 20mg/ml。6、誘餌基因篩庫1) 5-10個2mm克隆接種于Iml SD/_Trp液體培養基中，混勻后轉入150mlSD/_Trp 振蕩培養20小時(過夜)，至0D600 = 1. 2左右；2) 150ml 培養液轉入 1000ml YPDA (YPD+Adenine)中混勻，此時 0D600 = 0. 2-0. 3 ；
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3)培養約 4-5 小時至 0D600 > 0. 6 ；4) 500ml 離心管收集菌液。Beckman Coulter Centrifuge Avanti J_25(以下步驟均使用此離心機)，700g, 5分鐘，RT (室溫)。同時將2000 μ 1 Carrier DNA預變性兩次；5) 500ml ddH20 洗滌一次，700g, 5 分鐘，RT,收集菌體；6) 30ml IX TE/LiAC 洗滌菌體(預先配制 50ml IX TE/LiAC)，轉入 IOOml 離心管;7)700g，5 分鐘，RT。(預先配制 50ml lXTE/LiAC/PEG)；8)加入 12ml IX TE/LiAc 重懸菌體；9)加入 100-500 μ g 文庫 DNA，2000 μ 1 預變性的 Carrier DNA,輕輕混勻；10)加入 50ml lXTE/LiAc/PEG，劇烈渦旋混勻；11) 30°C孵育45分鐘，每15分鐘混勻一次；12)加入 3. 2ml DMS0，輕輕混勻；13) 42°C熱激20分鐘，每10分鐘混勻一次；14)冰浴5分鐘；15) 700g, 5分鐘，收集菌體；16)加入 1000ml YPDA，30°C振蕩培養 60 分鐘；17) 700g，5分鐘，收集菌體；18)加入aiil 0.9% NaCl懸浮菌體，終體積約5ml左右。取20 μ 1菌液做滴度測定，其余菌液 200 μ 1/ ±夬，涂布于 15CMa SD/-Trp/-Leu/-His/+30mM3-AT (3-amino-l, 2, 4-triazole)平板上。第三天起要注意觀察平板酵母克隆生長狀態；19)滴度(轉庫效率)測定20μ1+180μ1 NaCl (0. 9 % )1 10; 20 μ 1+180 μ INaCl (0.9% )1 100 ；20 μ 1+180 μ 1 NaCl (0. 9% ) 1 1000 ；20 μ 1+180 μ 1 NaCl(0. 9 % ) 1 10000 20 μ 1+180 μ 1 NaCl(0. 9 % ) 1 1000001 1000 ； 1 10000 ； 1 100000三種濃度各取100 μ 1涂布SD/-Trp/-Leu平板20)轉庫效率的計算對生長在SD/-Trp/-LeU平板上的克隆計數，挑選克隆數在 30-300之間稀釋度計算轉庫效率21)篩庫完成，菌在SD/-Trp/-Leu/-His+30mM3-AT平板上生長7-14天后，會克隆數(Cfu)X總懸浮體積涂板體積X稀釋度X文庫用量(μ g)= cfu/ μ g DNA有陽性克隆生長出來，陽性克隆一般大于3mm。挑取少量菌做膜檢。從膜檢變藍的酵母菌中抽提prey質粒與Bait質粒做共轉驗證。7、抽提酵母質粒1)膜檢變藍的陽性克隆用牙簽涂布在SD/-Trp-Leu-HiS+30mM3-AT平板上，約 2CMa2，然后放置于30°C培養箱中培養3_4天；2)取一 Eppendorf 管，加入 30 μ 1 的 5u/μ 1 Lyticase。把菌用牙簽刮到 lyticase 中，Vortex充分懸浮。37°C孵育30分鐘；3)加入170 μ 1 Lysis Buffer使終體積為200 μ 1。再加入200 μ 1玻璃珠 (425-600microns)，200 μ 1 酚 / 氯仿 / 異戊醇(25 24 1), vortex 劇烈振蕩 5 分鐘；4) 12，OOOrpm離心10分鐘，將上清轉入一干凈Eppfendorf管中。注意，不要把蛋白轉移過去；5)加入8 μ 1 IOM NH4Ac和500 μ 1無水乙醇，混勻，_80°C放置1小時；6) 12，OOOrpm離心10分鐘，去上清；7)加入500 μ 1 70%乙醇洗滌沉淀，12，OOOrpm離心5分鐘；8)棄上清，真空抽干沉淀；9)將沉淀重懸于10 μ 1 ddH20中，一般取2_3 μ 1轉化大腸桿菌；Lyticase 將 Lyticase 干粉溶解在 IXTE 中，終濃度為 5u/μ 1 ；Lysis Buffer :50mM Tris-HCl (ρΗ8· 0)， 0. 1% Triton X-100,0. 5% SDS8、酵母質粒的擴增一般用電轉的方法，把從篩庫所得的陽性克隆中抽提的質粒在大腸桿菌中擴增。大腸桿菌電轉感受態制備1)挑一單克隆接入3ml LB培養基，搖培14-16小時至0D600 = 1. 0-1. 2 ；2)將搖培后的菌液轉接IL LB培養基，搖培4_5小時至0D600 = 0. 7-0. 8 ；3)離心收菌，IOml冰水溶解；4) 5000g, 4°C離心10分鐘收菌，400ml冰水將菌重懸，冰浴10分鐘；5)5000g，4°C離心10分鐘收菌，40ml預冷10%甘油重懸，冰浴10分鐘；6)5000g，4°C離心10分鐘收菌，加Iml 10%甘油重懸;7)用槍測量重懸后的菌液體積，加入與菌液等體積的10%甘油(注等體積10% 甘油指重懸后的菌液體積減去1ml。例加入lmll0%甘油后重懸菌液體積為細1，則加入 10%甘油量為3ml)；8)分裝到Eppendorf管中，每管100 μ 1，冰上操作；9. _80°C冰箱保存；10.取出兩管做陰性、陽性對照；10%甘油V甘油V水=1 9。9、電擊轉化1)從_80°C冰箱取出感受態，至冰上溶解。同時，將電轉杯至冰上冷卻，打開電轉儀準備30分鐘；2)感受態溶解后，將要轉化的質粒(或連接產物或其他要轉化的物質)加入感受態，用槍吹打均勻。電轉時有必要進行陰性對照、陽性對照，以檢驗感受態是否被污染及感受態是否正常；3)將混合后的感受態加入預冷的電轉杯；4)擦干電轉杯上電極兩邊的壁；5)將電轉杯放入電轉儀，電擊；6)電擊后，用Iml SOC將感受態洗出，37 °C孵育45分鐘；
7) 6，OOOrpm, 3 分鐘離心收菌；8)涂板，不同電轉杯的最適電壓各不相同，經實驗1mm電轉杯的最適電壓為 1900-2200V 4mm電轉杯的最適電壓為2300-2500V 8mm電轉杯的最適電壓為2500-2700V SOC :20g/L 蛋白胨，5g/L酵母提取物，0. 5g/L NaCl, 2. 5mM KCl，pH7. 0。121°C，20 分鐘滅菌。 冷卻至60°C以下時，每升加入20ml滅菌的IM葡萄糖溶液。該溶液使用前每升加入5ml滅菌的 2M MgCl2。雙分子熒光互補實驗分子焚光互補(bimolecular fluorescence complementation, BiFC)分析技術，是由Hu等在2002年最先報道的一種直觀、快速地判斷目標蛋白在活細胞中的定位和相互作用的新技術.該技術巧妙地將熒光蛋白分子的兩個互補片段分別與目標蛋白融合表達， 如果熒光蛋白活性恢復則表明兩目標蛋白發生了相互作用.其后發展出的多色熒光互補技術(multicolorBiFC)，不僅能同時檢測到多種蛋白質復合體的形成，還能夠對不同蛋白質間產生相互作用的強弱進行比較.目前，該技術已用于轉錄因子，G蛋白β Y亞基的二聚體形式，不同蛋白質間產生相互作用強弱的比較以及蛋白質泛素化等方面的研究工作上.利用黃色熒光蛋白(yellow fluorescent protein，YFP)作為報告基因，將熒光蛋白分割成兩個不具有熒光活性的分子片段，再分別與目標蛋白連接，如果兩個目標蛋白因為有相互作用而靠近，就使得熒光蛋白的兩個分子片段在空間上相互靠近，重新形成活性的熒光基團而發出熒光.在熒光顯微鏡下，就能直接觀察到兩目標蛋白是否具有相互作用，并且在最接近活細胞生理狀態的條件下觀察到其相互作用發生的時間、位置、強弱、所形成蛋白質復合體的穩定性，以及細胞信號分子對其相互作用的影響。將CAC-I和CAC-2的碳末端分別構建在pGADT7和pGBKT7中用于做酵母雙雜交。在亮氨酸，色氨酸，組氨酸缺失的培養基上表達了 CAC-I和CAC-2的酵母可以生長，說明CAC-I 和CAC-2能夠相互作用。同時CAC-I和CAC-2都可以和CMA相互作用，但是CAC-2與CMA 的互做更加強烈。同樣在雙分子熒光互補實驗中可以看出，在轉有CAC-I-YFPn和CAC_2_YFPe的原生質體中有綠色的熒光且定位在細胞膜上。在CAC-2-YFPn和CMA-YFPe表達的原生質體也有綠色熒光且定位在細胞膜上。但在CAC-I-YFPn和CMA-YFPe表達的原生質體沒有明顯的綠色熒光。通過這兩個實驗我們可以得出在這樣的結論CAC-1和CAC-2可以向互作用，CMA 與CAC-2的相互作用要強于CAC-I。實施例4、CAC-1、CAC-2、CMA調控花粉管伸縮、影響雄性不育的驗證花粉的萌發和培養1)配置花粉萌發培養基 ImM CaCl2, ImM Ca (NO3)2, ImM MgSO4, 0. 01% (w/v) H3BO3, and 18% (w/v) sucrose 0. 8% (w/v) agar, pH 7.0。2)收集20朵煙草花放入IOmL離心管中，震蕩1分鐘，500g離心2分鐘。3)將收集的花粉撒在培養基上培養30分鐘。基因槍轟擊1)將已構建的含有GFP的CAC-I，CAC-2以及CM質粒用金粉包被(30ug的質粒使用用:3mg的金粉)2)使用Bio-Rad公司的PDS-1000/He biolistic系統將包被有金粉的質粒轟擊進入培養好的花粉管中，每個樣本轟擊2次。設置參數為28英尺的Hg真空室，1100-psi安全膜，0. 25英尺殉爆距離。3)培養30分鐘后用激光共聚焦顯微鏡觀察。與對照相比，CAC-I過表達的花粉管明顯變的有粗又短，可能是由于鈣離子的積累所致。但同時表達CAC-I和CAC-2的花粉管恢復了與對照一樣的表型。如果同時過表達 CAC-I, CAC-2和CMA花粉管變的又短有粗，與過表達CAC-I的花粉管表型一致。
權利要求
1.一種Ca2VMg2+通道分子CAC-1，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示。
2.根據權利要求1所述的Ca2VMg2+通道分子CAC-I，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No. 2 所示。
3.權利要求1所述Ca2+/Mg2+通道分子CAC-I的抑制劑CAC-2，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No. 3所示。
4.根據權利要求3所述的Ca2+/Mg2+通道分子CAC-I的抑制劑CAC-2，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示。
5.一種鈣結合蛋白CMA，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No. 5所示。
6.根據權利要求5所述的鈣結合蛋白CMA，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNo. 6 所示。
7.鈣信號開關分子，其特征在于，包括權利要求1所述的Ca2VMg2+通道分子CAC-I、權利要求3所述的Ca2+/Mg2+通道分子CAC-I的抑制劑CAC-2、以及權利要求5所述的鈣結合蛋白CMA，其中，CAC-2抑制Ca2+/Mg2+通道分子CAC-I的鈣通道活性，CMA與CAC-2和CAC-I 同時相互作用，解除了 CAC-2對CAC-I鈣離子轉運活性的抑制。
8.權利要求7所述的鈣信號開關分子調節植物體內鈣流波動的應用。
9.權利要求7所述的鈣信號開關分子用于調控植物雄性不育的應用。
全文摘要
本發明涉及基因工程領域，具體地涉及控制花粉雄性不育鈣波動的分子開關及其應用。根據本發明的鈣信號開關分子，包含上述Ca2+/Mg2+通道分子CAC-1、Ca2+/Mg2+通道分子CAC-1的抑制劑CAC-2、以及鈣結合蛋白CMA，其中，CAC-2抑制Ca2+/Mg2+通道分子CAC-1的鈣通道活性，CMA與CAC-2和CAC-1同時相互作用，解除了CAC-2對CAC-1鈣離子轉運活性的抑制。
文檔編號C12N15/29GK102260341SQ201110172530
公開日2011年11月30日 申請日期2011年6月24日 優先權日2011年6月24日
發明者李樂攻, 潘亞軍 申請人:首都師范大學