專利名稱：一種利用木瓜蛋白酶檢測重金屬污染的方法
技術領域：
本發明涉及一種利用木瓜蛋白酶檢測重金屬污染的方法。
背景技術：
木瓜蛋白酶(Papain，E C 3. 4. 22. 2)，主要存在于番木瓜莖葉與果實中，未成熟果實的乳汁中含量最高，因其穩定性好，蛋白水解能力強，并且對多種蛋白質均具有較好的降解作用，目前已被廣泛地應用于諸多行業。在食品行業中，用于肉類嫩化、啤酒澄清、飼料添加劑和魚類加工；在工業行業中，用于明膠制造、蠶繭脫膠、皮革脫毛等；在醫療衛生行業中，用于驅腸蟲劑、治療消化不良、各種炎癥以及水腫等疾病。但迄今為止國內還未見將其用于重金屬檢測中的相關研究報道。隨著我國經濟的快速發展，不規范、超常的工業生產造成了嚴重的環境污染。人們日常生活中充斥著大量含重金屬的廢棄物(如電池、電器設備等)，這些廢棄物沒有得到有效的管理和處置，進一步加劇了重金屬的污染和危害。當重金屬通過土壤-植物系統遷移轉化，并經過食物鏈的積累和放大作用，會對生物產生更大的毒害。為了保證食品和飲用水的安全，確保人們的身體健康，適用的方法和檢測手段顯得尤為重要和迫切。傳統的重金屬檢測方法有原子吸收光譜法、原子發射光譜法、原子熒光光譜法和陽極溶出伏安法等，這些方法和技術靈敏度高、特異性強，但存在著樣品前處理較為復雜、儀器費用高和需要專業人員進行操作等缺陷，難以用于重金屬的現場檢測。隨著經濟的發展和人們生活水平的改善，人們對食品安全的要求不斷提高，待測樣品量迅速增加，傳統的檢測技術已無法滿足這種需求。因此，食品污染物的快速檢測技術越來越受到關注。近年來，酶已被用于測定環境介質(水、土和廢棄物)和食品中的痕量有害物質。酶抑制法作為一種快速檢測有害物質殘留的方法，與傳統分析方法相比，具有簡便、快捷和成本低廉等優點。它直接利用酶的抑制率大小來表示有害物質殘留程度的高低，能在較短時間內快速、靈敏的篩選出大量超標樣品。而現在比較常用的檢測用酶主要集中在脲酶、磷酸酯酶、過氧化物酶、黃嘌呤氧化酶、轉化酶、葡萄糖氧化酶、丁酰膽堿脂酶和異檸檬酸脫氫酶等，其中，最常用的是脲酶。利用蛋白酶尤其是木瓜蛋白酶對重金屬進行檢測的研究報道在國內還是空白。而本方法的實施將可以有效拓寬酶抑制法的使用范圍更加擴大、使用方法更加靈活。
發明內容
本發明的目的是提供一種利用木瓜蛋白酶檢測重金屬污染的方法。本發明所提供的利用木瓜蛋白酶檢測重金屬污染的方法包括以下步驟1)自新鮮番木瓜中提取木瓜蛋白酶；以標準R)lin法測定木瓜蛋白酶酶活；將木瓜蛋白酶和與重金屬離子溶液在30-50°C條件下混合，20-30min后以酪蛋白為底物，Folin 法測定木瓜蛋白酶酶活；2)制作重金屬對酶活的抑制曲線，根據酶活抑制率測定待測樣品中重金屬含量。
本發明測定重金屬濃度的方法屬于酶抑制法測定重金屬方法的范疇。是根據重金屬離子對木瓜蛋白酶的抑制率，進而測定重金屬濃度的方法。本發明以木瓜蛋白酶為測定酶對待測樣品中的重金屬離子濃度進行測定，有效擴展了酶抑制法測定重金屬的方法。本發明所提供的重金屬檢測的方法具有操作簡單、反應條件溫和、經濟性好、檢測酶易獲得，以及能降低檢測成本等優點。
圖1為金屬離子對木瓜蛋白酶酶活的影響圖2為檢測Cu2+工作方程
具體實施例方式下述實施例中所述方法，如無特別說明，均為常規方法。下述實施例中所述百分含量，如無特別說明，均為質量百分含量。實施例1、酶液制備取未成熟的新鮮木瓜汁液離心取上清液，經硫酸銨分級沉淀、sephadex-G50柱色譜純化得到木瓜蛋白酶。4 °C冰箱冷藏備用。實施例2、酶體系酶活測定蛋白酶活力采用Folin法測定。用50mM磷酸緩沖溶液(pH6. 5)配制的2%酪蛋白 (sigma)為底物。將酶液稀釋合適的倍數。取Iml稀釋的酶液，在40°C下保溫lmin，加入同樣溫度的底物lml，在40°C下反應IOmin后，加入2ml三氯乙酸(1%)終止反應。在40°C 下保溫15min,以12000rpm離心15min，取Iml上清液加入5ml 0. 4M碳酸鈉，混勻加入Iml 福林試劑(sigma)，混勻后在40°C保溫20min，測定OD66tl值。標準曲線用不同濃度的酪氨酸來制定，酶活力定義為在40°C下，每毫升酶液每分鐘催化酪蛋白水解生成1微克酪氨酸的酶量為1個單位(U/ml)。實施例3、酶體系對重金屬敏感性的篩選等體積酶液與重金屬溶液互溶至終濃度為lg/L，40°C放置反應20min，而后按照實施例2進行酶活測定。篩選出酶敏感的重金屬。重金屬離子可與酶蛋白結合使之變性或與某些蛋白的巰基結合而使酶失活，不同濃度金屬離子對酶活的影響如圖1所示，酶活抑制差異很大。酶對Cu2+最敏感，其次是Ag+。 其中Ag+對酶的活性抑制率達93%以上，而1 2+對酶的活性抑制率為36. 7%。實驗重復三次。以下實驗結果為三次重復實驗的平均值。實施例4、木瓜蛋白酶體系檢測污水中Cu2+酶活測定方法同實施例2，以不同濃度Cu2+溶液為橫坐標，酶活抑制率為縱坐標， 每次測定重復3次，做Cu2+濃度抑制酶活的標準曲線。以Cu2+濃度為橫坐標，酶活抑制率為縱坐標，得到Cu2+濃度對酶活影響的標準曲線，如附圖2所示，方程為y= 102. 67x+2. 1309， R2 = 0. 9890。計算其IC50為0. 47mg/mL，標準曲線的檢出限為0. 0005mg/L。
權利要求
1. 一種利用木瓜蛋白酶對常見重金屬(鉛、汞等)污染進行檢測的方法，包括以下步驟檢測體系基于蛋白質含量測定法——Folin法，反應體系特征是(1)將一定濃度的木瓜蛋白酶(預溶于50mM，pH6.5的磷酸緩沖溶液中)與一定濃度的干酪素建立的反應為被檢測體系。(2)用50mM磷酸緩沖溶液(pH6.5)配制的2%酪蛋白為底物。將酶液稀釋合適的倍數，將其與一定濃度重金屬溶液混合后40°C下保溫30min。取Iml待測酶液，在40°C下保溫 lmin，加入同樣溫度的底物lml，在40°C下反應IOmin后，加入2ml三氯乙酸(1%)終止反應。在40°C下保溫15min，以12000rpm離心15min，取Iml上清液加入5ml 0. 4M碳酸鈉，混勻加入lml Folin試劑，混勻后在40°C保溫20min，測定0D660值。以空白樣品作為參比， 根據工作方程核算重金屬濃度。其檢測體系特征是以i^olin法測定木瓜蛋白酶酶活為反應體系，利用重金屬離子對酶的的抑制作用，定量測定待測樣品中重金屬濃度。
全文摘要
本發明公開了一種利用木瓜蛋白酶酶抑制法測定重金屬濃度的方法。本發明所提供的重金屬濃度的方法，包括以下步驟1)自未成熟的番木瓜提取木瓜蛋白酶；2)以Folin法測定蛋白酶酶活；將不同濃度的重金屬與木瓜蛋白酶混合，40℃保溫30min后測定酶活抑制率；制作工作方程。3)將待測樣品稀釋至合適濃度，按照步驟2)測定木瓜蛋白酶酶活；利用2)得到的工作方程計算樣品中的重金屬濃度。本發明所提供的測定重金屬濃度的方法具有操作簡單、反應條件溫和、經濟性好、并能顯著降低檢測成本等優點。
文檔編號C12Q1/37GK102286609SQ201110169299
公開日2011年12月21日 申請日期2011年6月22日 優先權日2011年6月22日
發明者朱運平, 李秀婷, 滕超 申請人:北京工商大學