專利名稱：一種用于體外細胞共培養的復合微囊模型的制作方法
技術領域：
本發明屬于細胞體外培養技術領域，特別是涉及一種動物細胞體外共培養模型。
背景技術：
在體內，細胞處于一個高度信息化的微環境中，其間充斥著各種復雜的物理化學信號，細胞對各種信號刺激做出響應，以實現其特定的生物學功能。細胞與這種微環境間的相互作用包括來自周圍細胞、細胞外基質和可溶性因子的各種復雜的生物化學、生物力學和生物電學信號。其中，細胞與細胞之間是通過直接接觸或旁分泌可溶性因子而發生相互作用。這種細胞間的通訊作用是維持細胞、組織及器官結構與功能的重要環節，同時也是調節體內外組織修復與重建的關鍵因素，而缺少這種通訊作用則是某些細胞體外培養時功能喪失以及分化異常、腫瘤發生的潛在原因。在細胞體外培養過程中，如何有效模擬體內微環境、調控細胞與外界微環境間的相互作用，對于細胞形態與功能的維持以及體外組織的仿生重建至關重要。細胞共培養(cell co-culture)技術是將多種細胞(可以來自同一組織，也可以來自不同的組織)進行共同培養，從而使目的細胞的形態與功能穩定表達，并維持較長的時間和較高的水平。該技術能夠有效地模擬體內微環境，是目前體內外組織結構及其功能重建的常用手段之一。傳統共培養方式主要有接觸式和非接觸式共培養。接觸式共培養是在合適的培養條件下，將多種細胞按照一定比例混合接種到同一培養環境中進行共同培養。非接觸式共培養主要是指用一種細胞的培養上清液(含有不同生長因子等)直接或間接的與另外一種細胞進行共培養，從而達到研究細胞的分泌或代謝產物對目的細胞生長、遷移、增殖、分化等生物學行為影響的目的。然而，傳統接觸式共培養很難調控體系中同型與異型細胞間相互作用比例，且后期深入研究時也很難有效的把不同種細胞分離開。而非接觸式共培養體系僅能部分模擬體內細胞間的相互作用，缺乏由異種細胞間直接接觸而導致的胞間作用。近年來，隨著工程學、材料學等相關學科的發展，出現了一些新的用于調控細胞外基質微環境的細胞共培養方法。其中，一種具有突破性的調控方法是進行圖案化細胞共培養。其原理是通過在基質材料表面不同區域進行特定修飾而形成細胞粘附生長的圖案化區域，使不同細胞選擇性地粘附在材料表面的不同區域，或通過可移除的物理障礙將不同細胞限制在圖案化的不同區域內生長而實現共培養。該共培養方法可以將細胞精確地定位在基質材料表面，更好的調控細胞在培養過程中的空間分布和更加精確的控制同型和異型細胞間的相互作用比例，維持目的細胞的生物學活性，為揭示細胞與細胞以及細胞與基底相互作用基本機理提供有力工具，是一種用于研究細胞間相互作用和工程化組織重建的有效途徑。然而，該共培養方法操作較為復雜，基底材料制備工藝較為繁瑣，且只限于貼壁細胞的共培養，極大的限制了其應用范圍。同時，細胞在該體系中仍處于二維培養環境中，而二維細胞培養方式不能提供類似于體內細胞生長所需的三維空間微環境，對細胞形態、功能表達等許多生物學特征產生不利影響。研究表明，在三維培養體系中細胞的生長方式更接近體內，能夠更為真實的模擬復雜的體內細胞微環境。因而，模擬體內微環境，開發新型的用于調控細胞外基質微環境的細胞培養方法，對于體外研究細胞行為、揭示細胞與基質微環境間的相互作用至關重要。
發明內容
本發明目的是克服以上現有的細胞體外共培養中存在的缺點與不足，提供一種新型的細胞體外三維共培養模型，即用于體外細胞共培養的復合微囊模型。本發明為模擬體內細胞生長微環境，利用微囊技術，以天然多糖海藻酸鈉為基質材料，構建海藻酸鈉微囊化細胞體外三維培養模型。本發明提供的用于體外細胞共培養的復合微囊模型，是以天然多糖海藻酸鈉為基質材料，經過兩次將多糖海藻酸鈉滴入到多價陽離子溶液中凝膠化處理，形成由內外兩層海藻酸鈉凝膠微球構成的球包球式復合微囊模型，其中在一層凝膠微球中包含或不包含一種細胞，如細胞A，在另一層凝膠微球中包含或不包含另一種細胞，如細胞B。其中所述的多價陽離子是鈣、鋅、鋇、銅、鎂、鐵、錳離子。所述的內層凝膠微球的粒徑范圍在50-600 μ m，外層凝膠微球的粒徑范圍在 100-3000 μ m0本發明所述的復合微囊模型的構建方法，包括
第1、將經過濾滅菌的海藻酸鈉溶液滴入到多價陽離子溶液中凝膠化處理，形成海藻酸鈉凝膠微球；所述的海藻酸鈉溶液中選擇性添加或不添加細胞A ；
第2、收集凝膠化的海藻酸鈉凝膠微球，用生理鹽水(0. 9%NaCl溶液)洗滌，將海藻酸鈉凝膠微球再次分散到經過濾滅菌的海藻酸鈉溶液中，然后將含有海藻酸鈉凝膠微球的海藻酸鈉溶液滴入到多價陽離子溶液中再次凝膠化處理，形成球包球式復合微囊模型；所述的海藻酸鈉溶液中選擇性添加或不添加細胞B ；
第3、收集凝膠化處理后的復合微囊模型，生理鹽水洗滌，置入細胞培養板內，加入細胞培養基，置于二氧化碳培養箱(37°C、5% C02、100%濕度)靜置培養。以上第1步、第2步中所述的海藻酸鈉溶液采用高壓靜電滴液、氣流吹噴滴液或手工注射器滴液的方法滴入到多價陽離子溶液中凝膠化處理，所述的多價陽離子是鈣、鋅、 鋇、銅、鎂、鐵、錳離子。第1步制備內層凝膠微球的海藻酸鈉溶液的質量體積濃度為0. 5%_5%，內層凝膠微球的粒徑控制在50-600 μ m范圍；
第2步制備外層凝膠微球的海藻酸鈉溶液的質量體積濃度為0. 1%_3%，外層凝膠微球的粒徑控制在100-3000 μ m范圍。本發明還可以在第1步、第2步凝膠化處理后得到的海藻酸鈉凝膠微球表面選擇性包覆一層半透性膜，具體方法是
將生理鹽水洗滌后的海藻酸鈉凝膠微球分散到質量濃度為0. 01%-2%的陽離子型高分子溶液中處理l-30min分鐘即可；所述的陽離子型高分子溶液是多聚賴氨酸溶液或殼聚糖溶液。本發明所述的復合微囊模型可以應用于考察細胞-細胞、細胞-細胞外基質以及細胞-可溶性因子間的相互作用，體外構建腫瘤模型、組織工程化各類組織器官類似物或等同物。
本發明的優點和積極效果
1.本發明采用的基質材料天然多糖海藻酸鈉是一種廉價、無毒、生物相容性好的聚陰離子型生物材料，在常溫、酸堿中性的生理條件下，可以不使用存在細胞毒性的交聯劑，而是利用多價陽離子，使海藻酸鈉溶液發生相變形成凝膠態；利用微囊化技術仿生構建細胞體外三維培養模型。本發明具有設備簡易，操作簡單，對細胞物理傷害小的優點，適于進一步的體內移植及體外組織再生研究；構建的微囊模型一方面使囊內細胞與外界免疫分子隔離，保護囊內細胞，另一方面諸如氧氣、營養物質、電解質、有生物活性的分泌物以及細胞代謝產物等低分子量物質可自由穿過而進行物質傳遞，保證了囊內細胞的生長存活，并延長了其形態和功能的維持時間。2.本發明首次報道通過球包球復合微囊模型實現細胞體外三維共培養。該共培養模型具備更為仿生的特點，可同時克服傳統接觸式共培養體系很難調控同型與異型細胞間相互作用比例和難于在后期研究中把不同種細胞分離開、非接觸式共培養體系缺乏由異種細胞間直接接觸而導致的胞間作用以及圖案化共培養存在細胞依賴性的諸多缺點，在溫和、可調控的條件下實現各種目的細胞的三維仿生共培養。3.本發明中所涉及的實驗器材均可經高溫高壓滅菌，可重復使用，大大降低了實驗成本，利用本發明構建的共培養模型可更為仿生的觀察細胞在三維培養體系中的生長、 遷移、增殖與分化等生物學行為，揭示細胞-細胞、細胞-細胞外基質和細胞-可溶性因子間的相互作用。
圖1是用復合微囊模型進行細胞共培養的示意圖。圖2是傳統微囊化細胞三維體外培養光鏡圖。圖3是內部區域含細胞而外層區域不含細胞的復合微囊模型光學顯微照片。圖4是用復合微囊模型進行異種細胞共培養的光學顯微照片。圖1中，1內部微囊內細胞A，2外部微囊內細胞B，3微囊的選擇性半透膜，4可自由透過膜的低分子量物質，如氧氣、營養物質及一些低分子量活性因子和細胞代謝產物，5 不能透過膜的高分子量物質，如抗體、免疫細胞、免疫球蛋白等。
具體實施例方式實施例1
如圖1所示，本發明通過兩步微囊化將異種細胞分別培養在復合微囊模型的內、外區域。復合微囊模型的構建方法包括
第1、將經過濾、滅菌的海藻酸鈉溶液滴入到多價陽離子溶液中凝膠化處理，形成海藻酸鈉凝膠微球；所述的海藻酸鈉溶液中添加有細胞A并分散均勻；海藻酸鈉溶液的質量體積濃度為0. 5%-5%，內層凝膠微球的粒徑控制在50-600 μ m范圍；
第2、收集凝膠化的海藻酸鈉凝膠微球，用生理鹽水(0. 9%NaCl溶液)洗滌，將海藻酸鈉凝膠微球再次分散到經過濾滅菌的海藻酸鈉溶液中，然后將含有海藻酸鈉凝膠微球的海藻酸鈉溶液滴入到多價陽離子溶液中再次凝膠化處理，形成球包球式復合微囊模型；所述的海藻酸鈉溶液中添加有細胞B并分散均勻；海藻酸鈉溶液的質量體積濃度為0. 1%_3%，外層凝膠微球的粒徑控制在100-3000 μ m范圍；
第3、收集凝膠化處理后的復合微囊模型，生理鹽水洗滌，置入細胞培養板內，加入細胞培養基，置于二氧化碳培養箱(37°C、5% C02、100%濕度)靜置培養。以上第1步、第2步中所述的海藻酸鈉溶液采用高壓靜電滴液、氣流吹噴滴液或手工注射器滴液的方法滴入到多價陽離子溶液中凝膠化處理，所述的多價陽離子是鈣、鋅、 鋇、銅、鎂、鐵、錳離子。本發明還可以在第1步、第2步凝膠化處理后得到的海藻酸鈉凝膠微球表面選擇性包覆一層半透性膜，具體方法是
將生理鹽水洗滌后的海藻酸鈉凝膠微球分散到質量濃度為0. 01%-2%的陽離子型高分子溶液中處理l-30min分鐘即可；所述的陽離子型高分子溶液是多聚賴氨酸溶液或殼聚糖溶液。本發明利用微囊化技術，不僅可以為細胞的生存提供三維立體微環境，還可以利用復合微囊模型中半透膜的分子截斷作用使細胞與宿主免疫系統隔離，在治療相關疾病時，減少甚至避免免疫排斥反應的發生；另一方面，復合微囊模型的半透膜可以允許諸如氧氣、營養物質、電解質、有生物活性的分泌物以及細胞代謝產物等低分子量物質的順利通過而進行物質傳遞，保證了囊內細胞的生長存活，并延長了其形態和功能的維持時間。本發明可有效的克服傳統共培養方式中存在的同種與異種細胞間相互作用不可控、后期研究時異種細胞難于分離以及存在細胞依賴性等缺點，可在三維立體環境下研究細胞的生長、增殖、遷移及胞間作用等生物學行為。圖2所示為利用現有技術該構建的傳統微囊化細胞模型，該模型可用于細胞的三維體外培養，也可通過多種細胞的共同微囊化實現細胞三維體外共培養。該體系用于共培養時，異種細胞在空間上處于同一微囊內，具有傳統接觸式共培養的許多缺點，如同型與異型細胞間相互作用在空間與比例上均不可調控，后期研究時異種細胞難于分離等。
實施例2
如圖3所示，本實施例提供的是僅復合微囊模型內部包裹OTH3T3細胞的情況下光學顯微照片。復合微囊模型的構建方法同實施例1。利用本發明構建的三維復合微囊模型形狀規整，表面光滑，粒徑均勻，基本上可保證復合微囊模型體系中每個大囊內包裹一個小微囊，且該培養體系可將細胞分別固定在復合微囊模型的特定區域。實施例3
如圖4所示，利用本發明構建的復合微囊模型(構建方法同實施例1)將異種細胞進行體外共培養。復合微囊模型的中心區域與外層區域分別為NIH3T3細胞和HepG2細胞，從中可以看出，兩種細胞均勻的分布在復合微囊模型的不同區域內，彼此相鄰且相互分開，可用于研究異種細胞間的相互作用及細胞分泌產物對其它細胞行為的影響，同時可更為仿生的模擬體內組織或器官細胞在三維空間上的分布和異種細胞彼此間相互作用。
權利要求
1.一種用于體外細胞共培養的復合微囊模型，其特征在于該模型是以天然多糖海藻酸鈉為基質材料，經過兩次將多糖海藻酸鈉滴入到多價陽離子溶液中凝膠化處理，形成由內外兩層海藻酸鈉凝膠微球構成的球包球式復合微囊模型，在其中一層凝膠微球中包含或不包含一種細胞，在另一層凝膠微球中包含或不包含另一種細胞。
2.根據權利要求1所述的復合微囊模型，其特征在于所述的多價陽離子是鈣、鋅、鋇、 銅、鎂、鐵、錳離子。
3.根據權利要求1或2所述的復合微囊模型，其特征在于所述的內層凝膠微球的粒徑范圍在50-600 μ m,外層凝膠微球的粒徑范圍在100-3000 μ m。
4.一種權利要求1所述的復合微囊模型的構建方法，其特征在于包括第1、將經過濾滅菌的海藻酸鈉溶液滴入到多價陽離子溶液中凝膠化處理，形成海藻酸鈉凝膠微球；所述的海藻酸鈉溶液中選擇性添加或不添加細胞A ；第2、收集凝膠化的海藻酸鈉凝膠微球，用生理鹽水洗滌，將海藻酸鈉凝膠微球再次分散到經過濾滅菌的海藻酸鈉溶液中，然后將含有海藻酸鈉凝膠微球的海藻酸鈉溶液滴入到多價陽離子溶液中再次凝膠化處理，形成球包球式復合微囊模型；所述的海藻酸鈉溶液中選擇性添加或不添加細胞B;第3、收集凝膠化處理后的復合微囊模型，生理鹽水洗滌，置入細胞培養板內，加入細胞培養基，置于二氧化碳培養箱靜置培養。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于第1步、第2步中所述的海藻酸鈉溶液采用高壓靜電滴液、氣流吹噴滴液或手工注射器滴液的方法滴入到多價陽離子溶液中凝膠化處理，所述的多價陽離子是鈣、鋅、鋇、銅、鎂、鐵、錳離子。
6.根據權利要求4所述的方法，其特征在于第1步制備內層凝膠微球的海藻酸鈉溶液的質量體積濃度為0. 5%-5%，制備外層凝膠微球的海藻酸鈉溶液的質量體積濃度為 0. 1%-3%。
7.根據權利要求4所述的方法，其特征在于第1步制備的內層凝膠微球的粒徑控制在 50-600 μ m范圍，第2步制備的外層凝膠微球的粒徑控制在100-3000 μ m范圍。
8.根據權利要求4至7中任一項所述的方法，其特征在于將第1步、第2步凝膠化處理后得到的海藻酸鈉凝膠微球表面選擇性包覆一層半透性膜，具體方法是將生理鹽水洗滌后的海藻酸鈉凝膠微球分散到質量濃度為0. 01%-2%的陽離子型高分子溶液中處理l_30min分鐘即可。
9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于所述的陽離子型高分子溶液是多聚賴氨酸溶液或殼聚糖溶液。
10.一種權利要求1所述的復合微囊模型的應用，其特征在于用于考察細胞-細胞、細胞-細胞外基質以及細胞-可溶性因子間的相互作用，體外構建腫瘤模型、組織工程化各類組織器官類似物或等同物。
全文摘要
一種用于細胞體外共培養的復合微囊模型。該模型以天然多糖海藻酸鈉為基質材料，將多糖海藻酸鈉滴入到多價陽離子溶液中經兩次凝膠化處理，形成由內外兩層海藻酸鈉凝膠微球構成的球包球式復合微囊模型，其中一層凝膠微球中可包含一種細胞，另一層中可包含另一種細胞。該模型可用于各種細胞間的體外共培養研究，克服了傳統共培養模型中同種與異種細胞間相互作用不可控、后期研究時異種細胞難于分離以及存在細胞依賴性等諸多缺點，可在三維立體仿生條件下模擬細胞-細胞、細胞-細胞外基質以及細胞-可溶性因子間的相互作用，為體外構建腫瘤模型、優化細胞體外培養方式和組織工程化構建各類組織器官類似物或等同物提供理論和技術支持。
文檔編號C12N11/10GK102286422SQ20111016887
公開日2011年12月21日 申請日期2011年6月22日 優先權日2011年6月22日
發明者楊軍, 毛宏理, 鄭俊坤 申請人:南開大學