專利名稱：GeXP多重基因表達遺傳分析系統在16種常見呼吸道病毒分型檢測中的應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術應用領域，涉及各級疾病預防控制機構，哨點醫院等用于呼吸道相關疾病患者鼻咽抽提物標本的16種呼吸道病毒(包括FluA、FluB、sHlNl、PIVUPIV2、PIV3、RSVA、RSVB、HRV、HMPV、HBoV、CoV NL63、Co V 0C43、CoV 229E、CoV HKUl和 Adv)感染的同時檢測和分型。具體在NCBI下載16種呼吸道病毒代表株的核苷酸序列，通過查閱文獻和多序列比對，確定病原體相對保守區，設計多重特異性引物。進行單管多重(18重)PCR檢測16種呼吸道病毒保守區，整個反應不到2個小時。本專利克服了病毒培養法、直接熒光抗體法、芯片檢測方法的操作繁瑣，時間較長，成本較高等缺點，為呼吸道病毒分型技術提供了新的思路，其高特異性、高靈敏度、快速的特點為呼吸道疾病相關病毒的快速準確篩查和分型提供了有力的技術支撐，對研究我國呼吸道病患者感染病原譜和分子流行病學調查有重要意義。
背景技術：
急性呼吸道感染是廣泛分布于成年人和兒童的感染性疾病之一，具有相當高的發病率和死亡率。大部分急性上呼吸道疾病和下呼吸道疾病主要是由呼吸道病毒引起的。傳統認為，引起呼吸道疾病的主要病毒病原體有流感病毒A型(FluA)和B型(FluB)、人鼻病毒(HRV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、副流感病毒(PIV1、PIV2、PIV3、PIV4)、腺病毒(Adv)等。然而，近十年來，新的呼吸道病毒不斷被發現，人偏肺病毒(HMPV)、冠狀病毒(NL63、HKU1、0C43、229E)、博卡(HBoV)病毒等也成為呼吸道疾病的重要病原，給人類的健康構成很大的威脅。由于這些病毒引起的感染癥狀和流行癥狀相似，僅靠臨床癥狀及常規檢測方法進行病毒病原的確定是非常不可靠的，因此，迫切需要一種高靈敏度、高特異性的方法可以同時檢測傳統的和新興出現的呼吸道病原體，為臨床診斷提供實驗室依據，預防院內感染。對于病毒性呼吸道感染的診斷，病毒培養法、直接熒光抗體法等傳統方法依然是實驗室診斷的的常用方法。病毒培養法雖然特異性良好，但耗時耗力，難以應用于臨床早期診斷和指導治療，一些病毒培養條件苛刻甚至不能培養。直接熒光抗體法(DFA)雖然快速，但需要專業的技術人員，特異性的抗體等。由于傳統病毒診斷技術存在明顯缺陷，其在臨床中的應用受限。隨著分子生物學的進步，核酸擴增法近年來被認為是是簡便、快速、靈敏、特異性強的病毒檢測方法。多重PCR是在常規PCR基礎上改進并發展起來的一種新型PCR技術，能夠同時擴增出多條目的DNA片段，從而實現多病原體的快速鑒別和診斷，降低檢驗成本。為了在單個反應體系中同時檢測更多常見呼吸道病毒，以實現快速、靈敏、特異的檢測呼吸道病毒混合感染，本研究建立了基于GeXP多重基因表達遺傳分析系統的多重逆轉錄聚合酶鏈反應(MultiplexRT-PCR)體系同時快速檢測常見的16種呼吸道病毒FluA、FluB、sHlNl、PIVl、PIV2、PIV3、RSVA、RSVB、HRV、HMPV、HBoV、CoV NL63、CoV 0C43、CoV 229E、CoVHKUl和Adv，并對該方法的特異性和敏感性進行了分析
發明內容
I.在 NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/nucleotide/)下載上述 16 種呼吸道病毒代表株的核苷酸序列，通過查閱文獻和多序列比對，確定病原體相對保守區，輸入GeXPeXpress Prof iler軟件設計多重特異性引物(Specif ic-Primer, SP-Primer)。將設計的引物通過NCBI Primer-Blast, Primer Premier 5. O分析評價,使各引物具有相對一致的Tm值。參考多序列比對結果，在突變位置設置簡并堿基。在全部正向引物和反向引物的5’端分別加入一段非同源性序列作為通用引物(Tag)，構成特異性嵌合引物。上游通用引物標簽的5’端標記熒光染料Cy5(Cy5-Tag_F)。在整個引物體系中加入一對擴增人類RNase P基因的引物Rnasep (F/R)，以檢驗人源樣品質量。引物信息見表I。2.建立了如下的檢測過程，詳見如下(I)合成引物引物均由上海Invitrogen公司合成，除Cy5-Tag_F采用HPLC純化夕卜，其余引物均PAGE純化。(2)使用QIAamp Viral RNA Mini Kit提取病毒RNA，洗脫體積為50 μ 1，分裝置 于-80°C保存。(3)建立同時檢測16種呼吸道病毒的多重RT-PCR反應體系，并對其特異性和靈敏度進行驗證。(4)用該18重RT-PCR檢驗臨床標本，對體系進行驗證評估。(5)將18對引物分成兩個體系，每個體系分別檢測9種、7種病毒，用QIAxcel全自動電泳儀檢測RT-PCR產物，為體系推廣做評定。表I GeXP 18重RT-PCR檢測16種呼吸道疾病相關病毒引物信息表
權利要求
1.一種單管18重PCR同時檢測16種呼吸道病毒，包括用于檢測呼吸道病毒FluA、FluB、PIVl、PIV2、PIV3、RSVA、RSVB、HRV、HMPV、HBoV、CoV NL63、CoV 0C43、CoV 229E、CoVHKUU Adv的型特異性引物和檢測sHlNl的亞型特異性引物，另外包括一對擴增人類RNaseP基因的引物檢驗人源樣品質量。
2.雙管多重(10重和9重)PCR同時檢測16種呼吸道病毒，體系A包括FluA、FluB、sHlNl、PIVl、HRV、CoV 0C43、CoV 229E、CoV HKUl、Adv 和 RNase P 引物，體系 B 包含 PIV2、PIV3、RSVA, RSVB, CoVNL63、HMPV, HBoV 和 RNase P 引物，用 QIAxcel 全自動電泳儀檢測。
3.權利要求I所述的18重PCR技術的引物和通用引物包括核酸序列表所列的基因序列及其每種序列的互補序列或變體。
4.權利要求I所述的18重PCR檢測技術包括呼吸道疾病相關病毒FluA、FluB、PIVl、PIV2、PIV3、RSVA、RSVB、HRV、HMPV、HBoV、CoV NL63、CoV 0C43、CoV 229E、CoV HKUl、Adv和sHlNlo
5.權利要求2所述的雙管多重PCR檢測技術分別包括呼吸道疾病相關病毒FluA、FluB、sHlNl、PIV1、HRV, CoV0C43、CoV229E、CoVHKUU Adv 和 PIV2、PIV3、RSVA, RSVB,CoVNL63、HMPV、HBoV。
6.權利要求4所述的本發明的應用范圍包括各級疾病預防控制機構，哨點醫院用于呼吸道疾病相關病毒 FluA、FluB、PIVl、PIV2、PIV3、RSVA, RSVB, HRV, HMPV, HBoV, CoVNL63、CoV0C43、CoV 229E、CoV HKUl、Adv 和 sHlNl 同時檢測和分型。
7.權利要求I所述的同時檢測呼吸道疾病相關病毒FluA、FluB、PIVUPIV2、PIV3、RSVA, RSVB, HRV, HMPV, HBoV, CoV NL63、CoV 0C43、CoV 229E、CoV HKUl、Adv 和 sHlNl 的多重PCR技術的反應程序和檢測程序。
全文摘要
本發明屬于生物技術應用領域，涉及各級疾病預防控制機構、哨點醫院等用于呼吸道相關疾病患者鼻咽抽提物標本的16種呼吸道病毒(包括FluA、FluB、sH1N1、PIV1、PIV2、PIV3、RSVA、RSVB、HRV、HMPV、HBoV、CoV NL63、CoV OC43、CoV 229E、CoV HKU1和Adv)感染的同時檢測和分型。具體在NCBI下載16種呼吸道病毒代表株的核苷酸序列，通過查閱文獻和多序列比對，確定病原體相對保守區，設計多重特異性引物。進行單管多重(18重)PCR檢測16種呼吸道病毒保守區，整個反應不到2個小時。本專利既克服了常規單管多重熒光定性PCR檢測不能分型的缺點，也克服了常規芯片檢測方法的操作繁瑣，時間較長，成本較高等缺點，為呼吸道病毒分型技術提供了新的思路，其高特異性、高靈敏度、快速的特點為呼吸道疾病相關病毒的快速準確篩查和分型提供了有力的技術支撐，對研究我國呼吸道病患者感染病原譜和分子流行病學調查有重要意義。
文檔編號C12R1/93GK102839223SQ20111016872
公開日2012年12月26日 申請日期2011年6月22日 優先權日2011年6月22日
發明者馬學軍, 李瑾, 毛乃穎, 許文波, 譚文杰 申請人:中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所