專利名稱：：檢測洋蔥腐爛病菌的核苷酸序列和試劑盒的制作方法
技術領域：
：本發明涉及檢測洋蔥腐爛病菌的核苷酸序列和試劑盒，屬于植物檢驗檢疫領域。
背景技術：
：洋蔥腐爛病菌QBurkholderiagladioliρv.aWiicoh)隸屬于原核生物界(Procaryoces)、薄壁菌門(Gracilicutes)、腸桿菌禾斗(Enterobacteriaceae)、伯克霍爾德菌屬(Burkholderia)、唐菖蒲伯克霍爾德菌(Murkholderiagladioli)。唐菖蒲伯克霍爾德嵬〔Burkholderiagladioli)是一種引起唐菖蒲球莖腐爛的病原菌，Severini在1913年的文獻中最早描述了這種病原菌，并將其命名為作洲而膨/？浙gladioli01992ip，Pseudomonasgladioli與胃它7^{同屬于fiUfi屬(.Pseudomonas)rRNAGroupII的菌種一起被劃分到了一個新屬——伯克霍爾德菌屬Ofcrf^Aferia),從而被命名為Burkholderiagladioli。洋蔥腐爛病菌最初只是被當成一種植物病原菌。寄主植物主要是蔥屬植物{Alliumc^a)和郁金香屬(TWiA3spp.)。主要致病癥狀是鱗莖的內部鱗片腐爛，初期外觀看不到癥狀，但后期整個鱗莖變軟，可看到大量細菌分泌物。在葉片上也可產生干燥的壞死斑。洋蔥腐爛病菌侵染洋蔥葉片后，一到兩片葉片會枯萎變白，并且脫落，病原菌由葉片再侵染至球莖。受侵染的洋蔥鱗球莖，先期外部無明顯特征，只在鱗球莖頸部出現腐爛，剖開后，發現內部一到兩個小鱗莖已呈水浸狀。后期肉質鱗狀組織出現水浸狀，由白黃色變為淺褐色，逐漸腐爛變軟，在病害發病后期會有粘性、腐爛難聞液體流出，直至整個球莖變干、枯萎。田間發病率可達到89.1%。傳播途徑包括帶菌種子、鱗球莖，土壤等。1985年，Christenson^ΜΜΙBurkholderiagladioli感染囊性纖維化(CF，CisticFibrosis)病人呼吸道的病例。接著，陸續在慢性肉芽腫和免疫功能減弱的病人體RM7Burkholderiagladioli.Burkholderiagladioli感染的病癥還包括敗血病、膿腫、骨髓炎、角膜炎和淋巴腺炎。^zr姑Weriagladioli可能主要導致CF病人的急性感染以及肺移植術后的血液感染，目前還沒有^zr姑Weria^/ai/iWi在病人與病人之間傳播的報道。洋蔥腐爛病菌是引起洋蔥腐爛的高風險檢疫性病菌，其準確檢測和鑒定在檢驗檢疫工作中具有重要意義。鑒于我國目前沒有洋蔥腐爛病的發生危害報道，為了減少境外洋蔥腐爛病菌傳入的風險、保護公眾健康，本發明研究開發出一種特異的洋蔥腐爛病菌檢測技術。
發明內容本發明要解決的第一個技術問題是提供檢測洋蔥腐爛病菌的核苷酸序列。本發明要解決的另一個技術問題是提供檢測洋蔥腐爛病菌的試劑盒。為實現上述目的，本發明采用以下技術方案檢測洋蔥腐爛病菌的熒光定量PCR檢測引物，為序列表SEQIDNo.1和SEQIDNo.2的寡核苷酸序列。檢測洋蔥腐爛病菌的熒光定量PCR探針，為序列表SEQIDNo.3的寡核苷酸序列。所述探針的5’端連接熒光報告基團FAM，3’端連接熒光淬滅基團BHQ1。本發明根據NCBI數據庫中Burkholderiagladiolipv.alliicolaITS基因序列保守區，設計并經大量篩選得到最佳引物和探針。探針5'端標記報告熒光染料6-Carboxyfluorescein(FAM)，3'端標記淬滅熒光染料BHQl。引物和探針由寶生物工程有限公司合成。上游引物PBAF:5'-GCTTCCGCTATCCAAATTACTACTTC-3'(SEQIDNo.1)；下游引物PBAR:5'-ATGACAAATGTTCGAGTCAGTTGAC-3'(SEQIDNo.2);探針為FAM_ATTGTTAAAGAACGACAGCCGATAAGCACAC-BHQ1(SEQIDNo.3)。檢測洋蔥腐爛病菌的熒光定量PCR試劑盒，該試劑盒含有檢測洋蔥腐爛病菌的熒光定量PCR檢測引物和檢測洋蔥腐爛病菌的熒光定量PCR探針；所述檢測引物為序列表SEQIDNo.1和SEQIDNo.2的寡核苷酸序列，所述探針為序列表SEQIDNo.3的寡核苷酸序列，探針的5’端連接熒光報告基團FAM，3’端連接熒光淬滅基團BHQ1。一種檢測洋蔥腐爛病菌的試劑盒，由以下組分組成(1)PCR反應液由2X反應液I^remixEXTaq、引物PBAF、引物PBAR和探針組成；反應液I^remixEXTaq的終濃度為1X，引物PBAF的終濃度為0.3uM、引物PBAR的終濃度為0.3uM，探針的終濃度為0.IuM；2X反應液I^remixEXTaq購于Takara公司；引物和探針均委托iTakara公司合成，其中，引物PBAF(引物1)為序列表SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，引物PBAR(引物2)為序列表SEQIDNO.2所示的核苷酸序列，探針為序列表SEQIDN0.3所示的核苷酸序列，探針5'端標記報告熒光染料6-Carboxyfluorescein(FAM)，3'端標記淬滅熒光染料BHQl；(2)無DNA酶的滅菌純化水用自來水兩次蒸餾，經過MilliporeMILLI-QPFPLUS純水儀純化，收取電阻率彡18.0ΜΩ.cm的水，貯于無菌瓶中。Millipore-Q純化水151bf/in2(1.034X105Pa)高壓蒸汽滅菌15分鐘；(3)陰性對照lmLX1管；研磨無菌健康洋蔥鱗球莖，用0.01mol/LpH7.2PBS緩沖鹽溶液制成20%懸液，121°C滅活30min；(4)陽性對照=ImLXl管；為含有洋蔥腐爛病菌ifea核糖體基因保守區序列(SEQIDN0.4)的重組質粒，Ct值為22.0沘.0。陽性對照的制備方法為用SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示的引物序列對洋蔥腐爛病菌進行PCR反應，回收PCR擴增產物，獲得高純度的138bp核糖體基因保守區序列(SEQIDNo.4)，與pGEM-Teasy載體(購自Promega公司)進行連接，轉化Ε.coliCompetentCellsDH5α感受態細胞(購自Promega公司)，使用TakaraMiniBESTPlasmidPurificationKitVer2.O(購自TaKafci公司)質粒提取試劑盒提取DNA，經PCR和酶切鑒定后獲得陽性重組質粒作為陽性對照，命名為pGEM-Bga。10倍連續梯度稀釋裂解液，測定Ct值，Ct值為22.O觀.O均可作為陽性對照。核糖體基因保守區序列如下(SEQIDNo.4):ATGACAAATGTTCGAGTCAGTTGACTCGAGTCTTTGTCATTGGCGATTGAGCCAGTCAGAGTGATGAGTACACAAGTGTGCTTATCGGCTGTCGTTCTTTAACAATCTAGAAGAAGTAGTAATTTGGATAGCGGAAGC。本試劑盒還可以含有細菌基因組DNA提取試劑，其目的是從培養的待測細菌中提取得到基因組DNA，屬于本領域常規操作。多種商業來源的細菌基因組DNA提取試劑盒均可滿足要求。例如本發明還可以包括(5)細菌基因組DNA提取試劑盒購自TIANGEN公司，貨號DP302-02。本研究建立的實時熒光定量PCR檢測方法能在搖培12h后，從模擬的最低含菌量的洋蔥種子中檢出洋蔥腐爛病菌。研究表明，在3000粒洋蔥種子表面，最低帶菌量118個、制樣時完全被從種子表面洗脫下來的情況下，通過本發明建立的實時熒光定量PCR檢測方法能夠快速有效地檢出洋蔥腐爛病菌。本發明的優點是本發明建立了特異、靈敏、快速的TaqMan探針熒光定量PCR方法和試劑盒用于檢測洋蔥腐爛病菌。利用洋蔥腐爛病菌保守基因序列設計引物和TaqMan探針并進行篩選，優化PCR反應條件和體系，對BurkholderiagladioliW.alIiicola菌、對照菌進行檢測，驗證該方法和試劑盒的特異性、敏感度、重復性等。該方法利用高特異性引物對目的基因進行擴增，實現了快速、高特異性和高靈敏度的結合，檢測靈敏度達1個拷貝/反應，反應時間僅需1h左右。實驗結果表明該方法和試劑盒適合于口岸對洋蔥腐爛病菌的快速檢測。以下通過實施例和說明書附圖詳細說明本發明技術方案，并不以此限定本發明的實施范圍。圖1為實施例1的熒光定量PCR標準曲線。圖2為實施例1的Burkholderiagladiolipv.alliicola菌iTaciMan探針熒光定量PCR特異性檢測結果。圖3為實施例IBurkholderiagladiolipv.alliicola菌TaqMan探針熒光定量PCR靈敏度檢測結果。圖4為實施例3各個梯度不同時間點熒光定量PCR檢測結果。圖5為實施例3各個梯度不同時間點熒光定量PCR檢測結果。具體實施例方式實施例1洋蔥腐爛病菌的熒光定量PCR檢測一.材料與方法1.材料試劑Burkholderiagladiolipv.alliicolaATCC20157、ATCC20159、ATCC20160、ATCC20161由美國CampbellVegetableResearch&DevelopmentCenter的HasanBolkan博士提共。BurkholderiaandropogonisATCC23060,BurkholderiacaryohpyATCC11441,BurkholderiaglumaeATCC33617購自中國菌種保藏中心。^/rlCepaciaY3,Burk.MultivoransPW99,Burk.cenocepaciaY10,Burk.cenocepacia317,Burk.stabilisJlOO,Burk.vietnamiensis419,Burk.anthinaYP46,Burk.pyrrocinia？m，Burk.arborismi,Burk.seminalisMb,Burk.contaminansY4DNA由浙江大學謝關林教授提供。細菌培養使用NA培養基、反應液ft~emiXEXTaq等試劑均購自Takara公司；PCR所用探針引物合成自Takara公司。2.儀器SLAN熒光定量PCR儀，超低溫冰箱(Thermo)，超凈臺(蘇凈集團)，培養箱(Memmert)。3.特異性探針及引物設計根據NCBI數據庫中Burkholderiagladiolipv.alliicola核糖體基因序列保守區，設計引物和探針。探針5'端標記報告熒光染料6-Carboxyfluorescein(FAM)，3'端標記淬滅熒光染料BHQ1。引物和探針由寶生物工程有限公司合成。上游引物PBAF:5,-GCTTCCGCTATCCAAATTACTACTTC-3'；下游引物PBAR5'-ATGACAAATGTTCGAGTCAGTTGAC-3‘；探針為FAM-ATTGTTAAAGAACGACAGCCGATAAGCACAC-BHQ1。4.標準曲線將搖培的菌懸液進行10倍倍比稀釋作為標準品，采用3MPetrifilm菌落總數測數片對菌懸液進行計數，分別取1PL做模板，在最佳反應條件下進行定量擴增，利用熒光定量PCR儀配套軟件繪制以初始模板濃度的對數為X軸，Ct值為Y軸的標準曲線。5.熒光定量PCR特異性檢測熒光定量PCR擴增體系和反應條件總反應體系為20μ，包括PremixEXTaq10PL，上游引物0.5μ，下游引物0.5μ，探針0.3μ，模板菌液1μ(模板DNA采用TIANGEN公司的細菌基因組DNA提取試劑盒提取)，用ddH20補足至20μ。反應條件為95"C5mins，l個循環；95"C5s；60"C20s，40個循環。選取細菌菌液為模板進行姑oAferiagladiolipv.aBiicoh菌特異性檢測，陰性對照選取伯克氏菌屬的菌株作為參比菌株。6.熒光定量PCR靈敏度檢測用滅菌水按十倍梯度稀釋姑Weriagladiolipv.alliicola菌液進行相對靈敏度檢測，取1PL菌液進行PCR檢測，并同時取相同量菌液涂布平板，30°C培養36h后進行單菌落計數，以確定每稀釋倍所含菌量。二.結果與分析1.標準曲線5個梯度的菌懸液，在最佳反應條件下進行實時熒光定量PCR擴增，利用熒光PCR儀配套軟件生成擴增反應標準曲線和直線回歸方程。標準曲線方程為y=-3.416x+44.287,r=-0.9999。標準曲線表明，菌懸濃度在1.02X107cfu/mL1.02X103cfu/mL范圍內與Ct值之間呈良好的線性關系，熒光定量PCR的擴增效率為96.3%，也就是說，每個循環的重點，擴增子的拷貝數增加1.96倍，或96.3%的模板被擴增。標準曲線見圖1。2.供試的4株洋蔥腐爛病菌(ATCC20157、ATCC20159、ATCC20159、ATCC20159)、14種洋蔥腐爛病菌近似種(BurkholderiaandropogonisATCC23060，BurkholderiacaryohpyATCC11441,BurkholderiaglumaeATCC33617,Burk.CepaciaY3,Burk.MultivoransPff99,Burk.cenocepaciaY10,Burk.cenocepacia317,Burk.stabilisJ100,Burk.vietnamiensis419,Burk.anthinaYP46,Burk.pyrrocinia301,Burk.arborisHT1,Burk.seminalisR45,Burk.contaminansY4)在相同條件下進行TaqMan探針熒光定量PCR檢測。該方法中4株洋蔥腐爛病菌均有明顯的擴增曲線生6成，說明本試驗TaqMan探針及引物具有高特異性(圖2)。3.靈敏度檢測結果供試的洋蔥腐爛病菌梯度菌液在同一反應中，通過細菌總數測數片測得梯度濃度依次為1.02Χ107、1·02Χ106、1·02Χ105、1·02Χ104、1·02Χ103、1·02XIO2cfu/mL以及空白對照。本試驗的檢測下限為1.02X103cfu/mL，體現了該方法的高靈敏度，如圖3所示。實施例2檢測洋蔥腐爛病菌的試劑盒一種檢測洋蔥腐爛病菌^zr姑Weriagladiolipv.aWiicoh的試劑盒，由以下組分組成(I)PCR反應液由2X反應液I^remixEXTaq、引物PBAF、引物PBAR和探針組成；反應液I^remixEXTaq的終濃度為1X，引物PBAF的終濃度為0.3uM、引物PBAR的終濃度為0.3uM，探針的終濃度為0.IuM；2X反應液I^remixEXTaq購于Takara公司；引物和探針均委托iTakara公司合成，其中，引物PBAF(引物1)為序列表SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，引物PBAR(引物2)為序列表SEQIDNO.2所示的核苷酸序列，探針為序列表SEQIDNO.3所示的核苷酸序列，探針5'端標記報告熒光染料6-Carboxyfluorescein(FAM)，3'端標記淬滅熒光染料BHQl。(2)無DNA酶的滅菌純化水用自來水兩次蒸餾，經過MilliporeMILLI-QPFPLUS純水儀純化，收取電阻率彡18.OMΩ.cm的水，貯于無菌瓶中。MiIlipore-Q純化水15Ibf/in2(1.034X105Pa)高壓蒸汽滅菌15分鐘。(3)陰性對照lmLX1管；研磨無菌健康洋蔥鱗球莖，用0.01mol/LpH7.2PBS緩沖鹽溶液制成20%懸液，121°C滅活30min。(4)陽性對照=ImLXl管；為含有洋蔥腐爛病菌ifea核糖體基因保守區序列(SEQIDN0.4)的重組質粒，Ct值為22.0沘.0。陽性對照的制備方法為用SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示的引物序列對洋蔥腐爛病菌進行PCR反應，回收PCR擴增產物，獲得高純度的138bp核糖體基因保守區序列(SEQIDNo.4)，與pGEM-Teasy載體(購自Promega公司)進行連接，轉化Ε.coliCompetentCellsDH5α感受態細胞(購自Promega公司)，使用TakaraMiniBESTPlasmidPurificationKitVer2.O(購自TaKafci公司)質粒提取試劑盒提取DNA，經PCR和酶切鑒定后獲得陽性重組質粒作為陽性對照，命名為pGEM-Bga。10倍連續梯度稀釋裂解液，測定Ct值，Ct值為22.0觀.0均可作為陽性對照。(5)細菌基因組DNA提取試劑盒購自TIANGEN公司(天根生化科技(北京)有限公司)，貨號DP302-02。操作流程詳細說明如下1.切去洋蔥鱗球莖的部分腐爛組織或者病健交界處組織，放入滅菌的研缽中，加入適量的0.8%的生理鹽水，充分研磨，用移液器吸取研磨液轉入1mLEP管中，1500rpm3000rpm低速離心去除大的顆粒，將上清液轉入另一干凈的1mLEP管中，13000rpm高速離心，棄上清液，加入100μL滅菌水重懸沉淀，進行劃線涂板培養；從平板培養基上挑取疑似單菌落接種至14mL的液體培養基中過夜培養。2.取14mL的過夜培養菌液，10,000rpm離心2分鐘，棄上清。3.按照細菌基因組DNA提取試劑盒(購自TIANGEN公司)說明書操作提取、純化得到菌液模板DNA。4.熒光定量PCR擴增體系和反應條件總反應體系為20μ，包括IX反應液I^remixEXTaq10μ,上游引物0.5μ(0.3uM)，下游引物0.5μ(0.3uM)，探針0.3μ(0.luM)，菌液模板DNA1μ(步驟3試劑盒提取得到)，用無DNA酶的滅菌純化水補足至20μ。按上述的PCR反應體系配制反應體系，放入熒光定量PCR儀中進行反應，程序設置為95"C5mins，l個循環；95"C5s；60°C20s，40個循環。對待檢樣品進行檢測時，每次試驗應設陰性對照和陽性對照，反應體系中菌液模板DNA分別用陰性對照和陽性對照替代。陰性對照用于判定反應體系及整個操作過程是否受污染，陽性對照用于判定整個反應過程的有效性。5.結果判定反應結束后，根據Ct值判斷反應結果，Ct值在36個循環以內判定為陽性，Ct值超過36個循環判定為陰性。其中，陰性對照Ct值應為無或至少大于36個循環，陽性對照Ct值應處于2228個循環范圍內，陰性對照或陽性對照任何一個不滿足要求，則整個檢測過程判定為無效。實施例3檢測洋蔥腐爛病菌的試劑盒(I)PCR反應液由2X反應液I^remixEXTaq、引物PBAF、引物PBAR和探針組成；反應液I^remixEXTaq的終濃度為1X，引物PBAF的終濃度為0.3uM、引物PBAR的終濃度為0.3uM，探針的終濃度為0.IuM；2X反應液I^remixEXTaq購于Takara公司；引物和探針均委托iTakara公司合成，其中，引物PBAF(引物1)為序列表SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，引物PBAR(引物2)為序列表SEQIDNO.2所示的核苷酸序列，探針為序列表SEQIDNO.3所示的核苷酸序列，探針5'端標記報告熒光染料6-Carboxyfluorescein(FAM)，3'端標記淬滅熒光染料BHQl。(2)無DNA酶的滅菌純化水用自來水兩次蒸餾，經過MilliporeMILLI-QPFPLUS純水儀純化，收取電阻率彡18.OMΩ.cm的水，貯于無菌瓶中。MiIlipore-Q純化水15Ibf/in2(1.034X105Pa)高壓蒸汽滅菌15分鐘。(3)陰性對照lmLX1管；研磨無菌健康洋蔥鱗球莖，用0.01mol/LpH7.2PBS緩沖鹽溶液制成20%懸液，121°C滅活30min。(4)陽性對照=ImLXl管；為含有洋蔥腐爛病菌ifea核糖體基因保守區序列(SEQIDN0.4)的重組質粒，Ct值為22.0沘.0。陽性對照的制備方法同實施例2。本試劑盒的使用方法同實施例2，其中待測的細菌基因組DNA可采用本領域公知技術或通過任何市售的基因組提取試劑盒獲得。實施例4用實施例2的試劑盒模擬帶菌種子制樣液的制備及熒光定量PCR檢測一.材料與方法1.材料試劑Burkholderiagladiolipv.alliicolaATCC20157，進口洋蔥種子(以色列)，實施例2的試劑盒(北京出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心提供)。2.儀器設備SLAN熒光定量PCR儀，超凈臺(蘇凈)，培養箱(Memmert)。3.菌懸液制備培養30mLBurkholderiagladioliρv.aWiicoh菌懸液，將搖培的菌懸液進行10倍梯度倍比稀釋，采用3MPetrifilm菌落總數測數片對菌懸液進行計數，每個梯度取100PL，做三個重復，將測試片置于觀°C溫箱中培養72h，取出計算測試片所有紅色菌落的數目(不論大小和顏色深淺)，同一梯度三個重復的平均值乘以稀釋度作為菌懸液的濃度。4.模擬帶菌種子制樣液的制備及熒光定量PCR檢測(1)將搖培的菌懸液進行10倍梯度稀釋至10°cfu/mL，每個梯度100mL，在每個梯度菌懸液中加入3000粒不含包衣的洋蔥種子，然后放在觀°C培養箱中搖培，每個梯度取1mL搖培液加入1.5mLEP管中低速離心，去除大的雜質顆粒，然后高速離心沉淀，去掉上層液體，用100PL無菌水重懸沉淀，制成菌懸液，每個梯度菌懸液各取1PL作為模板，按照實施例2試劑盒使用方法進行熒光定量PCR檢測。(2)將含洋蔥種子的各個梯度的菌懸液分別搖培6h、12h、24h，分別取不同時間點的搖培液進行熒光定量PCR，同時取不同時間點的搖培液各1mL進行，加入1.5mLEP管中低速離心，去除大的雜質顆粒，然后13000rpm高速離心沉淀，去掉上層液體，用100μ無菌水重懸沉淀，制成菌懸液，每個梯度菌懸液各取1PL作為模板，進行熒光定量PCR檢測，以比較不同搖培時間的差別。二.結果(1)不同時間點搖培液檢測結果取0h、6h、12h、24h不同時間點的搖培液1μ，按實施例2操作方法進行熒光定量PCR檢測結果，各個梯度各個時間點的熒光定量PCR檢測結果見圖4，各個梯度各個時間點的熒光定量PCR檢測Ct值見表1。從檢測結果的Ct值可以看出，同一梯度不同時間點的熒光定量PCR檢測Ct值基本以3個Ct左右增加，在熒光擴增效率100%的情況下，模板濃度相差十倍，則Ct值相差約3.32，建立的熒光定量PCR體系擴增效率為96.3%，也就是說大致可以判斷在不同時間點菌體濃度是以十倍的比例增加。加入的搖培液為100mL，菌懸液計數結果顯示搖培菌懸液濃度為1.18X108CFU/mL，也就是說梯度稀釋搖培液最低含菌量為118個，從熒光定量PCR檢測結果可以看出，建立的熒光定量PCR體系，能在搖培Mh后從含菌量為118個的模擬帶菌種子樣品中檢出^zr姑οAferiagladioli爐.alliicola。權利要求1.檢測洋蔥腐爛病菌的熒光定量PCR檢測引物，其特征在于為序列表SEQIDNo.1和SEQIDNo.2的寡核苷酸序列。2.檢測洋蔥腐爛病菌的熒光定量PCR探針，其特征在于為序列表SEQIDNo.3的寡核苷酸序列。3.根據權利要求2所述的檢測洋蔥腐爛病菌的熒光定量PCR探針，其特征在于所述探針的5’端連接熒光報告基團FAM，3’端連接熒光淬滅基團BHQ1。4.檢測洋蔥腐爛病菌的熒光定量PCR試劑盒，其特征在于該試劑盒含有檢測洋蔥腐爛病菌的熒光定量PCR檢測引物和檢測洋蔥腐爛病菌的熒光定量PCR探針；所述檢測引物為序列表SEQIDNo.1和SEQIDNo.2的寡核苷酸序列，所述探針為序列表SEQIDNo.3的寡核苷酸序列，探針的5’端連接熒光報告基團FAM，3’端連接熒光淬滅基團BHQ1。5.檢測洋蔥腐爛病菌的熒光定量PCR試劑盒，其特征在于由以下組分組成(1)PCR反應液由2X反應液I^remixEXTaq、引物PBAF、引物PBAR和探針組成；其中，引物PBAF為序列表SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，引物PBAR為序列表SEQIDNO.2所示的核苷酸序列，探針為序列表SEQIDNO.3所示的核苷酸序列，探針5'端標記報告熒光染料FAM，3‘端標記淬滅熒光染料BHQl；(2)無DNA酶的滅菌純化水；(3)陰性對照lmLX1管；研磨無菌健康洋蔥鱗球莖，用0.01mol/LpH7.2PBS緩沖鹽溶液制成20%懸液，121°C滅活30min；(4)陽性對照=ImLXl管；為含有洋蔥腐爛病菌ifea核糖體基因保守區序列SEQIDNO.4的重組質粒，Ct值為22.0沘.0。6.根據權利要求5所述的檢測洋蔥腐爛病菌的熒光定量PCR試劑盒，其特征在于所述反應液I^emixEXTaq的終濃度為1X，引物PBAF的終濃度為0.3uM、引物PBAR的終濃度為0.3uM，探針的終濃度為0.luM。7.根據權利要求5所述的檢測洋蔥腐爛病菌的熒光定量PCR試劑盒，其特征在于所述陽性對照的制備方法為用SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示的引物序列對洋蔥腐爛病菌進行PCR反應，回收PCR擴增產物，獲得高純度的138bp核糖體基因保守區序列SEQIDNo.4，與pGEM-Teasy載體進行連接，轉化Ε.coliCompetentCellsDH5α感受態細胞，使用TakaraMiniBESTPlasmidPurificationKitVer2·0質粒提取試劑盒提取DNA，經PCR和酶切鑒定后獲得陽性重組質粒作為陽性對照，命名為pGEM-Bga；10倍連續梯度稀釋裂解液，測定Ct值，Ct值為22.0觀.0者作為陽性對照。8.根據權利要求5或6或7所述的檢測洋蔥腐爛病菌的熒光定量PCR試劑盒，其特征在于該試劑盒還含有(5)細菌基因組DNA提取試劑盒。全文摘要本發明公開了檢測洋蔥腐爛病菌的核苷酸序列和試劑盒，屬于植物檢驗檢疫領域。檢測洋蔥腐爛病菌的熒光定量PCR檢測引物，為序列表SEQIDNo.1和SEQIDNo.2的寡核苷酸序列。本發明的優點是通過本發明建立的實時熒光定量PCR檢測方法和試劑盒能夠特異、靈敏、快速地檢出洋蔥腐爛病菌。文檔編號C12Q1/68GK102230015SQ201110168198公開日2011年11月2日申請日期2011年6月21日優先權日2011年6月21日發明者呂玉峰,周琦,李子龍,李建光,梁新苗,江麗輝,汪萬春,王中康,王文靜,邊勇,鄧叢良,高文娜,黃魁建申請人:北京出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心