專利名稱：一種胎鼠皮層神經元的原代無血清培養方法
技術領域：
本發明涉及醫學領域，具體涉及一種胎鼠皮層神經元的原代無血清培養方法。
背景技術：
培養細胞的完全培養基由基礎培養基(如MEM)和添加劑(如血清或無血清培養用的某些確定的激素及生長因子)組成。僅僅用基礎培養基進行細胞培養時，絕大多數細胞都不會存活較長時間，為了促進它們的存活和生長，必須添加額外的因子，比如激素、轉運蛋白和一些痕量元素。一般來說，都選擇血清來提供這些因子。但是血清成分復雜，存在許多未知因素，有時會干擾實驗結果，掩蓋培養細胞潛在的生理功能。此外，生理狀況下，由于 血一腦屏障的存在，神經組織并不直接暴露于血漿的大部分成分中。因此，培養液中的血清成分可能干擾神經細胞正常的功能活動。血清中還含有一定的細胞毒物質和抑制物質，對細胞有去極化作用，影響細胞的功能的正常表達。
發明內容
本發明的目的在于提供了一種胎鼠皮層神經元的原代無血清培養方法，解決了現有技術中血清培養方法存在干擾、影響觀察的問題。本發明的一種胎鼠皮層神經元的原代無血清培養方法，以胰島素一轉鐵蛋白一亞硒酸鈉無血清培養基進行胎鼠皮層神經元的培養，用神經元特異性烯醇化酶染色，來鑒定胎鼠皮層神經元。優選的，所述胰島素一轉鐵蛋白一亞硒酸鈉無血清培養基中含有O. 5g/L胰島素、O. 5g/L轉鐵蛋白和O. 5mg/L亞硒酸鈉。本發明的胎鼠皮層神經元的原代無血清培養方法，具體培養步驟如下
步驟I)試劑的配制
基培液取 DMEM 高糖培養基 10g/L 15g/L、NaHCO3 2g/L 3g/L、HEPES 3g/L 5g/L,依次溶于三蒸水，定容至1000ml，抽濾除菌，置于一 25°C 一 15°C保存；
種植液按體積比計，DMEM高糖培養基90%，胎牛血清10% ；
飼養液按體積比計，DMEM高糖培養基99%，胰島素一轉鐵蛋白一亞硒酸鈉1% ； 步驟2)原代細胞的培養
培養板的處理24孔塑料培養板，每孔加入O. lmg/ml的多聚賴氨酸200μ ，靜置30分鐘后除去，用滅菌三蒸水進行沖洗后吸凈，于35°C 40°C下過夜烤干，備用，接種前用基培液再灌洗一遍；
然后，取E14-17d的Wistar大鼠，麻醉后于無菌條件下取出胎鼠，剝除胎膜放入裝有基培液的無菌皿中，取胎鼠大腦皮層；
解剖鏡下去除胎鼠大腦皮層的皮層外膜及血管組織，基培液中洗凈血污，剪碎，置于體積比為O. 125%的胰蛋白酶溶液中，35°C 40°C下消化IOmin 20min，吸除消化液，用含血清的培養基終止消化，加完全培養基反復吹打制成單細胞懸液；
用200目不銹鋼篩網進行過濾，使細胞充分分離；
取IOPL細胞懸液與等量體積比為4%的臺盼藍混勻后計數活細胞數，調整細胞密度至4Χ 106/mL，接種于涂有多聚賴氨酸的24孔培養板，每孔加50μ 細胞懸液,再分別加450μ 完全培養基，使細胞接種密度為4 X 105/mL ；
培養板置恒溫培養箱中，以37°C的環境溫度、5%C02，飽和濕度條件下進行開放培
養;
24h后，全量換體積比為1%的胰島素一轉鐵蛋白一亞硒酸鈉的無血清培養液；以后每隔2-3d進行1/2量換液； 選取不同時間點神經元在相差顯微鏡下觀察其形態變化并進行顯微攝影；
步驟3)免疫組化染色培養至第7天的細胞，進行神經元特異性烯醇化酶抗體免疫組化染色鑒定，光鏡下觀察神經元特異性烯醇化酶表達陽性細胞，計算陽性細胞百分率并進行顯微攝影。優選的，所述步驟I)中，所述DMEM高糖培養基為13. 4g/L，NaHCO3為2. 2g/L，HEPES為3. 75g/L,依次溶于三蒸水，定容至1000ml，抽濾除菌，置于一 20°C保存。優選的，所述步驟2)中，培養板的處理中，過夜烤干的環境溫度是37°C。優選的，所述步驟2)中，置于體積比為O. 125%的胰蛋白酶溶液中，是在37°C的溫度下消化15min。優選的，所述步驟2)中，是用200目的不銹鋼篩網進行過濾，使細胞充分分離。有益效果本發明的胎鼠皮層神經元的原代無血清培養方法，用無血清培養方法，建立了 Wistar胎鼠的皮層神經元體外分散培養模型，并對其進行了形態學觀察，為今后的相關研究奠定了基礎。
具體實施例方式實施例I
準備材料
DMEM高糖培養基、胰蛋白酶、HEPES購自GIBCO公司；
多聚賴氨酸、胰島素一轉鐵蛋白一亞硒酸鈉無血清培養基(ITS)購自Sigma公司；神經元特異性烯醇化酶(NSE )、即用型HIGH — SABC免疫組化試劑盒為北京中杉金橋生物技術有限公司產品。本發明的一種胎鼠皮層神經元的原代無血清培養方法，具體步驟如下
步驟I)試劑的配制
DMEM高糖培養基13.4g/L、NaHCO; 2g/L、HEPES 3. 75g/L，依次溶于三蒸水，定容至1000ml，抽濾除菌，置于一 20°C保存；
種植液按體積比計，DMEM高糖培養基90%，胎牛血清10% ；
飼養液按體積比計，DMEM高糖培養基99%，胰島素一轉鐵蛋白一亞硒酸鈉無血清培
養基1%。步驟2)原代細胞培養
(I)培養板的處理24孔塑料培養板，每孔加入O. lmg/ml的多聚賴氨酸200μ ，靜置30分鐘后除去，滅菌三蒸水沖洗，吸凈，37°C過夜烤干，備用；接種前用培養基再灌洗一遍。
(2)取E14-17d的Wistar大鼠，麻醉后于無菌條件下取出胎鼠，剝除胎膜放入裝有基培液的無菌皿中，取胎鼠大腦皮層；
解剖鏡下去除皮層外膜及血管組織，基培液中洗凈血污，剪碎，置O. 125%胰蛋白酶溶液中37°C消化15min，吸除消化液，用含血清的培養基終止消化，加完全培養基反復吹打制成單細胞懸液；
用200目不銹鋼篩網進行過濾，使細胞充分分離；
取ΙΟμ 細胞懸液與等量4%臺盼藍混勻后計數活細胞數，調整細胞密度至4XlOVmL,接種于涂有多聚賴氨酸的24孔培養板，每孔加50μ 細胞懸液，再分別加450μ 完全培養基，使細胞接種密度為4Χ 105/mL ；·
培養板置恒溫培養箱中37°C，5%C02，飽和濕度條件下進行開放培養；
24h后，全量換1%ITS的無血清培養液；
以后每隔2-3d進行1/2量換液；
選取不同時間點神經元在相差顯微鏡下觀察其形態變化并進行顯微攝影。步驟3)免疫組化染色
培養至第7天的細胞，進行神經元特異性烯醇化酶抗體免疫組化染色鑒定，光景下觀察NSE表達陽性細胞，計算陽性細胞百分率并進行顯微攝影。觀察
在倒置相差顯微鏡下觀察，剛接種的皮層神經元最初呈圓形，體積小，透亮，無突起。在培養12 24h后觀察可見大部分細胞貼壁，貼壁細胞多為圓形或橢圓形，偶見突起，周圍出現光暈。培養2-3d后可見，胞體增大，突起增多延長。培養6-7d后，神經元細胞體大而飽滿，神經細胞突起分支增多，以雙極神經元居多。細胞突起增長，有的細胞突起相互連接，神經細胞胞體呈圓形或橢圓形及多邊形不等。培養IOd后，神經細胞開始減少并退化，表現為細胞體積縮小，胞漿內出現大小不等的空泡，突起萎縮減少。第7天的細胞，NSE免疫組化染色(DAB顯色)，胞漿和突起被染成棕褐色而胞核不被染色的為陽性細胞。NSE是糖酵解過程中的一種二聚體同功酶，是神經元分化成熟的特異性標志酶，它分布在神經元的胞體、軸突和樹突部分。使用NSE特異性抗體的免疫細胞化學染色方法，能夠鑒定體外無血清培養體系中的神經元及其純度，而且能反映神經元的生長發育情況。染色后在顯微鏡下進行觀察并拍照，以三個視野中陽性神經元的數目占細胞的比例為神經元純度,經鑒定神經元純度達96. 7%左右。結論
以胰島素一轉鐵蛋白一亞硒酸鈉無血清培養基進行胚胎大鼠皮層神經元的培養，鏡下觀察結果顯示細胞生長狀態良好。同時，用神經元特異性烯醇化酶染色來鑒定神經元，以免疫化學染色，結果顯示神經元胞體飽滿，胞漿內顆粒明顯，細胞生長狀態良好，而且純度達96. 7%左右。胰島素一轉鐵蛋白一亞硒酸鈉無血清培養基中含有O. 5g/L胰島素、O. 5g/L轉鐵蛋白、O. 5mg/L亞硒酸鈉。胰島素可以促進細胞對葡萄糖和氨基酸的攝取，對大多數類型細胞的存活和生長有重要作用。鐵是一種營養細胞的必需的微量元素，為防止鐵離子的細胞毒性，通常鐵以化合物轉鐵蛋白的形式提供。硒是有助于水解過氧化物和超氧化物。結果表明ITS無血清培養基可以滿足胎鼠皮層神經元生長發育需求的營養，且該方法相對于有血清培養法具有一定的優越性，值得推廣應用。上述實施例只是為了說明本發明的技術構思及特點，其目的是在于讓本領域內的 普通技術人員能夠了解本發明的內容并據以實施，并不能以此限制本發明的保護范圍。凡是根據本發明內容的實質所作出的等效的變化或修飾，都應涵蓋在本發明的保護范圍內。
權利要求
1.一種胎鼠皮層神經元的原代無血清培養方法，其特征在于，以胰島素一轉鐵蛋白一亞硒酸鈉無血清培養基進行胎鼠皮層神經元的培養，用神經元特異性烯醇化酶染色，來鑒定胎鼠皮層神經元。
2.根據權利要求I所述的胎鼠皮層神經元的原代無血清培養方法，其特征在于，所述胰島素一轉鐵蛋白一亞硒酸鈉無血清培養基中含有O. 5g/L胰島素、O. 5g/L轉鐵蛋白和O. 5mg/L亞硒酸鈉。
3.根據權利要求I所述的胎鼠皮層神經元的原代無血清培養方法，其特征在于，具體步驟如下 步驟I)試劑的配制 基培液取 DMEM 高糖培養基 10g/L 15g/L、NaHCO3 2g/L 3g/L、HEPES 3g/L 5g/L,依次溶于三蒸水，定容至1000ml，抽濾除菌，置于一 25°C 一 15°C保存； 種植液按體積比計，DMEM高糖培養基90%，胎牛血清10% ； 飼養液按體積比計，DMEM高糖培養基99%，胰島素一轉鐵蛋白一亞硒酸鈉1% ； 步驟2)原代細胞的培養 培養板的處理24孔塑料培養板，每孔加入O. lmg/ml的多聚賴氨酸200μ ，靜置.30分鐘后除去，用滅菌三蒸水進行沖洗后吸凈，于35°C 40°C下過夜烤干，備用，接種前用基培液再灌洗一遍； 然后，取E14-17d的Wistar大鼠，麻醉后于無菌條件下取出胎鼠，剝除胎膜放入裝有基培液的無菌皿中，取胎鼠大腦皮層； 解剖鏡下去除胎鼠大腦皮層的皮層外膜及血管組織，基培液中洗凈血污，剪碎，置于體積比為O. 125%的胰蛋白酶溶液中，35°C 40°C下消化IOmin 20min，吸除消化液，用含血清的培養基終止消化，加完全培養基反復吹打制成單細胞懸液； 用200目不銹鋼篩網進行過濾，使細胞充分分離； 取IOPL細胞懸液與等量體積比為4%的臺盼藍混勻后計數活細胞數，調整細胞密度至4XlOVmL,接種于涂有多聚賴氨酸的24孔培養板，每孔加50μ 細胞懸液，再分別加450μ 完全培養基，使細胞接種密度為4Χ 105/mL ； 培養板置恒溫培養箱中，以37°C的環境溫度、5%C02，飽和濕度條件下進行開放培養；24h后，全量換體積比為1%的胰島素一轉鐵蛋白一亞硒酸鈉的無血清培養液；以后每隔2-3d進行1/2量換液； 選取不同時間點神經元在相差顯微鏡下觀察其形態變化并進行顯微攝影； 步驟3)免疫組化染色 培養至第7天的細胞，進行神經元特異性烯醇化酶抗體免疫組化染色鑒定，光景下觀察神經元特異性烯醇化酶表達陽性細胞，計算陽性細胞百分率并進行顯微攝影。
4.根據權利要求I所述的胎鼠皮層神經元的原代無血清培養方法，.其特征在于，所述步驟I)中，所述DMEM高糖培養基為13. 4g/L，NaHCO3為2. 2g/L，HEPES為3. 75g/L,依次溶于三蒸水，定容至1000ml，抽濾除菌，置于一 20°C保存。
5.根據權利要求I所述的胎鼠皮層神經元的原代無血清培養方法，其特征在于，所述步驟2)中，培養板的處理中，過夜烤干的環境溫度是37°C。
6.根據權利要求I所述的胎鼠皮層神經元的原代無血清培養方法，其特征在于，所述步驟2)中，置于體積比為O. 125%的胰蛋白酶溶液中，是在37°C的溫度下消化15min。
7.根據權利要求I所述的胎鼠皮層神經元的原代無血清培養方法，其特征在于，所述步驟2)中，是用200目的不銹鋼篩網進行過濾，使細胞充分分離。·
全文摘要
本發明公開了一種胎鼠皮層神經元的原代無血清培養方法,以胰島素－轉鐵蛋白－亞硒酸鈉無血清培養基進行胎鼠皮層神經元的培養，用神經元特異性烯醇化酶染色，來鑒定胎鼠皮層神經元。本發明的胎鼠皮層神經元的原代無血清培養方法，用無血清培養方法，建立了Wistar胎鼠的皮層神經元體外分散培養模型，并對其進行了形態學觀察，為今后的相關研究奠定了基礎。
文檔編號C12N5/0793GK102839151SQ20111016444
公開日2012年12月26日 申請日期2011年6月20日 優先權日2011年6月20日
發明者葉蓓 申請人:蘇州衛生職業技術學院