一種辣椒疫霉菌皺縮壞死蛋白PcCRN1基因克隆及其功能技術的制作方法

專利名稱：一種辣椒疫霉菌皺縮壞死蛋白PcCRN1基因克隆及其功能技術的制作方法
技術領域：
本發明屬分子生物學領域，具體地說，本發明涉及一種皺縮壞死褪綠基因PcCRNl 的分離、瞬時表達、體外突變及其沉默技術方法。此外，系統證明了該基因通過引起寄主葉片褪綠而參與病菌的致病或破壞作用。
背景技術：
近年來，辣椒疫病發生危害日趨加重，抗病性鑒定及抗病育種工作進展緩慢，病害控制長期依據化防措施，農藥對人類和環境污染日趨加重。因此，尋找或界定辣椒疫霉靶標致病因子，研制病害發生危害預警技術，建立病害化學藥劑減量防控技術措施，有效的遏止病害發生與危害，一直是分子植物病理學領域研究的技術熱點。研究表明植物病原細菌、真菌、卵菌及線蟲等與寄主互作過程中，常產生一系列的調控侵染或防衛反應的效應分子，這些效應分子主要包括兩類一類是胞質效應蛋白， 如RXLR效應蛋白和皺縮壞死蛋白(Crinkling and Necrosis protein :CRN)，主要通過附著胞或吸器等特殊結構進入植物活細胞；另一類是質外效應蛋白，主要分泌于胞外，并與胞外靶標和質外體表面受體發生作用。目前研究的效應蛋白主要有酶抑制劑(葡聚糖酶抑制蛋白GIPl和GIP2、絲氨酸蛋白酶抑制蛋白EPIl和EPI10、半胱氨酸蛋白酶抑制蛋白 EPICl 和 EPIC2)、激發子 INFl、PcF、NPP (necrosis-inducing protein)、轉谷氨酰胺酶、 CBEL(Cellulose Binding, Elicitor and Lectin-like)、RXLR 蛋白家族(ATR、Avr3a 等) 和CRN蛋白家族等。Torto等人(2003年)首次于馬鈴薯致病疫霉(Phytophthora infestans)胞外蛋白cDNA數據庫中發現了皺縮壞死蛋白基因(CRN)，其在農桿菌介導的瞬時表達體系中導致本氏煙產生皺縮壞死癥狀。CRN是一類新的效應分子，目前該類基因僅發現于疫霉屬病菌基因組中，相關研究信息很少。CRN基因由若干基因成員組成，致病疫霉(P. parasitica)中含196個CRN-like 序列，大豆疫霉(P. sojae)中含100個CRN-Iike序列，橡膠疫霉菌(P. ramorum)中含19個 CRN-like序列。而且大豆疫霉中的兩個CRN基因(PsCRN63和PsCRN115)，氨基酸序列同源性達95. 7%，但功能特性相反，PsCRN63可激發細胞壞死，而PsCRNl 15可抑制NPP基因引起的壞死癥狀，表明CRN基因成員具功能多樣性。2010年，Schornack和van Damme研究證明，CRN基因序列N-端保守基序LXLFLAK與RXLR基序功能相似，均可調控效應蛋白進入植物細胞內，但在寄主與病原菌互作過程中，CRN效應分子致病機理及作用靶標等資料甚少， 至此成為分子植物病理學領域研究的熱點。世界范圍內，植物病原卵菌易導致多種植物病害，給農業生產造成了嚴重損失，在此基礎上，以重要致病效應因子為研究對象，借助基因和蛋白操作技術，探明關鍵基因功能特性，創建其研究技術體系，預期研究具重要的理論與實踐意義。目前無公開發表過辣椒疫霉皺縮壞死蛋白靶標基因的研究信息。

發明內容
基于上述的原因，本發明提供了 1個克隆自辣椒疫霉的皺縮壞死蛋白基因PcCRNl 及其功能分析技術，特別涉及該蛋白基因的分離、瞬時表達、體外突變及其沉默突變體制備方法，證明了該基因通過引起寄主葉片產生褪綠癥狀而參與了病菌的致病或破壞作用；借助基因體外突變技術驗證了兩個保守基序對其功能的影響作用。由此證明了該基因是辣椒疫霉菌皺縮壞死基因簇的一個重要成員，本發明為進一步研制卵菌病害快速診斷與預警技術提供技術儲備。本發明提供的辣椒疫霉的皺縮壞死蛋白基因PcCRNl基因，其基因序列如Seq ID No :1所示；其蛋白質氨基酸序列為Seq ID NO :2所示。該基因編碼的農桿菌瞬時表達蛋白僅導致寄主葉片產生褪綠癥狀。該基因開放閱讀框含1092個堿基，編碼一種含有363個氨基酸的蛋白質，分子量為41. 4kDa,信號肽含有17個氨基酸(為氨基酸序列SEQ ID NO :2中1_17氨基酸)，1個 N-糖基化位點，無內含子。該基因經NCBI-BLAST在線比對，確認其屬于皺縮壞死蛋白基因。該基因的具體克隆制備方法為其步驟如下PcCRNl基因克隆具體步驟A 利用參試辣椒疫霉菌株CBS121657 (荷蘭菌種保藏中心提供)提取辣椒疫霉總 RNA,反轉錄成cDNA ；B:通過對已報道的其它卵菌中同類基因序列比對，界定該類基因的保守基序 LQLFLAK和WL，從辣椒疫霉基因組數據庫中篩選PcCRN基因，并BLAST比對分析，設計特異引物PcCRNl-F1，其序列如Seq ID No 5所示和PcCRNl-R，其序列如Seq ID No 6所示，從 cDNA中分離目的基因PcCRNl，陽性克隆測序獲得基因全長序列；本發明所述Pcnppl基因在辣椒煙草內瞬時表達的具體步驟A 根據PcCRm基因和表達載體pGR106酶切位點，設計引物，其序列如Seq ID No 11-12所示，構建PcCRNl基因PVX表達載體，將目的基因克隆至表達載體PVX-pGR106中；B 提取上述重組表達載體質粒，轉化農桿菌GV3101感受態細胞，利福平及卡那霉素篩選農桿菌抗性轉化子；C:陽性農桿菌轉化子利用LB液體培養基(含卡那霉素和利福平各50mg/ml)震蕩培養，收集菌體后，用無菌注射器將農桿菌懸浮液壓入辣椒、煙草葉片中，進行瞬時表達。本發明所述的PcCRm基因，其保守位點突變后在辣椒本氏煙葉內的瞬時表達的方法，具體步驟如下A 根據PcCRm基因的保守位點設計引物，其序列如Seq ID No :7_10所示，分別突變PcCRNl基因的保守位點LQLFLTK和WL ；B:突變序列經測序驗證后，利用引物其基因序列如Seq ID Νο:13_14構建 PVX-pGR106表達載體，提取上述重組表達載體質粒，轉化農桿菌GV3101感受態細胞，利福平及卡那霉素篩選農桿菌抗性轉化子；C 篩選的農桿菌轉化子用LB液體培養基(含卡那霉素和利福平各50mg/ml)震蕩培養，收集菌體后，用無菌注射器將農桿菌懸浮液壓入辣椒本氏煙葉片，進行瞬時表達，檢測保守位點突變效果。本發明所述的PcCRNl基因，其基因穩定沉默表達載體構建及其沉默菌株制備的方法，具體步驟如下A 根據PcCRNl基因和PHAM34酶切位點，設計特異引物pHCRNl-F，其序列如Seq ID No 15所示和pHCRNl-R，其序列如Seq ID No 16所示，構建PcCRNl基因沉默表達載體，將目的基因克隆至沉默表達載體PHAM34中；B 制備辣椒疫霉菌原生質體，并提取重組表達質粒及標記質粒PHSPNpt，按比例混合后轉化辣椒疫霉原生質體，同時以野生型辣椒疫霉菌株及僅轉化標記質粒PHSPNpt菌株為對照，篩選抗G418的轉化子；C 轉化子再培養，誘導產生游動孢子后接種辣椒葉片進行致病性測定；D 分別提取轉化子菌株及對照菌株RNA，設計PcCRNl基因特異引物RT_CRN1_F，其序列如Seq ID No :3所示和RT-CRN1-R，其序列如Seq ID No :4所示，并設計辣椒疫霉內參基因actinA特異引物RT_Actin_F，其序列如Seq ID No 17所示和RT_Actin_R，其序列如 Seq ID No 18所示，然后分別借助反轉錄PCR及熒光定量PCR檢測PcCRm基因的沉默效率；E 制備沉默轉化子游動孢子懸浮液，接種辣椒葉片，與對照組，包括野生型辣椒疫霉菌株，選自菌株CBS121657 (荷蘭菌種保藏中心提供)及轉化標記質粒PHSPN菌株相比較，檢測致病性變化。本發明所用的載體和宿住菌均為常見，pUC19為PcCRNl基因宿主載體，DH5 α為宿主細胞，PVX(pGR106)為PcCRNl基因表達載體，農桿菌GV3101為該基因的表達宿主菌， PHAM34為沉默表達載體，PHSPNpt為沉默表達的標記質粒。綜上所述，本發明提供了 1個克隆自辣椒疫霉的皺縮壞死蛋白基因PcCRNl及其功能分析技術，特別涉及該蛋白基因的分離、瞬時表達、體外突變及其沉默突變體制備方法， 證明了該基因通過引起寄主葉片產生褪綠癥狀而參與了病菌的致病或破壞作用；借助基因體外突變技術驗證了兩個保守基序對其功能的影響作用。由此證明了該基因是辣椒疫霉菌皺縮壞死基因簇的一個重要成員，本發明為進一步研制卵菌病害快速診斷與預警技術提供技術儲備。


圖1. PcCRNl基因重組表達載體示意圖；圖中Kana為卡那抗性，Sal I、Not I、SmaI和ClaI為酶切位點，PcCRNl為目的基因。圖2. PcCRNl基因煙草中瞬時表達結果灰度示意圖；圖中A =PcCRNl基因農桿菌轉化子接種煙草7天后產生褪綠癥狀(灰度圖中葉片中間發白部分)；B 空載體pGR106接種7天后無任何癥狀；圖3. PcCRNl基因辣椒葉片內瞬時表達結果灰度示意圖；圖中A =PcCRNl基因農桿菌轉化子接種辣椒葉片7天后產生明顯癥狀(灰度圖中葉片中間發白部分)；B 空載體pGR106接種7天后無任何癥狀；
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圖4. PcCRNl基因保守位點突變基因在煙草葉片內的瞬時表達結果灰度示意圖；圖中A =PcCRNl野生型基因；B =PcCRNl突變LQLFLTK位點基因；C =PcCRNl突變 WL位點基因；D =PVX空載體，均顯示接種7天后癥狀，野生型基因比突變位點基因癥狀明顯 (灰度圖中葉片發白部分)；圖5. PcCRNl基因穩定沉默RT-PCR檢測電泳結果示意圖；圖中顯示PcCRNl基因在沉默轉化子中轉錄水平M =DNA標準分子量；WT 野生型辣椒疫霉菌株；CK 轉標記質粒轉化子；9 =PcCRNl基因沉默轉化子PcCRNl-9 ；14 =PcCRNl基因沉默轉化子PcCRNl-14 ；選擇辣椒疫霉持家基因actinA為內參，actinA基因表達水平在所有參試菌株中一致；PcCRNl基因在野生型菌株和對照菌株中均呈現很高的表達量，而在沉默菌株中其表達量幾乎檢測不到；圖6. PcCRNl基因穩定沉默熒光定量PCR檢測結果示意圖；WT 野生型辣椒疫霉菌株；CK 轉標記質粒轉化子；PcCRNl-9和PcCRNl_14 目的基因沉默轉化子；PcCRNl基因在沉默菌株中表達量很低，表達量減少了 72%和77%，已成功沉默；圖7. PcCRNl基因沉默轉化子致病性測定結果灰度示意圖；圖中顯示游動孢子接種法檢測PcCRNl基因沉默轉化子致病性結果A 野生型辣椒疫霉菌株游動孢子接種2天后癥狀；B 含標記質粒的辣椒疫霉轉化子游動孢子接種 2天后癥狀；C 沉默轉化子PcCRNl-9游動孢子接種辣椒葉片2天后癥狀；D 沉默轉化子 PcCRNl-14游動孢子接種辣椒葉片2天后癥狀，E 雙蒸水處理葉片，野生型和對照菌株處理辣椒葉片均能使葉片產生水浸狀壞死病斑，而沉默菌株產生的癥狀減弱，說明PcCRNl基因沉默降低了辣椒疫霉對辣椒葉片的破壞作用，因此該基因屬辣椒疫霉的一個重要致病基因。
具體實施例方式本發明所提供的實施例，均按照常規實驗條件，如Sambrook等分子克隆實驗手冊 (New York :Gold Spring Harbor Laboratory Press，1989)，或Draper，J 等(Blackwell 禾斗學出版社，1988)所述的操作技術規程，或按制造廠商的建議實驗條件。實施例1 (基因分離及克隆)選取辣椒疫霉菌株CBS121657為參試材料，根據辣椒疫霉基因組中一個CRN基因 (命名=PcCRNl) (jgi/phycaf7/98651)序列設計特異引物 PcCRNl-F1 (其序列如 Seq ID No 5所示)和PcCRNl-R(其序列如Seq ID No :6所示)，利用PCR方法擴增篩選目的基因。1、辣椒疫霉總RNA提取(1)辣椒疫霉菌株CBS121657在液體燕麥培養基中于28°C培養3天后，取0. Ig菌絲經液氮研磨，移入Iml Trizol溶液室溫靜置5min ；(2)加入0. 2mL氯仿，充分混合混勻，4°C下12000rpm/min離心15min，吸取上清，
重復一至多次；(3)吸取上清，每Iml Trizol加入0. 25倍異丙醇和0. 25倍RNA沉淀劑，充分混勻，室溫放置 10min，4°C下 12000rpm/min 離心 IOmin ；(4)收集RNA沉淀，用75%乙醇洗滌2次，重復離心；
(5)吸盡殘存乙醇，或使殘余乙醇充分揮發；(6)力卩50-100 μ 1 DEPC處理水，將RNA溶液貯存于_70°C保存備用。2、反轉錄合成cDNA第一鏈(1)取 1-2 μ g 總 RNA,加入 ddH20 至 9. 5 μ L，75°C變性 5min，冰浴 5min，稍微離心；(2)力口 IOX擴增緩沖液2 μ L ；(3)力口 IOmmol/L dNTP 混合液 2 μ L ；(4)力口 25mmol/LMgCl2 4 μ L ；(5)加引物 Oligo-dT luL；(6)力口 RNA 酶抑制劑 0. 5 μ L ；(7)加反轉錄酶 M-MLV lyL；(8)反應液混勻后，置室溫lOmin，42°C溫浴60min，85°C水浴放置IOmin ；(9)加入180 μ L ddH20混勻，稍微離心，_20°C下保存，陰性對照3個分別是①加入第一鏈cDNA反應所需的所有試劑，不加模板RNA ；②加除反轉錄酶外的所有試劑；③加除引物外的所有試劑。3、PCR擴增獲得PcCRNl基因全長利用全長擴增引物PcCRNl-F1 (其序列如Seq ID No 5所示)和PcCRNl-R(其序列如Seq ID No 6所示)從cDNA中擴增PcCRNl基因反應體系為ddH20(32. 5 μ L)，10 Xbuffer (5 μ L)，MgCL2 (4 μ L)，dNTP (4 μ L)，上下游引物各 1 μ L, DNA (2 μ L)，TaqE (0. 5 μ L)。PCR 反應程序為95°C 4min ；94°C lmin，55°C lmin，72°C lmin，共 35 個循環；最后 72°C延伸 IOmin0取10 μ L反應產物電泳檢測并回收。將回收產物連接PEASYTtm-T3載體，連接體系為回收產物(4 μ DpEASYtm-T3 VectOr(0.4l·! 1)，25°C靜置15min，放冰上終止反應。轉化大腸桿菌感受態細胞DH5 α，轉化步驟為(1)取大腸桿菌感受態細胞DH5 α于冰上放置融化，融化后吸取50 μ 1感受態緩緩地加入到連接產物中，冰上放置30min ；(2)將混合物小心地放入42°C水浴鍋中熱激90s，快速冰上放置2min ；(3)加入400 μ 1不含抗性的LB培養基，200rpm, 37°C震蕩培養Ih以上；(4)涂到含有Amp和IPTG的LB平板上，37°C倒置，過夜培養，篩選陽性克隆，送樣測序，獲得PcCRm基因全長。實施列2 (辣椒疫霉菌皺縮壞死蛋白基因PcCRNl在辣椒、煙草葉片瞬時表達)1、PVX表達載體構建(1)設計引物結合表達載體pGR106和PcCRNl基因酶切位點設計引物(其序列如Seq ID No 11-14所示)，構建PVX表達載體。保證目的基因片斷以一個方向插入質粒中，在PcCRNl的 5’和3’端分別設計酶切位點。(2)構建PVX表達載體用帶酶切位點的引物擴增基因，采用高保真酶進行擴增，PCR反應體系為質粒 (2 μ 1) ,5 XPrime STAR Buffer (含 MgCl2) (10 μ 1) ,dNTP mixture (2. 5mM) (4 μ 1)、上游引物(Ιμ )、下游引物(1 μ 1) > Prime STAR DNA Polymerse (0· 5 μ 1)、ddH20 (31. 5 μ 1) ；PCR 反應程序為95°C預變性5min，然后94°C變性lmin，72°C 30s反應30個循環，最后72°C完全延IOmin ；PCR擴增產物，用1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測，收集正確的條帶，進行膠純化回收后待用。(3)雙酶切、連接、轉化將膠回收產物和空載體質粒用相同的酶進行雙酶切，雙酶切體系為質粒/回收產物(20μ 1)、酶 Ι(2μ 1)、酶 ΙΙ(2μ l)U0XBuffer(4y 1), ddH20(12y 1),體系混勻后37°C反應3-5h后進行純化回收。將目的基因回收產物和載體回收產物經T4連接酶于16°C下連接，連接體系為目的基因雙酶切產物(3 μ 1)、載體雙酶切產物(1μ 1)、 T4Buffer (2 μ 1)、T4DNA ligase (1 μ 1)、ddH20 (2 μ 1)，體系混勻后 16°C過夜反應。將連接產物轉化大腸桿菌感受態細胞DH5 α，步驟同前。陽性克隆篩選驗證后，送測序公司測序。2、農桿菌轉化2. 1重組質粒的提取(1)將含有質粒的大腸桿菌接種于含有適量抗生素的LB培養基中，37 °C， 220-250rpm震蕩培養至對數生長期；(2)取ImL菌液至1. 5mL的離心管中，8000rpm,離心Imin ；(3)去上清，收集菌體；(4)加入200 μ L預冷的溶液I，震蕩懸浮菌體；(5)加入400 μ L新鮮配制的溶液II，顛倒混勻，12000rpm離心5min ；(6)加入300 μ L預冷的溶液III，顛倒混勻，置冰上5min，12000rpm,離心5min，上清轉入另一只離心管中；(7)加入等體積的苯酚/氯仿/異戊醇，震蕩混勻，12000rpm離心5min ；(8)上層水相轉入另一只離心管中，加入等體積的異丙醇，混勻后室溫放置 IOmin, 12000rpm 離心 IOmin,去上清；(9)沉淀用70 %乙醇洗2次，倒置干燥；(10)用30 μ L TE (含20 μ g的RNA酶)溶解沉淀，取5 μ L電泳檢測，其余_20°C保存。2. 2凍融法轉化農桿菌(1)倒含抗生素(rif)的平板，挑取少量農桿菌GV3101劃線，28°C培養48h ；(2)挑取農桿菌單菌落接種于5ml LB液體培養基(含rif)中，28°C、200rpm/mim 培養過夜；(3)取2ml培養物于IOOml的LB液體培養基(含rif)中繼續培養，直至OD6tltl為 0. 5左右；(4)將培養物冰浴 3Omin, 4°C、5000r/min、離心 5min，棄上清；(5)用 20ml 冷的 0. 2M CaCl2 輕輕懸浮菌液，冰上放置 20min，4°C、5000r/min，離心5min，棄去上清液；(6)用2ml預冷的0. 2M CaCl2懸浮，備用；(7)取重組質粒在冰上融化，在10 μ 1質粒中加入100 μ 1農桿菌感受態，冰上放置 30min ；
(8)液氮凍融 lmin，37°C水浴 5min ；(9)加入500μ1不加抗生素的LB液體培養基，28°C，150-160r/min，震蕩培養 3-5h ；(10)將搖好的菌液涂在含有抗生素(rif，KaNa)的平板上，吹干后于28°C培養；(11)當平板上長出有點黃白色的菌落時，挑單克隆于5ml含抗生素(rif，KaNa)的 LB培養基中培養；(12)菌液有點黃白色時收集起來提質粒，PCR和酶切驗證，驗證后備用。3、農桿菌接種(1)接種前3d，用含抗生素(rif，KaNa)的LB培養基誘導帶有重組質粒的農桿菌，28°C培養48h，再用誘導培養基(90mM磷酸緩沖液PH = 7.0，90mM硫酸銨，1.5mM檸檬酸鉀，ImM硫酸鎂，0. 2%葡萄糖，0. 5%甘油)誘導之前需要加0. IM氯化鈣，IOmM MES, 200 μ M AS，25ppm KaNa, 12. 5ppm rif，將菌液稀釋 50 倍，然后 28°C誘導 24h，8000rpm/min，4°C離心 15min。再用 MMA(10mM MES PH = 5. 6，IOmM MgCl2, 200 μ M AS)培養至 OD600 = 0. 5-0. 6。(2)挑選生長24d左右的健康辣椒葉片和健康煙草葉片進行接種。用Iml的注射器(去除針頭)，從葉片背面將菌液滲透。每天進行癥狀觀察，其結果如圖2和圖3所示。實施列3 (PcCRNl基因保守位點突變后在本氏煙內瞬時表達)1、保守位點的突變根據文獻中報道的CRN基因保守序列LQLFLTK和WL，利用引物(其序列如Seq ID No :7_8所示)突變LQLFLTK，利用引物(其序列如Seq ID No :9_10所示)突變WL序列，分別將保守位點突變。2、PVX表達載體的構建(1)設計引物并構建表達載體設計帶酶切位點的引物并擴增基因，采用高保真酶進行擴增，PCR反應體系為質粒(2 μ 1) ,5 XPrime STAR Buffer (含 MgCl2) (10 μ 1)、dNTP mixture (2. 5mM) (4μ 1)、上游引物(1 μ 1)、下游引物(1 μ 1) ,Prime STAR DNA Polymerse (0. 5 μ 1) ^ddH2O (31. 5 μ 1)； PCR反應程序為95°C預變性5min，然后94°C變性lmin，72°C 30s反應30個循環，最后72°C 完全延IOmin ；PCR擴增產物，用1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測，收集正確的條帶，進行膠純化回收后待用。(3)雙酶切、連接、轉化將膠回收后的產物和空載體質粒用相同的酶同時進行雙酶切，雙酶切體系為質粒 / 回收產物(20μ 1)、酶 Ι(2μ 1)、酶 II (2 μ 1)、10 X Buffer (4 μ 1)、ddH20 (12 μ 1)，體系混勻后37。C反應3-5h后進行純化回收。將目的基因回收的產物和載體回收的產物經T4 連接酶16°C連接，連接體系為目的基因雙酶切產物(3 μ 1)、載體雙酶切產物(1μ 1)、T4 Buffer (2 μ 1)、T4 DNA ligase (1 μ 1)、ddH20 (2 μ 1)，體系混勻后 16°C過夜反應。將連接產物轉化大腸桿菌感受態細胞DH5 α，步驟同前。陽性克隆篩選驗證后，送測序公司測序。3、農桿菌轉化3.1重組質粒的提取(1)將含有質粒的大腸桿菌接種于含有適量抗生素的LB培養基中，37 °C， 220-250rpm震蕩培養至對數生長期；
(2)取ImL菌液至1. 5mL的離心管中，8000rpm，離心Imin ；(3)去上清，收集菌體；(4)加入200 μ L預冷的溶液I，震蕩懸浮菌體；(5)加入400 μ L新鮮配制的溶液II，顛倒混勻，12000rpm離心5min ；(6)加入300 μ L預冷的溶液III，顛倒混勻，置冰上5min，12000rpm,離心5min，上
清轉入另一只離心管中；(7)加入等體積的苯酚/氯仿/異戊醇，震蕩混勻，12000rpm離心5min ；(8)上層水相轉入另一只離心管中，加入等體積的異丙醇，混勻后室溫放置 IOmin, 12000rpm 離心 IOmin,去上清；(9)沉淀用70 %乙醇洗2次，倒置干燥；(10)用30 μ L TE (含20 μ g的RNA酶)溶解沉淀，取5 μ L電泳檢測，其余_20°C保存。3. 2凍融法轉化農桿菌(1)倒含抗生素(rif)的平板，挑取少量農桿菌GV3101劃線，28°C培養48h ；(2)挑取農桿菌單菌落接種于5ml LB液體培養基(含rif)中，28°C、200rpm/mim 培養過夜；(3)取2ml培養物于IOOml的LB液體培養基(含rif)中繼續培養，直至OD6tltl為 0. 5左右；(4)將培養物冰浴 30min，4°C、5000r/min、離心 5min，棄上清；(5)用 20ml 冷的 0. 2M CaCl2 輕輕懸浮菌液，冰上放置 20min，4°C、5000r/min，離心5min，棄去上清液；(6)用2ml預冷的0. 2M CaCl2懸浮，備用；(7)取重組質粒在冰上融化，在10 μ 1質粒中加入100 μ 1農桿菌感受態，冰上放置 30min ；(8)液氮凍融 lmin，37°C水浴 5min ；(9)加入500μ1不加抗生素的LB液體培養基，28°C，150-160r/min，震蕩培養 3-5h ；(10)將搖好的菌液涂在含有抗生素(rif，KaNa)的平板上，吹干后于28°C培養；(11)當平板上長出有點黃白色的菌落時，挑單克隆于5ml含抗生素(rif，KaNa)的 LB培養基中培養；(12)菌液有點黃白色時收集起來提質粒，PCR和酶切驗證，驗證后備用。4、農桿菌接種(1)接種前3d，用含抗生素(rif，KaNa)的LB培養基誘導帶有重組質粒的農桿菌，28°C培養48h，再用誘導培養基(90mM磷酸緩沖液PH = 7.0，90mM硫酸銨，1.5mM檸檬酸鉀，ImM硫酸鎂，0. 2%葡萄糖，0. 5%甘油)誘導之前需要加0. IM氯化鈣，IOmM MES, 200 μ M AS，25ppm KaNa, 12. 5ppm rif，將菌液稀釋 50 倍，然后 28°C誘導 24h，8000rpm/min，4°C離心 15min。再用 MMA(10mM MES PH = 5. 6，IOmM MgCl2, 200uM AS)培養至 0D6。。= 0. 5-0. 6。(2)挑選生長24d左右的煙草植株進行接種。用Iml的注射器(去除針頭)，從葉片背面將菌液滲透。每天進行癥狀觀察，其結果如圖4所示。
實施列4(辣椒疫霉皺縮壞死蛋白基因PcCRNl沉默突變體獲得及致病性鑒定)1、PcCRNl基因沉默表達載體的構建(1)設計引物結合表達載體PHAM34和PcCRm基因的酶切位點設計引物(其序列如kq ID No 15-16所示)，構建表達載體。(2)構建表達載體用帶酶切位點引物擴增基因，采用高保真酶進行擴增，PCR反應體系為質粒 (2 μ 1) ,5 XPrime STAR Buffer (含 MgCl2) (10 μ l)、dNTP mixture (2. 5mM) (4 μ 1)、上游引物(Ιμ )、下游引物(1 μ 1) > Prime STAR DNA Polymerse (0· 5 μ 1)、ddH20 (31. 5 μ 1) ；PCR 反應程序為95°C預變性5min，然后94°C變性lmin，72°C 30s反應30個循環，最后72°C完全延IOmin ；PCR擴增產物，用1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測，收集正確的條帶，進行膠純化回收后待用。(3)雙酶切、連接、轉化將膠回收產物和空載體質粒用相同的酶同時雙酶切，雙酶切體系為質粒/回收產物(20μ 1)、酶 Κ2μ 1)、酶 Κ2μ l)、10XBuffeH4y l)、ddH20(12y 1，體系混勻后 37 °C 反應3- 后進行純化回收。將目的基因回收的產物和載體回收的產物經T4連接酶16°C連接，連接體系為目的基因雙酶切產物(3 μ 1)、載體雙酶切產物(1 μ 1)、T4 Buffer (2 μ 1), T4 DNA ligase (1 μ 1)、(！dH2(K2 μ 1)，體系混勻后，16°C過夜反應。將連接產物轉化大腸桿菌感受態細胞DH5ci，步驟同前。陽性克隆篩選驗證后，送測序公司測序。2、質粒提取分別提取重組質粒PHAMM/PcCRNl及沉默標記質粒PHSPNpt，步驟如下(1)將含有質粒的大腸桿菌接種于含有適量抗生素的LB培養基中，37 °C， 220-250rpm震蕩培養至對數生長期；(2)取ImL菌液至1. 5mL的離心管中，8000rpm，離心Imin ；(3)去上清，收集菌體；(4)加入200 μ L預冷的溶液I，震蕩懸浮菌體；(5)加入400 μ L新鮮配制的溶液II，顛倒混勻，12000rpm離心5min ；(6)加入300 μ L預冷的溶液III，顛倒混勻，置冰上5min，12000rpm,離心5min，上清轉入另一只離心管中；(7)加入等體積的苯酚/氯仿/異戊醇，震蕩混勻，12000rpm離心5min ；(8)上層水相轉入另一只離心管中，加入等體積的異丙醇，混勻后室溫放置 IOmin, 12000rpm 離心 IOmin,去上清；(9)沉淀用70 %乙醇洗2次，倒置干燥；(10)用30 μ L TE (含20 μ g的RNA酶)溶解沉淀，取5 μ L電泳檢測，其余_20°C保存。3、PEG介導的原生質體轉化3.1辣椒疫霉活化培養(1)在NPB培養基上活化辣椒疫霉菌株CBS121657，在25°C下黑暗培養；(2)培養3-4天后，將其切成Icm2的菌絲塊向每個裝有50mL NPB培養基的250ml錐形瓶中放入6-10塊，在25°C下黑暗培養2天。3. 2辣椒疫霉原生質體轉化步驟(1)實驗前配制40%聚乙二醇-4000溶液，完全溶解后，用細菌過濾器除菌后置冰上；(2)用滅菌的200ml燒杯(帶紗布)收集菌絲，并用鑷子將菌絲放入含有0. 8M Mannitol的培養皿中漂洗一次，然后將漂洗過后的菌絲移入盛有0. 8M Mannitol的離心管中室溫下搖洗IOmin ；(3)配制20ml酶解液，在滅菌燒杯中溶解后備用；(4)通常在酶解50min時，最好不要超過60min，用事先包扎好兩層mira-cloth的 50ml燒杯來過濾菌絲收集原生質體，然后將收集好的原生質體倒入50mli^lcOn離心管中， 40C 1500rpm 離心 3min ；(5)棄上清，先加IOml左右的W5 solution輕輕重懸原生質體，再加W5 solution 至 35ml,40C 1500rpm 離心 4min ；(6)棄去上清液，先加5ml左右的W5 solution輕輕重懸原生質體，將原生質體的濃度調至2 X 106/ml，然后在冰上放置30min，在4°C 1500rpm離心^iin ；(7)棄上清，加入與第七步W5 solution相同體積的MMg solution重懸原生質體， 室溫放置IOmin ；(8)取若干支新的50ml Falcon離心管置于冰上，在管壁上作好記錄，然后向管底部加入1體積(約5 μ 1)的pHSPN質粒+3體積(10-25 μ 1)的轉化質粒，(9)向每個加好質粒的50ml Falcon離心管中加入Iml原生質體，冰置5_10min ；(10)向每個離心管加三次580 μ 1的PEG溶液，共1. 74mlPEG，在加的過程中輕輕轉動離心管，使得PEG能順著管壁流進質粒與原生質體的混合液中，加完三次后輕輕地擊管使混勻，在冰上放置20min ；(11)滅菌培養皿中加入10ml Pea/0. 5M Mannitol培養液，再加20 μ 1的Amp C
液，并在培養皿上作好記錄；(12)向每個離心管中加2ml Pea/0. 5M Mannitol培養液，并且緩慢顛倒一次，冰上放置2min ；(13)再向每個離心管中加8ml Pea/0. 5M Mannitol培養液，并且緩慢顛倒一次，冰上放置2min ；(14)將離心管中液體倒入事先加好10ml Pea/0. 5M Mannitol培養液的培養皿中， 在25°C下靜置培養，過夜再生，并將離心管保存好明日再用；(15)從過夜生長的培養皿中取5μ1在顯微鏡下鏡檢再生的情況，將培養皿中所有的液體吸到前日對應的離心管中，2000rpm離心5min ；(16)棄去上清使管內液體剩5ml左右，將其懸浮，然后加15ml含有30yg/ml G418 的PM培養基，混勻后倒入培養皿中，吹干水汽，在25°C培養；(17)兩天后，通常在培養基表面上可以看到有菌絲長出，待大部分新生菌絲長出后，用含30μ g/ml G418的PM培養基覆蓋，25°C下繼續培養；(18)約過兩三天后可以看到有菌絲從覆蓋過PM培養基上再次長出，便直接用含 50 μ g/ml G418的PM培養基再次覆蓋，在25°C下繼續培養；
(19)將重新從覆蓋的培養基里面長出小菌落挑到含50 μ g/ml G418的V8培養基上繼續培養并且篩選；(20)將最終確定為轉化子菌株用于后面實驗。3. 3RT-PCR 檢測液體培養轉化子的菌絲，提取菌絲RNA并反轉錄，通過普通PCR檢測，以actinA基因作為內參基因(其序列如^^ ID No :17-18所示)，以野生型菌株及轉化標記質粒菌株為對照。PCR 反應采用體系 % :ddH20 (32. 5 μ L), 10 X buffer (5 μ L), MgCL2 (4 μ L), dNTPGyL)，上下游引物各IyL, DNA(2 μ L), TaqE (0. 5 μ L) 0反應條件為94°C預變性 5min,然后進行以下循環；94°C變性lmin，55°C退火30s，72°C延伸30s，共進行30個循環， 最后72°C總延伸lOmin. PCR產物經1 %的瓊脂糖凝膠電泳分析。3. 4熒光定量PCR檢測普通PCR檢測后，挑選帶比較弱或無帶的轉化子進行熒光定量PCR檢測；以辣椒疫霉actinA基因為內參(序列如kq ID No :21和kq ID No :22)，以野生型菌株及轉化標記質粒菌株為對照，反應體系為2. 5XrealMasterMix及20XSTOR solution混合物 11. 25 μ L,上下游引物各 1 μ L, cDNA 模板 2 μ L, ddH20 11. 75 μ L。利用Bio-Radi Cycler進行反應，反應條件95°C預變性2min，然后進行以下循環；94°C變性15s，55°C退火15s，68°C延伸30s，共進行45個循環，最后65-95°C制備溶解曲線。選擇actinA為內參基因，每個樣品做三個重復，用2_ΔΔ"法對樣本基因進行表達差異相對定量分析。計算方法為Δ ACt = (Ct
target
~CT actinA)待測樣本— (Ct
target
~CT actinA)校準樣本，
果如圖6所示。3. 5致病性檢測制備PcCRNl沉默轉化子游動孢子懸浮液(1)將沉默轉化子菌株轉移至10% V8培養基培養4d，從菌落邊緣挑取菌絲塊移至新鮮10% V8培養基繼續培養4d備用。(2)切取菌落邊緣菌絲塊2塊，放于新鮮的10%的V8固體平板上，25°C黑暗培養 3-4d ；(3)在菌落邊緣切取2X2mm的菌絲塊，取10-20塊放于滅菌的培養皿中，加入 10%的V8液體培養基，25°C黑暗放置2-3d，可見絲發狀菌絲叢；(4)加滅菌水(以浸沒菌絲為宜)，每隔1 換水至游動孢子產生，并調節游動孢子濃度至1 X IO5個/ml，利用游動孢子懸浮液進行致病性分析。然后按照如下步驟接種辣椒葉片進行致病性測定辣椒選用自交系品種(5-6葉期)葉片，游動孢子濃度調至IX IO5個/ml。將選取葉片消毒70%乙醇處理30s，0. 升汞處理7min，于滅菌水中沖洗3次，晾干備用，晾干后將葉片平鋪于預準備水瓊脂平板，每個平板放置3片，每個葉片接種2 μ 1游動孢子懸浮液， 每個樣品接10個葉片，野生型辣椒疫霉菌、標記質粒的轉化子游動孢子懸浮液及無菌水作對照，每個實驗重復3次，每天觀察記載癥狀變化，拍照記錄，其結果如圖7所示。
1權利要求
1.辣椒疫霉菌皺縮壞死蛋白基因PcCRNl，其特征在于其基因序列如SeqID No:l所示；其氨基酸序列為SEQ ID NO :2所示，該基因編碼的農桿菌瞬時表達蛋白僅導致寄主葉片產生褪綠癥狀。
2.一種辣椒疫霉菌皺縮壞死蛋白基因PcCRNl基因分離克隆及其在辣椒煙草內瞬時表達的方法，其特征在于其步驟如下DPcCRNI基因克隆具體步驟采用CTAB法提取辣椒疫霉菌DNA，通過對已報道的其它卵菌中同類基因序列比對，界定該類基因的保守基序LQLFLAK和WL，從辣椒疫霉基因組數據庫中篩選PcCRN基因，并BLAST比對分析，設計特異引物PcCRNl-Fl，其序列如Seq ID No 5所示和PcCRNl-R，其序列如Seq ID No :6所示，分離目的基因PcCRNl，陽性克隆測序獲得基因全長序列；2)Pcnppl基因在辣椒煙草內瞬時表達的具體步驟A 根據PcCRNl基因和表達載體pGR106酶切位點，設計引物，其序列如Seq ID No: 11-12所示，構建PcCRNl基因PVX表達載體，將目的基因克隆至表達載體PVX-pGR106中； B 提取上述重組表達載體質粒，轉化農桿菌GV3101感受態細胞，利福平及卡那霉素篩選農桿菌抗性轉化子；C 陽性農桿菌轉化子利用LB液體培養基，其中含卡那霉素和利福平各50mg/ml，震蕩培養，收集菌體后，用無菌注射器將農桿菌懸浮液壓入辣椒、煙草葉片中，進行瞬時表達。
3.如權利要求1所述的PcCRm基因，其保守位點突變后在辣椒本氏煙葉內的瞬時表達的方法，其特征在于具體步驟如下A 根據PcCRNl基因的保守位點設計引物，其序列如Seq ID No :7_10所示，分別突變 PcCRNl基因的保守位點LQLFLTK和WL ；B 突變序列經測序驗證后，利用引物其基因序列如Seq ID No 13-14構建PVX_pGR106 表達載體，提取上述重組表達載體質粒，轉化農桿菌GV3101感受態細胞，利福平及卡那霉素篩選農桿菌抗性轉化子；C 篩選的農桿菌轉化子用LB液體培養基其中含卡那霉素和利福平各50mg/ml，震蕩培養，收集菌體后，用無菌注射器將農桿菌懸浮液壓入辣椒本氏煙葉片，進行瞬時表達，檢測保守位點突變效果。
4.如權利要求1所述的PcCRNl基因，其基因穩定沉默表達載體構建及其沉默菌株制備的方法，其特征在于具體步驟如下A 根據PcCRNl基因和PHAM34酶切位點，設計特異引物pHCRNl_F，其序列如SeqID No 15所示和pHCRNl-R，其序列如SeqID No 16所示，構建PcCRNl基因沉默表達載體，將目的基因克隆至沉默表達載體PHAM34中；B 制備辣椒疫霉菌原生質體，并提取重組表達質粒及標記質粒PHSPNpt，按比例混合后轉化辣椒疫霉原生質體，同時以野生型辣椒疫霉菌株及僅轉化標記質粒PHSPNpt菌株為對照，篩選抗G418的轉化子；C 轉化子再培養，誘導產生游動孢子后接種辣椒葉片進行致病性測定； D 分別提取轉化子菌株及對照菌株RNA，設計PcCRNl基因特異引物RT-CRN1-F，其序列如Seq ID No :3所示和RT-CRN1-R，其序列如Seq ID No :4所示，并設計辣椒疫霉內參基因 actinA特異引物RT_Actin_F，其序列如Seq ID No 17所示和RT_Actin_R，其序列如SeqID No 18所示，然后分別借助反轉錄PCR及熒光定量PCR檢測PcCRNl基因的沉默效率；E 制備沉默轉化子游動孢子懸浮液，接種辣椒葉片，與對照組，包括野生型辣椒疫霉菌株及轉化標記質粒PHSPN菌株相比較，檢測致病性變化。
全文摘要
本發明屬于生物技術領域，特別提供了克隆自辣椒疫霉菌的1個皺縮壞死蛋白基因PcCRN1與致病相關的研究技術，該基因表現出功能特異性，僅引起寄主葉片產生退綠癥狀。依據農桿菌瞬時表達及沉默技術，證明了該基因通過引起寄主葉片產生退綠癥狀而對寄主產生致病或破壞作用，并利用體外突變技術證明了該基因編碼的1個保守基序與其功能特性有關。因此，該技術發明提供了辣椒疫霉一個對寄主有破壞作用的新基因及其研究技術，該技術發明為研制卵菌病害快速診斷與預警技術提供技術儲備。
文檔編號C12N1/15GK102286493SQ201110162600
公開日2011年12月21日 申請日期2011年6月16日 優先權日2011年6月16日
發明者張修國 申請人:山東農業大學