專利名稱：一種單個核細胞移植前狀態的準備方法
技術領域：
本發明涉及一種單個核細胞在移植前狀態的準備方法，特別涉及臍帶血單個核細胞在進行細胞移植前狀態的準備方法。
背景技術：
細胞移植進行治療和預防疾病已經成為一門新興的學科和醫學發展的前沿科學，近來的研究表明細胞移植不僅可以治療心血管疾病、血液病、內分泌疾病、神經疾病等疑難疾病，還可以起到對疾病的預防和保健作用。細胞的種類繁多，來源多樣，有成體細胞和胚胎細胞，骨髓和外周血單個核細胞、間充質干細胞，脂肪細胞，臍帶間充質干細胞，體外誘導干細胞，臍血間充質干細胞和單個核細胞，這為探討人類的生長發育、組織細胞分裂分化、蛋白表達，基因調控等生物學問題提供了理想的模型研究系統，也為臨床組織缺陷疾病和 遺傳性疾病的細胞替代治療和基因治療開拓了新研究途徑。隨著細胞研究和應用的發展，間充質干細胞做為一種具有多向分化潛能的干細胞越來越多的應用于細胞的治療，但無論是從骨髓、臍帶血、外周血、脂肪、臍帶或是胚胎等組織提取的間充質干細胞都需要在體外經過長時間的分離、消化、培養、傳代、凍存等一系列的過程，要加入多種有利于細胞生長、保存、傳代等各種試劑，對這種長時間接觸多種試劑培養出來的細胞在最終移植入體內進行治療疾病的同時是否會對機體產生不利因素還不十分明確。人臍帶血是出生后留存在胎盤和臍帶中的血液，長期以來一直做為廢物丟棄，近幾年研究發現其中存在著大量豐富的原始干細胞，已經有許多學者對其進行了大量研究，臍帶血單個核細胞包含了臍帶血中多種原始干細胞，其來源豐富、容易采集、不需要體外培養、接觸試劑少、從采集到應用在體外存放時間短、免疫原性弱等優點受到了研究者的青睞。既有的單個核細胞采集制備方法多數是以實驗為目的，制備方法和最終的使用前狀態的準備多種多樣，在以移植為目的進行研究時各研究單位在移植前對臍帶血單個核細胞的制備和存放狀態也不一致，目前也沒有統一的標準，所以現在需要解決的問題是臍帶血單個核細胞在移植前的制備方式和制備后處于一種什么樣的狀態才能最符合細胞移植的需要，才能達到最理想的效果是我們尋找的一種方法。
發明內容
本發明要解決的技術問題是，提供一種臍帶血單個核細胞制備和移植前存放狀態的方法，按照本發明方法在細胞移植前準備的臍帶血單個核細胞在體外的時間短，接觸的試劑少，不需要培養，免疫原性弱，無污染，移植前狀態更符合體內環境，能達到最佳的移植效果。實現本發明目的的技術方案為，使用無菌的方法收集廢棄的人臍帶血，使用密度梯度法分離提取臍帶血單個核細胞，將臍帶血單個核細胞重懸后進行移植應用。分離提取臍帶血單個核細胞并制備臍帶血單個核細胞在移植前達到最佳狀態的方法為無菌收集廢棄的健康人臍帶血置于抗凝血漿收集袋中，溫度為0 8攝氏度在4小時內運送至細胞處置室，在無菌環境下根據臍帶血的體積將臍帶血移入多個50毫升離心管中，將離心管放入低速離心機中離心，轉速為1500 2500轉/分鐘，離心10 15分鐘，此時離心管中的臍帶血分為兩層上層為血漿層，下層為細胞層，將上層血漿層輕輕移入新的離心管中備用，在含剩余細胞的離心管中再加入生理鹽水，加入生理鹽水的量為剩余細胞體積的3 6倍，充分混勻，形成細胞懸液，可增加離心管的數量來進行分裝多出的液體量；在新的50毫升離心管中加入密度為I. 077的淋巴細胞分離液25毫升，再將25毫升細胞懸液沿離心管壁緩慢的加入淋巴細胞分離液的上方，使上層細胞懸液與下層淋巴細胞分離液體積的比例為I :1，分裝完成后，將離心管放入低速離心機中離心，轉速為1000 1500轉/分鐘，離心時間為25 40分鐘；此時離心管中液體分層，中間的白細胞層即為臍帶血單個核細胞層，使用移液管輕輕吸出臍帶血單個核細胞層置一新的離心管中，并在此新的離心管中加入生理鹽水，用移液管輕輕抽吸吹打，使臍帶血單個核細胞與生理鹽水充分混勻；再離心，將離心管放入低速離心機中離心，轉速為1500轉/分鐘，離心10分鐘；棄上清液；再加入生理鹽水，用移液管輕輕抽吸吹打，使臍帶血單個核細胞與生理鹽水充分混勻，形成臍帶血單個核細胞懸液，臍帶血單個核細胞懸液再離心，將離心管放入低速離心機中離心，轉速為1500轉/分鐘，離心10分鐘，棄上清；再加入生理鹽水，用移液管輕輕抽吸吹打，使臍帶血單個核 細胞與生理鹽水充分混勻，形成臍帶血單個核細胞懸液，臍帶血單個核細胞懸液再離心，將離心管放入低速離心機中離心，轉速為1500轉/分鐘，離心10分鐘，棄上清；此時余下的細胞為洗過三遍的臍帶血單個核細胞；將放置備用的血漿的三分之二體積加入裝有洗過三遍的臍帶血單個核細胞的離心管中，使用移液管輕輕抽吸吹打，使臍帶血單個核細胞與血漿充分混勻，形成臍帶血單個核細胞血漿懸液，取出0. 5毫升使用細胞計數儀進行計數，根據計數的結果，使用余下的三分之一體積的血漿調整臍帶血單個核細胞血漿懸液的濃度為
IX IO6 2 X IO6/毫升，20 40毫升臍帶血單個核細胞血漿懸液裝于一個血漿袋中密封，并同時取臍帶血單個核細胞血漿懸液2毫升進行細菌、支原體、內毒素、乙肝表面抗原、丙肝抗體、梅毒抗體、艾滋病抗體檢測；密封于血漿袋中的臍帶血單個核細胞血漿懸液于8小時內進行使用。用于準備的臍帶血單個核細胞的來源為健康產婦廢棄的臍帶血。健康產婦是指在產婦生產前所做的孕檢結果均為正常范圍，符合正常分娩條件的產婦；廢棄的臍帶血是指在分娩后臍帶血對產婦和嬰兒均無任何作用，是要做丟棄處理的。生理鹽水是指濃度為0. 9%的無菌醫用生理鹽水。無菌收集的臍帶血盛裝于抗凝血漿收集袋中于0 8攝氏度不低于4小時運送至細胞處置室。作為優化將臍帶血的血漿分離出來備用，分離時離心機轉速為1500 2500轉/分鐘，離心10 15分鐘,進入下一工序。作為優化，將離心取出血漿后的細胞層加入生理鹽水，加入生理鹽水的量為細胞層體積的3 6倍，充分混勻，形成細胞懸液，進入下一工序。作為優化，將含生理鹽水的細胞懸液加入含淋巴細胞分離液的離心管中，分離細胞時離心機的轉速為1000 1500轉/分鐘，離心時間為25 40分鐘，進入下一工序。作為優化，取出離心管中的中間白細胞層加到生理鹽水中充分混勻，再離心洗滌，離心機的轉速為1500轉/分鐘，離心時間10分鐘，棄上清，進入下一工序。
作為優化，再加入生理鹽水充分混勻，離心洗滌，離心機的轉速為1500轉/分鐘，離心時間10分鐘，棄上清，此過程共進行2遍，進入下一工序。作為優化，將備用的血漿加入離心后的細胞中充分混勻，計數，調整臍帶血單個核細胞的濃度為I X IO6 2 X IO6/毫升，每20 40毫升裝一個血漿袋中，進入下一工序。作為優化，將準備好的臍帶血單個核細胞血漿懸液在時間不大于8小時內進行應用。按本發明上述方法在臍帶血單個核細胞應用前準備的臍帶血單個核細胞表現出以下技術特征
①臍帶血單個核細胞從采集到應用時間短，最長時間不超過12小時，最短時間僅I. 5小時，不需要在體外凍存，保證了細胞的活性，細胞活力達99% 100%。
②臍帶血單個核細胞不需要在體外培養、傳代，接觸試劑種類少，降低了污染機率，減少了接觸其他試劑對細胞生存和生長的影響。③臍帶血單個核細胞經分離后再融于臍帶血血漿環境，保證了細胞生存環境統一，減少了不利因素的影響，更有利于細胞的生存和生長。④臍帶血單個核細胞血漿懸液在應用前進行安全性檢查細菌檢查陰性、支原體檢查陰性、內毒素檢查陰性、乙肝表面抗原檢測陰性，丙肝抗體檢測陰性，梅毒抗體檢測陰性，艾滋病抗體檢測陰性。臍帶血單個核細胞來源豐富、容易采集、免疫原性弱、體外經過的處理步驟少、應用范圍廣，上述臍帶血單個核細胞在應用前狀態的準備方法所處理的臍帶血單個核細胞活性高、準備時間短、無接觸過多的體外試劑、應用前環境與采集時細胞所處的環境一致、包裝規范、無生物學污染，無傳染性污染，上述技術特征可以作為按本發明方法在細胞應用前所準備的臍帶血單個核細胞的合格標準。
具體實施例方式以下列舉4個實施例，本發明的實施方法并不限于這4種。對于實施過程中實驗材料的選用、部分可調整的工藝技術參數的實際應用，以及各實施例所得成品部分檢測指標如下
實施例I :無菌收集廢棄的健康人臍帶血于抗凝血漿收集袋中，溫度為2攝氏度在I小時內運送至細胞處置室，在無菌環境下根據臍帶血的體積將臍帶血移入多個50毫升離心管中，將離心管放入低速離心機中離心，轉速為1500轉/分鐘，離心15分鐘，此時離心管中的臍帶血分為兩層上層為血漿層，下層為細胞層，將上層血漿層輕輕移入新的離心管中備用，在含剩余細胞的離心管中再加入生理鹽水，加入生理鹽水的量為剩余細胞體積的6倍，充分混勻，形成細胞懸液，可增加離心管的數量來進行分裝多出的液體量；在新的50毫升離心管中加入密度為I. 077的淋巴細胞分離液25毫升，再將25毫升細胞懸液沿離心管壁緩慢的加入淋巴細胞分離液的上方，使上層細胞懸液與下層淋巴細胞分離液體積的比例為1: 1，分裝完成后，將離心管放入低速離心機中離心，轉速為1000轉/分鐘，離心時間40分鐘；此時離心管中液體分層，中間的白細胞層即為臍帶血單個核細胞層，使用移液管輕輕吸出臍帶血單個核細胞層置一新的離心管中，并在此新的離心管中加入生理鹽水，用移液管輕輕抽吸吹打，使臍帶血單個核細胞與生理鹽水充分混勻；再離心，將離心管放入低速離心機中離心，轉速為1500轉/分鐘，離心10分鐘；棄上清液；再加入生理鹽水，用移液管輕輕抽吸吹打，使臍帶血單個核細胞與生理鹽水充分混勻，形成臍帶血單個核細胞懸液，臍帶血單個核細胞懸液再離心，將離心管放入低速離心機中離心，轉速為1500轉/分鐘，離心10分鐘，棄上清；再加入生理鹽水，用移液管輕輕抽吸吹打，使臍帶血單個核細胞與生理鹽水充分混勻，形成臍帶血單個核細胞懸液，臍帶血單個核細胞懸液再離心，將離心管放入低速離心機中離心，轉速為1500轉/分鐘，離心10分鐘，棄上清；此時余下的細胞為洗過三遍的臍帶血單個核細胞；將放置備用的血漿的三分之二體積加入裝有洗過三遍的臍帶血單個核細胞的離心管中，使用移液管輕輕抽吸吹打，使臍帶血單個核細胞與血漿充分混勻，形成臍帶血單個核細胞血漿懸液，取出0. 5毫升使用細胞計數儀進行計數，根據計數的結果，使用余下的三分之一體積的血漿調整臍帶血單個核細胞血漿懸液的濃度為I X IO6/毫升，20毫升臍帶血單個核細胞血漿懸液裝于一個血漿袋中密封，并同時取臍帶血單個核細胞血漿懸液2毫升進行檢測細菌檢查陰性、支原體檢查陰性、內毒素檢查陰性、乙肝表面抗原檢測陰性，丙肝抗體檢測陰性，梅毒抗體檢測陰性，艾滋病抗體檢測陰性；密封于血漿袋中的臍帶血單個核細胞血漿懸液于4小時內進行使用。
實施例2 :無菌收集廢棄的健康人臍帶血于抗凝血漿收集袋中，溫度為4攝氏度在2小時內運送至細胞處置室，在無菌環境下根據臍帶血的體積將臍帶血移入多個50毫升離心管中，將離心管放入低速離心機中離心，轉速為2000轉/分鐘，離心12分鐘，此時離心管中的臍帶血分為兩層上層為血漿層，下層為細胞層，將上層血漿層輕輕移入新的離心管中備用，在含剩余細胞的離心管中再加入生理鹽水，加入生理鹽水的量為剩余細胞體積的5倍，充分混勻，形成細胞懸液，可增加離心管的數量來進行分裝多出的液體量；在新的50毫升離心管中加入密度為I. 077的淋巴細胞分離液25毫升，再將25毫升細胞懸液沿離心管壁緩慢的加入淋巴細胞分離液的上方，使上層細胞懸液與下層淋巴細胞分離液體積的比例為1:1，分裝完成后，將離心管放入低速離心機中離心，轉速為1500轉/分鐘，離心時間30分鐘；此時離心管中液體分層，中間的白細胞層即為臍帶血單個核細胞層，使用移液管輕輕吸出臍帶血單個核細胞層置一新的離心管中，并在此新的離心管中加入生理鹽水，用移液管輕輕抽吸吹打，使臍帶血單個核細胞與生理鹽水充分混勻；再離心，將離心管放入低速離心機中離心，轉速為1500轉/分鐘，離心10分鐘；棄上清液；再加入生理鹽水，用移液管輕輕抽吸吹打，使臍帶血單個核細胞與生理鹽水充分混勻，形成臍帶血單個核細胞懸液，臍帶血單個核細胞懸液再離心，將離心管放入低速離心機中離心，轉速為1500轉/分鐘，離心10分鐘，棄上清；再加入生理鹽水，用移液管輕輕抽吸吹打，使臍帶血單個核細胞與生理鹽水充分混勻，形成臍帶血單個核細胞懸液，臍帶血單個核細胞懸液再離心，將離心管放入低速離心機中離心，轉速為1500轉/分鐘，離心10分鐘，棄上清；此時余下的細胞為洗過三遍的臍帶血單個核細胞；將放置備用的血漿的三分之二體積加入裝有洗過三遍的臍帶血單個核細胞的離心管中，使用移液管輕輕抽吸吹打，使臍帶血單個核細胞與血漿充分混勻，形成臍帶血單個核細胞血漿懸液，取出0. 5毫升使用細胞計數儀進行計數，根據計數的結果，使用余下的三分之一體積的血漿調整臍帶血單個核細胞血漿懸液的濃度為2X IO6/毫升，25毫升臍帶血單個核細胞血漿懸液裝于一個血漿袋中密封，并同時取臍帶血單個核細胞血漿懸液2毫升進行檢測細菌檢查陰性、支原體檢查陰性、內毒素檢查陰性、乙肝表面抗原檢測陰性，丙肝抗體檢測陰性，梅毒抗體檢測陰性，艾滋病抗體檢測陰性；密封于血漿袋中的臍帶血單個核細胞血漿懸液于I小時內進行使用。實施例3 :無菌收集廢棄的健康人臍帶血于抗凝血漿收集袋中，溫度為6攝氏度在3小時內運送至細胞處置室，在無菌環境下根據臍帶血的體積將臍帶血移入多個50毫升離心管中，將離心管放入低速離心機中離心，轉速為2500轉/分鐘，離心13分鐘，此時離心管中的臍帶血分為兩層上層為血漿層，下層為細胞層，將上層血漿層輕輕移入新的離心管中備用，在含剩余細胞的離心管中再加入生理鹽水，加入生理鹽水的量為剩余細胞體積的4倍，充分混勻，形成細胞懸液，可增加離心管的數量來進行分裝多出的液體量；在新的50毫升離心管中加入密度為I. 077的淋巴細胞分離液25毫升，再將25毫升細胞懸液沿離心管壁緩慢的加入淋巴細胞分離液的上方，使上層細胞懸液與下層淋巴細胞分離液體積的比例為1:1，分裝完成后，將離心管放入低速離心機中離心，轉速為1300轉/分鐘，離心時間30分鐘；此時離心管中液體分層，中間的白細胞層即為臍帶血單個核細胞層，使用移液管輕輕吸出臍帶血單個核細胞層置一新的離心管中，并在此新的離心管中加入生理鹽水，用移液管輕輕抽吸吹打，使臍帶血單個核細胞與生理鹽水充分混勻；再離心，將離心管放入低速離 心機中離心，轉速為1500轉/分鐘，離心10分鐘；棄上清液；再加入生理鹽水，用移液管輕輕抽吸吹打，使臍帶血單個核細胞與生理鹽水充分混勻，形成臍帶血單個核細胞懸液，臍帶血單個核細胞懸液再離心，將離心管放入低速離心機中離心，轉速為1500轉/分鐘，離心10分鐘，棄上清；再加入生理鹽水，用移液管輕輕抽吸吹打，使臍帶血單個核細胞與生理鹽水充分混勻，形成臍帶血單個核細胞懸液，臍帶血單個核細胞懸液再離心，將離心管放入低速離心機中離心，轉速為1500轉/分鐘，離心10分鐘，棄上清；此時余下的細胞為洗過三遍的臍帶血單個核細胞；將放置備用的血漿的三分之二體積加入裝有洗過三遍的臍帶血單個核細胞的離心管中，使用移液管輕輕抽吸吹打，使臍帶血單個核細胞與血漿充分混勻，形成臍帶血單個核細胞血漿懸液，取出0. 5毫升使用細胞計數儀進行計數，根據計數的結果，使用余下的三分之一體積的血漿調整臍帶血單個核細胞血漿懸液的濃度為I. 5 X IO6/毫升，35毫升臍帶血單個核細胞血漿懸液裝于一個血漿袋中密封，并同時取臍帶血單個核細胞血漿懸液2毫升進行檢測細菌檢查陰性、支原體檢查陰性、內毒素檢查陰性、乙肝表面抗原檢測陰性，丙肝抗體檢測陰性，梅毒抗體檢測陰性，艾滋病抗體檢測陰性；密封于血漿袋中的臍帶血單個核細胞血漿懸液于3小時內進行使用。實施例4:無菌收集廢棄的健康人臍帶血于抗凝血漿收集袋中，溫度為4攝氏度在2小時內運送至細胞處置室，在無菌環境下根據臍帶血的體積將臍帶血移入多個50毫升離心管中，將離心管放入低速離心機中離心，轉速為2000轉/分鐘，離心10分鐘，此時離心管中的臍帶血分為兩層上層為血漿層，下層為細胞層，將上層血漿層輕輕移入新的離心管中備用，在含剩余細胞的離心管中再加入生理鹽水，加入生理鹽水的量為剩余細胞體積的3倍，充分混勻，形成細胞懸液，可增加離心管的數量來進行分裝多出的液體量；在新的50毫升離心管中加入密度為I. 077的淋巴細胞分離液25毫升，再將25毫升細胞懸液沿離心管壁緩慢的加入淋巴細胞分離液的上方，使上層細胞懸液與下層淋巴細胞分離液體積的比例為1:1，分裝完成后，將離心管放入低速離心機中離心，轉速為1500轉/分鐘，離心時間30分鐘；此時離心管中液體分層，中間的白細胞層即為臍帶血單個核細胞層，使用移液管輕輕吸出臍帶血單個核細胞層置一新的離心管中，并在此新的離心管中加入生理鹽水，用移液管輕輕抽吸吹打，使臍帶血單個核細胞與生理鹽水充分混勻；再離心，將離心管放入低速離心機中離心，轉速為1500轉/分鐘，離心10分鐘；棄上清液；再加入生理鹽水，用移液管輕輕抽吸吹打，使臍帶血單個核細胞與生理鹽水充分混勻，形成臍帶血單個核細胞懸液，臍帶血單個核細胞懸液再離心，將離心管放入低速離心機中離心，轉速為1500轉/分鐘，離心10分鐘，棄上清；再加入生理鹽水，用移液管輕輕抽吸吹打，使臍帶血單個核細胞與生理鹽水充分混勻，形成臍帶血單個核細胞懸液，臍帶血單個核細胞懸液再離心，將離心管放入低速離心機中離心，轉速為1500轉/分鐘，離心10分鐘，棄上清；此時余下的細胞為洗過三遍的臍帶血單個核細胞；將放置備用的血漿的三分之二體積加入裝有洗過三遍的臍帶血單個核細胞的離心管中，使用移液管輕輕抽吸吹打，使臍帶血單個核細胞與血漿充分混勻，形成臍帶血單個核細胞血漿懸液，取出0. 5毫升使用細胞計數儀進行計數，根據計數的結果，使用余下的三分之一體積的血漿調整臍帶血單個核細胞血漿懸液的濃度為2X IO6/毫升，30毫升臍帶血單個核細胞血漿懸液裝于一個血漿袋中密封，并同時取臍帶血單個核細胞血漿懸液2毫升進行檢測細菌檢查陰性、支原體檢查陰性、內毒素檢查陰性、乙肝表面抗原檢測陰性，丙肝抗體檢測陰性，梅毒抗體檢測陰性，艾滋病抗體檢測陰性；密封于血漿袋中的臍帶血單個核細胞血漿懸液于2小時內進行使用。以上實施方法表明按本發明方法進行準備的臍帶血單個核細胞應用前狀態更有 利于細胞功能的保持和細胞使用及對預期結果的實現，實施例4確定了本發明一種較好的臍帶血單個核細胞移植前狀態的準備方法。
權利要求
1.一種單個核細胞移植前狀態的準備方法，其特征在于，它是采用以下工藝方法完成的無菌收集廢棄的健康人臍帶血置于抗凝血漿收集袋中，溫度為O 8攝氏度在時間不大于4小時運送至細胞處置室，將臍帶血移入離心管中，1500 2500轉/分鐘離心10 15分鐘，將上層血漿層移出備用，在剩余細胞層中加入生理鹽水，加入生理鹽水的量為細胞層體積的3 6倍，充分混勻，形成細胞懸液；在新的50毫升離心管中加入密度為I. 077的淋巴細胞分離液，再將細胞懸液沿離心管壁緩慢的加入淋巴細胞分離液的上方，使上層細胞懸液與下層淋巴細胞分離液體積的比例為1:1，分裝完成后，離心，轉速為1000 1500轉/分鐘，離心時間為25 40分鐘；離心管中液體分層，中間的白細胞層即為單個核細胞層，使用移液管輕輕吸出單個核細胞層置一新的離心管中，加入生理鹽水充分混勻；洗滌三遍，將放置備用的血漿加入洗過三遍的單個核細胞中充分混勻，制備成臍帶血單個核細胞血漿懸液，調整臍帶血單個核細胞血漿懸液的濃度為I X IO6 2 X IO6/毫升，20 40毫升臍帶血單個核細胞血漿懸液裝于一個血漿袋中密封，并同時取臍帶血單個核細胞血漿懸液2毫升進行細菌、支原體、內毒素、乙肝表面抗原、丙肝抗體、梅毒抗體、艾滋病抗體檢測；密封于血漿袋中的臍帶血單個核細胞血漿懸液在時間不大于8小時進行使用。
2.根據權利I所述的單個核細胞移植前狀態的準備方法，其特征在于，無菌收集廢棄的健康人臍帶血在運送溫度為O 8攝氏度、時間不大于4小時運送至細胞處置室。
3.根據權利I所述的單個核細胞移植前狀態的準備方法，其特征在于，在離心分離血漿時離心機轉速為1500 2500轉/分鐘，離心時間為10 15分鐘。
4.根據權利I所述的單個核細胞移植前狀態的準備方法，其特征在于，用生理鹽水稀釋已分離出血漿的細胞層時，加入生理鹽水的量為細胞層體積的3 6倍。
5.根據權利I所述的單個核細胞移植前狀態的準備方法，其特征在于，在離心分離單個核細胞時離心機轉速為1000 1500轉/分鐘，離心時間為25 40分鐘。
6.根據權利I所述的單個核細胞移植前狀態的準備方法，其特征在于，洗滌三遍的單個核細胞使用臍帶血分離出的血漿進行稀釋和重懸。
7.根據權利1、6所述的單個核細胞移植前狀態的準備方法，其特征在于，用臍帶血的血漿稀釋的臍帶血單個核細胞血漿懸液濃度為IX IO6 2 X IO6/毫升。
8.根據權利1、6、7所述的單個核細胞移植前狀態的準備方法，其特征在于，臍帶血單個核細胞血漿懸液用血漿袋分裝時，每袋分裝容量為20 40毫升，在時間不大于8小時進行使用。
9.按權利要求I 8任一權利要求所述方法準備的臍帶血單個核細胞，在安全性檢測中，具有以下技術特征細菌檢查、支原體檢查、內毒素檢查、乙肝表面抗原檢測、丙肝抗體檢測、梅毒抗體檢測、艾滋病抗體檢測均為陰性。
全文摘要
本發明公開了一種單個核細胞在移植前狀態的準備方法，無菌收集廢棄的健康人臍帶血，分離出血漿，再使用生理鹽水稀釋細胞層，用密度梯度分離法進行分離單個核細胞，單個核細胞洗滌后，使用分離出的臍帶血血漿進行稀釋重懸，調整單個核細胞的濃度，密封于血漿袋中使單個核細胞處于應用前狀態；此方法與即往的方法在處理程序和方法上有所不同，本方法減少了與單個核細胞接觸的試劑種類、數量和時間，不需要培養、傳代、凍存等步驟，避免了其他試劑接觸對單個核細胞生存和生長的影響；本方法使用臍帶血血漿最后稀釋重懸分離洗滌后的臍帶血單個核細胞，使臍帶血單個核細胞在應用前處于采集前的生長環境和狀態，并且使臍帶血單個核細胞在體外的時間最短能減少到1.5小時，對保證細胞的活力、生存和生長具有巨大的促進作用，在應用前的各項檢查中均符合單個核細胞應用的要求。
文檔編號C12N5/0786GK102816736SQ20111015488
公開日2012年12月12日 申請日期2011年6月10日 優先權日2011年6月10日
發明者張寧坤, 高連如, 李田昌 申請人:張寧坤, 中國人民解放軍海軍總醫院