專利名稱：一種構建雞貧血病毒感染性分子克隆的方法
技術領域：
本發明涉及生物檢測領域，特別涉及一種構建雞貧血病毒感染性分子克隆的方法。
背景技術：
雞貧血病毒(chicken anemia virus, CAV)自1979年首次發現以來，便因其對雞群引起的重大損失而受到研究者的關注。尤其CAV體外培養系統的發現，更是加速了對該病毒的研究。CAV的基因組是2. 3kb的單股環狀鏈DNA，由編碼區和非編碼區兩部分組成。編碼區的CAV基因組包含3個部分或完全重疊的開放閱讀框(ORF)，分別命名為0RF1、0RF2和0RF3，大小分別為648bP、363bp和1350bp，其中，ORFl和0RF2完全重合，ORFl與0RF3部分 重疊，分別編碼VP2(24KD)、VP3(14KD)和VPl (52KD)的蛋白。而非編碼區內則存在一個病毒復制的調控區和一個多聚腺苷化的信號區。有關研究表明VPl是CAV的唯一結構蛋白，VP2為輔助蛋白，與病毒的裝配有關，而VP3是CAV的致病性蛋白，可誘導感染細胞的程序性死亡。現有的雞貧血病毒感染性分子克隆的構建研究方法多采取將病毒基因組克隆到載體中，獲得大量質粒后，再經過酶切、體外環化后轉染細胞，從而獲得有感染性的病毒。在實現本發明的過程中，發明人發現現有技術至少存在以下問題雞貧血病毒感染克隆的構建的研究方法中，質粒經過酶切后需要回收再進行自我連接，而連接后的環狀基因組也只有經過無水乙醇沉淀、純化后才可以轉染細胞，并且連接過程受到連接體系等因素的影響，每次的結果也很難達到一致，從而影響轉染效率，病毒拯救效率不一，而且不易于操作。
發明內容
本發明實施例的目的是針對上述現有技術的缺陷，提供一種易于操作、采用分子克隆技術成功獲得獲得CAV全長基因感染性分子克隆的構建方法。為了實現上述目的本發明采取的技術方案是一種構建雞貧血病毒感染性分子克隆的方法，包括以下步驟用PCR法擴增雞貧血病毒(chicken anemia virus, CAV)全長基因組DNA，將2個全長基因組順向連接插入到pBluescript Π SK (+)質粒載體中，獲得Psk2CAV質粒并轉染MDCC-MSB1細胞后獲得CAV全長基因感染性分子克隆。本發明構建雞貧血病毒感染性分子克隆的方法，具體包括以下步驟(I)獲取CAV全長基因組DNA并擴增從CAV Cux-I雞胚組織毒株中提取CAV Cux-I基因組DNA，以此為模板，用上游引物Pl和下游引物P2進行PCR擴增，擴增后產物用核酸凝膠回收試劑盒回收，回收產物用Kpn I酶切后回收備用； (2)構建重組質粒PskCAV
將pBluescript TI SK (+)載體用KpnI酶切、回收純化后,再用堿性磷酸酶處理，回收純化后與步驟⑴所得的Kpn I酶切的基因組DNA片段建立10 μ L的連接體系，過夜連接；連接物轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞，菌液涂布于Amp/LB/X-Gal/IPTG平板上，37°C培養過夜，用藍白斑篩選法挑選可能是重組質粒轉化體的白斑；挑取單個白斑菌落，分別提取質粒DNA，進行PCR、酶切及測序鑒定后，從中篩選出陽性的重組質粒PskCAV。(3)構建重組質粒Psk2CAV提取鑒定為陽性的重組質粒PskCAV的DNA，摸索用KpnI酶切的最佳不完全酶切條件，將陽性質粒PskCAV的DNA用KpnI進行不完全酶切，回收純化不完全酶切產物(回收片段為5200bp)，去磷酸化處理后，與步驟(I)中回收備用的基因組DNA片段進行連接，轉化大腸桿菌DH5ci感受態細胞，按步驟(2)所述方法篩選、鑒定陽性的Psk2CAV重組質粒；
(4)重組質粒 Psk2CAV 轉染 MDCC-MSB1 細胞按照脂質體轉染試劑盒說明書進行，以2種DNA含量分別轉染，每種濃度設兩個重復，在6孔細胞培養板中，用含10%新生牛血清的RPMI-1640培養MDCC-MSB1細胞，當孔底細胞生長至約占孔底面積的70%時開始轉染，孔Al、A2每孔轉染3. 4 μ g/12 μ L，孔BI、B2每孔轉染4. 2 μ g/15 μ L,設空質粒載體pBluescript TI SK(+)轉染作為陰性對照,設超純水稀釋的脂質體作為脂質體毒性對照，3h后將所有培養液換成含10%新生牛血清的RPMI-1640，繼續在37°C 5% CO2條件下培養，48h后細胞長滿單層，用常規法分別擴大培養。所述步驟⑴中的上游引物P1，其序列為序列表中的SEQ ID NO. I 5， -GCTGGTACCGCTCGGCACGGAGAC-3，；下游引物P1，其序列為序列表中的SEQ ID NO. 2 5’ -AGGGGTACCAGCGTGTGCCATCTC-3’。所述步驟(I)中PCR 反應體系為 25 μ L :取 5XPrimeSTAR Buffer 5 μ L,dNTP Mixture(2. 5mM)2. 0 μ L, PrimeSTAR HS DNA Polymerase(2. 5U/μ L)0. 25 μ L,模板DNA(濃度為lng)2. 0μ L，上、下游引物各I μ L(上、下游引物濃度均為lOpmol/μ 1)，MgCl2 (25mM) O. 8 μ L，再用滅菌去離子水補足到25 μ L ;PCR反應條件-MV 5min ；98°C 10s，70°C 3min 30s，共 30 個循環；72°C IOmin0本發明實施例提供的技術方案帶來的有益效果是本發明以兩個基因組串聯的方式構建感染性克隆，易于操作，不受其它因素影響；采用分子克隆技術將2個基因組順向連入一個載體的策略來構建雞貧血病毒感染性分子克隆，成功獲得CAV全長基因感染性分子克隆，為進一步研究CAV生物學特性、致病機理及研制CAV基因工程疫苗奠定了基礎。
圖I是本發明實施例提供的CAV基因組PCR擴增結果電泳圖；圖2是本發明實施例提供的重組質粒PskCAV的PCR鑒定電泳圖；圖3是本發明實施例提供的重組質粒PskCAV的Kpn I酶切鑒定電泳圖；圖4是本發明實施例提供的重組質粒Psk2CAV的NcoI酶切鑒定電泳圖；圖5是本發明實施例提供的Psk2CAV轉染MDCC-MSBI細胞后的間接免疫熒光檢測結果;
圖6是本發明實施例提供的胸腺和脾臟的病理變化圖；圖7是本發明實施例提供的胸腺的組織病理變化圖；圖8是本發明實施例提供的動物試驗中的PCR檢測結果電泳圖。
具體實施例方式為使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將結合附圖對本發明實施方式作進一步詳細描述。一種構建雞貧血病毒感染性分子克隆的方法，包括以下步驟用PCR法從CAVCux-I雞胚組織毒株中擴增雞貧血病毒(chicken anemia virus, CA V)全長基因組DNA,將2個全長基因組順向連接插入到pBluescript Π SK (+)質粒載體中，獲得Psk2CAV質粒并 轉染MDCC-MSB1細胞后獲得CAV全長基因感染性分子克隆。一種構建雞貧血病毒感染性分子克隆的方法，具體包括以下步驟I、材料選擇(I)菌(毒)株、載體和細胞CAV Cux-I雞胚組織毒株由德國羅曼公司提供；pBluescript SK(+)載體購自北京普京康生物科技有限公司；MDCC-MSB1細胞由東北農業大學動物醫學院惠贈；大腸桿菌DH5a菌株由本實驗室保存。(2)主要試劑PrimeSTAR HS DNA Polymerase, dNTPS, 5 XPS Buffer 購自寶生物工程有限公司；DNAMarker購自天根生化科技(北京)有限公司；Biospin組織基因組DNA提取試劑盒、核酸凝膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒購自博日科技有限公司；Kpn I酶、Nco I酶購自紐英倫生物技術有限公司；脂質體轉染試劑盒購自羅氏公司；兔抗雞IgG突光抗體購自Sigma公司。(3)試驗動物SPF雞購自北京梅里亞維通實驗動物技術有限公司。2、引物設計、合成及重組質粒構建方法(I)引物設計與合成根據GenBank上的CAV Cux-I株序列，設計一對引物，擴增CAV全長基因組，上游引物Pl為5’ -GCTGGTACCGCTCGGCACGGAGAC-3，,下游引物Ρ2為5 -AGGGGTACCAGCGTGTGCCATCTC-3 。其中，上游引物位置為1920 1940，下游引物位置為1925 1905，引入Kpn I酶切位點作為分子標簽；引物由金思特科技(南京)有限公司合成。(2)重組質粒Psk2CAV的構建和鑒定a、CAV全長基因組的獲取按照Biospin組織基因組DNA提取試劑盒說明書提取CAV Cux-I基因組，以此為模板，用引物PU P2進行PCR擴增，PCR總體系為25 μ L :取5XPrimeSTAR Buffer 5 μ L，dNTPMixture(2. 5mM)2. O μ L, PrimeSTAR HS DNA Polymerase(2. 5U/μ L)0. 25 μ L,模板DNA(濃度為lng) 2.0 μ L，上、下游引物(上、下游引物Ρ1、Ρ2，濃度為IOpmol/μ I)各I μ L，MgCl2 (25mM) O. 8 μ L，再用滅菌去離子水補足到25 μ L ;PCR反應條件94V 5min ；98°C 10s，70°C 3min 30s，共30個循環；72°C lOmin。擴增后產物用核酸凝膠回收試劑盒回收。回收后產物用Kpn I酶切，回收備用。b、重組質粒PskCAV的構建和鑒定將pBluescript Π SK (+)載體用KpnI進行酶切、回收純化后,再用堿性磷酸酶處理、回收純化后與步驟a回收的Kpn I酶切的CAV全長基因組建立10 μ L的連接體系，過夜連接(16°C，18h)。連接物轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞，菌液涂布于Amp/LB/X_Gal/IPTG平板上，37°C培養過夜，用藍白斑篩選法挑選可能是重組質粒轉化體的 白斑。挑取單個的白斑菌落,分別提取質粒DNA，進行PCR、酶切后，從中篩選出陽性的重組質粒PskCAV。PCR 鑒定 PskCAV 時，PCR 反應總體系為 25 μ L :取 5 X PrimeSTAR Buffer 5 μ L, dNTPMixture (2. 5mM) 2. O μ L, PrimeSTAR HS DNA Polymerase (2. 5U/ μ L) 0. 25 μ L，模板DNA (濃度 lng)2. 0μ L，上、下游引物(P1、P2，濃度 IOpmol/μ I)各 I μ L，MgCl2 (25mM) O. 8 μ L，再用滅菌去離子水補足到25 μ L ；PCR反應條件-MV 5min ；98°C 10s, 70°C 3min 30s，共30個循環；72°C10min。模板為質粒PskCAV。C、重組質粒Psk2CAV的構建和鑒定提取鑒定為陽性的重組質粒PskCAV的DNA，摸索找出最佳KpnI不完全酶切條件(37°C，酶用量O. 025 μ L，反應時間IOmin)，將陽性質粒PskCAV的DNA用KpnI進行不完全酶切，回收、純化不完全酶切的產物中5200bp的片段，去磷酸化處理后，與上述步驟(a)中的回收備用基因組DNA進行連接(16°C，18h)，轉化大腸桿菌DH5a感受態細胞。用藍白斑篩選法挑取單個的白斑菌落培養，分別提取質粒DNA，進行酶切鑒定后，篩選出兩個基因組順向連入載體的陽性重組質粒Psk2CAV。(3)重組質粒Psk2CAV轉染MDCC-MSBI細胞及鑒定a、重組質粒Psk2CAV轉染MDCC-MSB1細胞按照羅氏公司脂質體轉染試劑盒說明書進行，以2種DNA含量分別轉染，每種濃度設兩個重復。在6孔細胞培養板中，用含10%新生牛血清的RPMI-1640培養MDCC-MSB1細胞，當孔底細胞生長至約占孔底面積的70%時開始轉染，孔A1、A2每孔轉染3. 4 μ g/12 μ L，孔B1、B2每孔轉染4. 2 μ g/15 μ L，設空質粒載體pBluescript Π SK(+)轉染作為陰性對照，設超純水稀釋的脂質體作為脂質體毒性對照，3h后將所有培養液換成含10%新生牛血清的RPMI-1640，繼續在37°C 5% CO2條件下培養。48h后細胞長滿單層，用常規法分別擴大培養。b、間接免疫熒光檢測轉染細胞傳4代后，進行間接免疫熒光試驗，檢測病毒復制情況。具體步驟如下取Iml細胞懸液于1.5ml EP管內，1000r/min,離心IOmin,沉淀細胞,將沉淀的細胞用pH7. 4PBS洗兩遍。再用少量PBS將細胞均勻懸浮，然后涂于24孔板中央，待細胞干燥后，用冰冷的95%乙醇室溫固定lOmin。固定后，倒掉乙醇，用PBS洗二遍后，待細胞稍稍干燥后，加入I 400稀釋的抗CAV的多克隆抗體，37°C孵育lh，用PBS洗3遍，每次5min。稍稍干燥后，加入I 100稀釋的兔抗雞熒光抗體，37°C，30min，用PBS洗5遍，每次5min，晾干，熒光顯微鏡下觀察結果。(4)動物試驗將Psk2CAV質粒用質粒大提試劑盒大量提取，分別接種于10羽I日齡SPF雞的腿部肌肉，每羽雞接種100 μ g，作為Psk2CAV組；用CAV雞胚毒分別接種于10羽雞的腿部肌肉，每羽雞接種ΙΟΟμ g，作為陽性對照；用生理鹽水分別接種于10羽雞的腿部肌肉，每羽雞接種ΙΟΟμ L，作為陰性對照。觀察各組的臨床表現，于接種后14d、21d分別剖檢，做病理切片及PCR檢測。PCR檢測的具體步驟為研磨肝臟，用Biospin組織基因組DNA提取試劑盒提取CAV基因組。然后用P1、P2引物進行初步PCR檢測。PCR反應條件為94°C 5min ；98°C 10s,70°C 3min30s，共 30 個循環；72°C IOmin0本發明的試驗檢測結果I、CAV全長基因獲取以PI、P2為引物通過PCR擴增，可在雞胚組織中擴增到約2300bp左右的片段，與預期片段大小相符(參見圖I)。圖I中1泳道為CAV Cux-I基因組，2泳道為陰性對照，3泳道為 DL 23000DNA Maker。2、重組質粒PskCAV的鑒定 重組質粒PskCAV的質粒DNA經PCR后，可獲得2300bp左右的片段，和預期大小相符(參見圖2)。圖2中1泳道為重組質粒PskCAV ；2泳道為DL 23000DNA Maker。將重組質粒PskCAV的質粒DNA經過Kpn I酶切后，可見大小分別為2300bp和2900bp兩條帶，與預期大小相符(參見圖3)。圖3中1泳道為DL 23000DNA Maker ；2泳道為重組質粒PskCAV/KpnI03、重組質粒Psk2CAV的構建與鑒定通過調整Kpn I酶的濃度及作用時間，摸索到Kpn I最佳不完全酶切條件，然后進行大量酶切、回收獲得約5200bp大小的片段，回收后進行去磷酸化處理，與2300bp的基因組進行連接、轉化，然后提取質粒進行Nco I酶切鑒定，得到兩條大小約為2300bP和5200bp的片段，酶切結果證實兩個基因組順向連入載體中(參見圖4)，表明質粒構建成功。圖4中I泳道為DL 15000DNA Maker，2泳道為重組質粒Psk2CAV/NcoI。4、Psk2CAV轉染后的檢測(間接免疫熒光檢測)將轉染后的第4代細胞培養48h后進行間接免疫熒光檢測，結果參見圖5，說明將CAV的雙基因以順向串聯的方式連入載體，可以直接轉染MDCC-MSB1細胞獲得有感染性的病毒。圖5中的I為轉染Psk2CAV質粒的細胞，2為轉染pBluescript質粒的細胞。5、動物試驗(I)病理學檢測分別于接種后14d、21d剖檢，發現陽性對照組和注射Psk2CAV質粒的試驗組均有雞只表現腿肌、胸肌輕微出血，胸腺出現萎縮或出血(參見圖6)，圖6中1為陽性對照；2為Psk2CAV組；3為陰性對照。同時每組各取3只雞的胸腺進行組織病理學檢查(參見圖7)，圖7中1為陽性對照；2為Psk2CAV組；3為陰性對照。結果顯示陰性對照組胸腺無明顯變化，陽性對照組胸腺小葉體積縮小，出血，淤血，髓質部萎縮，淋巴細胞減少，注射感染性克隆Psk2CAV質粒組變化與陽性對照相似。(2) PCR 檢測每組各取6羽雞的肝臟研磨后，提取基因組DNA，用PCR檢測，陽性對照組和Psk2CAV組均擴增出2300bp目的條帶，與預期條帶相符；陰性對照組未擴增出條帶(參見圖 8)。圖 8 中:1、2、3、4、5 和 6 為陰性對照組;7、8、9、10、11 和 12 為 Psk2CAV 組；14、15、16、17、18 和 19 為陽性對照組;13 為 DL 15000DNA Maker。
將豬圓環病毒II型(PCV2)的雙拷貝基因組順向連入載體pBlueScript中，在體外證實其有感染性以后，將其直接接種豬體，可以產生與PCV2感染相似的病理變化。本發明考慮到CAV與PCV基因組結構存在一定相似性，基因組都較小，以兩個基因組順向連接入載體構建感染性克隆易于操作，受其它因素影響小，因此本發明也采取將2個基因組順向連入一個載體的策略來構建CAV感染性分子克隆。為了證實2個基因是否順向連入載體，本研究利用CAV基因組內存在單一的Nco I酶切位點，對重組質粒Psk2CAV進行Nco I酶切鑒定，由于Nco I位點位于基因組2129bp的位置，而引入的分子標簽Kpn I位于1899bp位置，因此若Nco I酶切后得到兩條大小分別為3400bp、4200bp的片段，則證實兩個基因組反向連入載體中，若Nco I酶切后得到兩條大小約為2300bP和5200bp的片段，則證實兩個基因組順向連入載體中。本發明中，Nco I酶切鑒定結果證實兩個基因組順向連入載體(參見圖4)，為下一步CAV感染性分子克隆的構建順利進行奠定了基礎。
以上所述僅為本發明的較佳實施例，并不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。
權利要求
1.一種構建雞貧血病毒感染性分子克隆的方法，包括以下步驟用PCR法擴增雞貧血病毒(chicken anemia virus, CAV)全長基因組DNA,將2個全長基因組順向連接插入到pBluescript TI SK (+)質粒載體中，獲得Psk2CAV質粒并轉染MDCC-MSB1細胞后獲得CAV全長基因感染性分子克隆。
2.根據權利要求I所述的構建雞貧血病毒感染性分子克隆的方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)獲取CAV全長基因組DNA并擴增 從CAV Cux-I雞胚組織毒株中提取CAV Cux-I基因組DNA，以此為模板，用上游引物Pl和下游引物P2進行PCR擴增，擴增后產物用核酸凝膠回收試劑盒回收，回收產物用Kpn I酶切后回收備用； (2)構建重組質粒PskCAV 將pBluescript TI SK (+)載體用KpnI酶切、回收純化后,再用堿性磷酸酶處理、回收純化后與步驟(I)回收的Kpn I酶切的基因組DNA片段建立IOii L的連接體系，過夜連接；連接物轉化大腸桿菌DH5 a感受態細胞，菌液涂布于Amp/LB/X-Gal/IPTG平板上，37°C培養過夜，用藍白斑篩選法挑選重組質粒的轉化體；挑取單個菌落，分別提取質粒DNA，進行PCR、酶切后，從中篩選出陽性的重組質粒PskCAV ； (3)構建重組質粒Psk2CAV 提取鑒定為陽性的重組質粒PskCAV，摸索最佳Kpn I不完全酶切條件，將陽性質粒PskCAV進行不完全酶切，回收純化不完全酶切產物，去磷酸化處理后，與步驟(I)回收備用的基因組DNA進行連接，轉化大腸桿菌DH5 a感受態細胞，按步驟(2)所述藍白斑篩選法篩選、鑒定陽性的Psk2CAV重組質粒； (4)重組質粒Psk2CAV轉染MDCC-MSBI細胞 按照脂質體轉染試劑盒說明書進行，以2種DNA含量分別轉染，每種濃度設兩個重復，在6孔細胞培養板中，用含10%新生牛血清的RPMI-1640培養MDCC-MSB1細胞，當孔底細胞生長至占孔底面積70%時開始轉染，孔Al、A2每孔轉染3. g/12ii L，孔B1、B2每孔轉染.4. 2 u g/15 u L,設空質粒載體pBluescript TI SK(+)轉染作為陰性對照,設超純水稀釋的脂質體作為脂質體毒性對照，3h后將所有培養液換成含10%新生牛血清的RPMI-1640，繼續在37°C、5% CO2條件下培養，48h后細胞長滿單層，用常規法分別擴大培養。
3.根據權利要求2所述的構建雞貧血病毒感染性分子克隆的方法，其特征在于，所述步驟(I)中的上游引物 Pl 為5’ -GCTGGTACCGCTCGGCACGGAGAC-3’ ；下游引物 Pl 為5’ -AGGGGTACCAGCGTGTGCCATCTC-3’。
4.根據權利要求2或3所述的構建雞貧血病毒感染性分子克隆的方法，其特征在于，所述步驟⑴中PCR反應體系為25iiL:取5XPrimeSTAR Buffer 5 u L, dNTPMixture (2. 5mM) 2. 0 u L, PrimeSTAR MHS DNA Polymerase (2. 5U/ u L) 0. 25 u L,模板 DNA.2.Oii L，上、下游引物各Iii L，MgCl2 (25mM) 0.8 iiL，再用滅菌去離子水補足到25 y L ;PCR反應條件94°C 5min ；98°C 10s,70°C 3min 30s，共 30 個循環；72°C IOmin0
全文摘要
本發明公開了一種構建雞貧血病毒感染性分子克隆的方法，包括以下步驟用PCR法擴增雞貧血病毒(chicken anemia virus，CAV)全長基因組DNA，將2個全長基因組順向連接插入到pBluescript ∏ SK(+)質粒載體中，獲得Psk2CAV質粒并轉染MDCC-MSB1細胞后獲得CAV全長基因感染性分子克隆。本發明以兩個基因組串聯的方式構建感染性克隆，易于操作，采用分子克隆技術，成功獲得CAV全長基因感染性分子克隆，為進一步研究CAV生物學特性、致病機理及研制CAV基因工程疫苗奠定了基礎。
文檔編號C12N15/85GK102807992SQ20111014907
公開日2012年12月5日 申請日期2011年6月3日 優先權日2011年6月3日
發明者李秀梅 申請人:天津市動物疫病預防控制中心