捕光色素葉綠素a/b結合蛋白LHCB6在植物育種中的應用的制作方法

專利名稱：捕光色素葉綠素a/b結合蛋白LHCB6在植物育種中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種捕光色素葉綠素a/b結合蛋白LHCB6在植物育種中的應用。
背景技術：
捕光葉綠素a/b結合蛋白(LHCB)是光合系統II (PSII)復合體的載脂蛋白。LHCB 蛋白通常與葉綠素、葉黃素組成復合體成為光合系統的捕光天線復合體。這些捕光天線復合體吸收光能并且向PSII光反應中心傳遞激發能以驅動光合電子傳遞系統。PSII復合體的外部天線蛋白LHCBs是捕光復合體重要的組成部分，它是自然界中含量最豐富的膜蛋白。LHCBs蛋白由較小的天線復合體LHCB4(CP^)，LHCB5(CP26)和LHCB6 (CP24)以及較大的天線復合體同源和異源的三聚體LHCB1，LHCB2和LHCB3。這些葉綠體/類囊體蛋白由核基因編碼，其表達主要受到環境和發育等因素調節，包括主要受到光(Silverthorne and Tobin, 1984 ；Sun and Tobin, 1990 ；Peer et al, 1996 ；Millar and Kay,1996 ；Weatherwax et al,1996 ；Yang et al,1998 ；Ημ Mbeck and Krupinska,2003 ；Nott et al,2006 ；Staneloni et al,2008 ；De Montaigu et al,2010 ； Pruneda-Paz and Kay,2010 ；Thines and Harmon,2010)；活性氧(Nott et al，2006; Staneloni et al，2008)，葉綠體逆向信號(Nott et al，2006)，晝夜節律(Paulsen and Bogorad,1988 ；Strayer et al,2000 ；Alabadi et al,2001 ；Thain et al,2002 ；Andronis et al,2008 ；Pruneda-Paz et al,2009 ；De Montaigu et al, 2010 ；Pruneda-Paz and Kay, 2010 ；Thines and Harmon, 2010)和生物激素脫落酸(ABA)的調控(Bartholomew et al, 1991 ；Chang and Walling, 1991 ；Weatherwax et al, 1996 ；Staneloni et al，2008)。植物對LHCB蛋白表達的調節被認為是植物調節葉綠體功能以應對逆境的重要機制之一(Nott et al,2006 ；De Montaigu et al, 2010 ；Pruneda-Paz and Kay,2010 ；Thines and Harmon, 2010)。ABA是調節植物生長與發育的重要生物激素，尤其在植物響應逆境方面起到重要作用(Finkelstein et al,2002 ；Adie et al，2007)。以前人們認為 ABA 負調控 LHCB 基因的表達，并且與光協同作用調節LHCB的表達以響應強光逆境(Bartholomew et al,1991 ； Chang and Walling, 1991 ；Weatherwax et al, 1996 ；Staneloni et al，2008)。強光調低 LHCB的表達可能是通過植物體內ABA濃度的改變而實現的(Weatherwax et al，1996)。然而ABA對于LHCB基因表達的生理意義并沒有被完全理解。ABA信號轉導過程得到了廣泛的研究，人們鑒定得到了許多參與其中的組成成分， 這其中包括位于細胞膜和細胞內的ABA受體。質膜蛋白GCR2和GTG1/GTG2被認為是在細胞表面起作用的ABA受體。一類START蛋白PYR/PYL/RCAR被認為是作用于細胞內的ABA受體，直接作用于PP2C信號通路的上游以調節下游基因的表達。已經報道過擬南芥中鎂卟啉 IX(Mg-ProtoIX)螯合酶的H亞基(CHLH/ABAR)作為ABA受體可以結合ABA，作用于ABA信號轉導過程。最近，又報道了 ABAR可以結合一組WRKY轉錄因子抑制一些ABA響應基因的表達，如ABI5。事實上，ABA被認為是植物將晝夜節律和受ABA調控從而響應干旱環境之間的一個關鍵環節。ABAR/CHLH在植物細胞中還起到許多作用在葉綠素合成過程中催化鎂離子與卟啉IX的結合，作為基因組解偶聯蛋白(GUN5)介導質體-核逆向信號轉導過程。ABAR/CHLH不僅是ABA受體，也在葉綠體逆向信號中具有GUN表型參與調節LHCB 基因的表達。

發明內容
本發明的一個目的是提供一種控制植物性狀的方法。本發明提供控制植物性狀的方法，是提高出發植物中LHCB6蛋白編碼基因的表達，得到具有下述1)或幻特征的目的植物1)耐逆性高于所述出發植物；2)生長延緩于所述出發植物。所述目的植物生長延緩于所述出發植物為如下A或B :A、所述目的植物種子的萌發遲于所述出發植物；B、所述目的植物根的生長遲于所述出發植物；所述目的植物種子的萌發遲于所述出發植物體現為所述目的植物種子的萌發率低于所述出發植物；所述目的植物種子的根的生長遲于所述出發植物體現為所述目的植物根長小于所述出發植物；所述提高出發植物中LHCB6編碼基因的表達是在激素脅迫下進行；所述激素具體為ABA;所述LHCB6蛋白的編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列1。所述耐逆性為耐干旱性；所述出發植物為單子葉植物或雙子葉植物，所述單子葉植物為擬南芥。所述提高出發植物中LHCB6編碼基因的表達是通過向出發植物中導入所述LHCB6 編碼基因實現的。所述ABA脅迫為在植物幼苗期或者植物成齡期進行；所述在植物幼苗期ABA脅迫的濃度為0. 5-5 μ M ；所述在植物幼苗期ABA脅迫的濃度具體為 0. 5 μ Μ、1 μ Μ、2 μ Μ、3 μ Μ、或 5 μ M ；所述在植物成齡期ΑΒΑ脅迫的濃度低于200μΜ但不為ΟμΜ，具體為20 μ Μ、 50 μ Μ、100 μ Μ、150 μ Μ、200 μ Μ、300 μ Μ。所述耐干旱性通過氣孔開度和/或失水率體現；所述根生長通過主根長度體現。所述提高LHCB6編碼基因的表達是通過外源ABA激活ABAR-WRKY40信號通路實現。所述激活ABAR-WRKY40信號通路為外源的ABA激活植物的ABA受體，使ABA受體與結合有轉錄因子WRKY40的LHCB6啟動子競爭結合轉錄因子WRKY40，釋放LHCB6的啟動子，使LHCB6編碼基因表達；所述ABA受體的氨基酸序列為序列表中的序列2 ；
所述ABA受體的編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列3 ；所述轉錄因子WRKY40的氨基酸序列為序列表中的序列4 ；所述轉錄因子WRKY40的編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列5 ；所述LHCB6啟動子的核苷酸序列為序列表中的序列6。本發明的另一個目的是提供一種控制植物性狀的方法。本發明提供的方法，是降低目的植物中LHCB6蛋白編碼基因的表達，得到具有下述1)或幻特征的植物1)耐逆性低于所述目的植物；2)生長加快于所述目的植物。所述植物的生長加快于所述出發植物為如下A或B :A)所述植物的種子的萌發早于所述目的植物；B)所述植物的根的生長早于所述目的植物；所述植物的種子的萌發早于所述目的植物體現為所述植物的種子的萌發率大于所述目的植物；所述植物的根的生長早于所述目的植物體現為所述植物的根長大于所述目的植物；所述降低目的植物中LHCB6蛋白編碼基因的表達是在激素脅迫下進行；所述激素具體為ABA ；所述LHCB6蛋白的編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列1 ；所述耐逆性為耐干旱性；所述出發植物為單子葉植物或雙子葉植物，所述單子葉植物為擬南芥；所述ABA脅迫為在植物幼苗期或者植物成齡期進行；所述在植物幼苗期ABA脅迫的濃度為0. 5-5 μ M ；所述在植物幼苗期ABA脅迫的濃度具體為 0. 5 μ Μ、1 μ Μ、2 μ Μ、3 μ Μ、或 5 μ M ；所述在植物成齡期ΑΒΑ脅迫的濃度低于200μΜ但不為ΟμΜ，具體為20 μ Μ、 50 μ Μ、100 μ Μ、150 μ Μ、200 μ Μ、300 μ M ; 所述耐干旱性具體通過氣孔開度和/或失水率體現；所述根生長具體通過主根長度體現；所述降低LHCB6編碼基因的表達是通過外源ABA激活ABAR-WRKY40信號通路實現；
所述激活ABAR-WRKY40信號通路具體為外源的ABA激活植物的ABA受體，使ABA 受體與結合有轉錄因子WRKY40的LHCB6啟動子競爭結合轉錄因子WRKY40，釋放LHCB6的啟動子，使LHCB6編碼基因表達；所述ABA受體的氨基酸序列為序列表中的序列2 ；所述ABA受體的編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列3 ；所述轉錄因子WRKY40的氨基酸序列為序列表中的序列4 ；所述轉錄因子WRKY40的編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列5 ；所述LHCB6啟動子的核苷酸序列為序列表中的序列6。本發明的第三個目的是提供提高一種植物耐逆性或延緩植物生長的方法。
本發明提供的方法，包括如下步驟用ABA對植物進行脅迫，得到具有如下性狀的植物1)目的植物耐逆性高于出發植物；2)目的植物的生長延緩于出發植物；將處理前的植物記作出發植物，將處理后的植物記作目的植物。所述ABA脅迫為在植物幼苗期或者植物成齡期進行；所述在植物幼苗期ABA脅迫的濃度為0. 5-5 μ M ；所述在植物幼苗期ABA脅迫的濃度具體為 0. 5 μ Μ、1 μ Μ、2 μ Μ、3 μ Μ、或 5 μ M ；所述在植物成齡期ΑΒΑ脅迫的濃度低于200 μ Μ，具體為20 μ Μ、50 μ Μ、100 μ Μ、 150μΜ、200μΜ、300μΜ ；所述出發植物為單子葉植物或雙子葉植物，所述單子葉植物為擬南芥。所述特征還體現在如下1)-6)中任一一種1)在ABA脅迫下，野生型植物耐逆性高于LHCB6蛋白表達失活的突變體lhcb6 ；2)在ABA脅迫下，LHCB6蛋白過表達植物耐逆性高于野生型植物；所述LHCB6蛋白過表達植物為將LHCB6蛋白的編碼基因導入野生型植物，得到 LHCB6蛋白過表達植物；3)在ABA脅迫下，野生型植物的種子的萌發率低于LHCB6蛋白表達失活的突變體 lhcb6 ；4)在ABA脅迫下，LHCB6蛋白過表達植物種子的萌發率低于野生型植物；5)在ABA脅迫下，野生型植物的根長低于LHCB6蛋白表達失活的突變體lhcb6 ；6)在ABA脅迫下，LHCB6蛋白過表達植物根長低于野生型植物。本發明的實驗證明，ABA調節LHCB6的表達是通過ABAR/CHLH參與的信號通路，各個LHCB家族成員的正常表達需要ABA的參與，并且生理水平內高濃度的ABA促進LHCB的表達，WRKY40作為負調節子直接作用于LHCB基因，LHCB通過ABAR-WRKY40介導的信號通路參與ABA信號轉導過程，是ABA信號轉導過程中的一個正調節子，響應ABA調節的種子萌發、幼苗生長和氣孔運動等表型。


圖1為LHCB6過表達和RNAi株系的熒光定量PCR檢測圖2為ABA刺激LHCBs的mRNA和蛋白的表達圖3為ABA刺激LHCB6在種子萌發和幼苗生長方面表型
圖4為ABA刺激LHCB6對氣孔運動和干旱脅迫的影響圖5為ABA刺激LHCB6對萌發率、氣孔運動和干旱脅迫的影響圖6為過表達LHCB6基因使種子萌發對ABA超敏圖7為35S驅動LHCBs基因在Ihcbs突變體中表達，恢復植株的表型圖8為ABA刺激下LHCB基因完全表達圖9為LHCBs基因在不同的組織器官中表達圖10為轉錄抑制子WRKY40與LHCB家族成員的啟動子結合圖11為WRKY40抑制LHCB基因的表達
圖12為abar-3突變體中LHCB基因的表達圖13為Ihcb雙突變體及Ihcbcch雙突變體的分子和生化檢測圖14為Ihcb突變體中ROS穩態及一系列ABA響應基因的表達圖15為LHCB2基因表達量降低使wrky40突變體對ABA的敏感性部分恢復到野生型狀態圖16為突變體lhcbl-6的分子和生化鑒定。圖17為不同Ihcb突變體中內源ABA含量及干物質含量測定圖18為wrky40及wrky40wrkyl8突變體沒有gun表型圖19為LHCBs蛋白響應生理水平濃度ABA而增加的一個模式圖
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。下述實施例中所用的材料如下1、T-DNA 插入突變體包括 LHCB1. 1 基因(Atlg29920)的 lhcbl. 1 (SALK-134810) (以下簡稱lhcbl，將野生型擬南芥中的LHCBl基因通過T-DNA插入進行敲除突變得到的，其余基因沒有變化)，LHCB2.2基因(At2g05070)的lhcb2. 2 (SALK-005614)(以下簡稱lhcb2，將野生型擬南芥中的LHCB2基因通過T-DNA插入進行敲除突變得到的，其余基因沒有變化)，LHCB3基因(At5g54270，將野生型擬南芥中的LHCB3基因通過T-DNA 插入進行敲除突變得到的，其余基因沒有變化)的lhcb3 (SALK-036200)，LHCB4. 3基因 (At2g40100)的lhcb4. 3 (SALK-032779)(以下簡稱lhcb4，將野生型擬南芥中的LHCB4基因通過T-DNA插入進行敲除突變得到的，其余基因沒有變化)，LHCB5基因(At4gl0340)的 lhcb5(SALK-139667，將野生型擬南芥中的LHCB5基因通過T-DNA插入進行敲除突變得到的，其余基因沒有變化)，LHCB6基因(Atlgl5820)的lhcb6 (SALK-074622，將野生型擬南芥中的LHCB6基因通過T-DNA插入進行敲除突變得到的，其余基因沒有變化)，這些突變體的種子均購自ABRC。2、wrky40-l (ET5883,Ler生態型背景，以下簡稱wrky40突變體)購自冷泉港實驗室，該突變體在WRKY40(Atlg80840)基因的第二個外顯子有一個Ds轉座子插入。wrky40_l 突變體是通過回交從Ler背景轉變成Col背景。wrkyl8-l (SALK-093916)購自 ABRC，是 WRKY18 (At4g31800)基因第一個外顯子上的T-DNA插入敲除突變體，這兩個突變體之前已經鑒定過是兩個無效等位基因。3、雙突變所有雙突變體都經過雜交和PCR鑒定得到雙突變體構建方法將一種突變體未開花的花苞用鑷子去除其雄蕊僅剩雌蕊，取下另一種突變體中開花或未開花的花苞中的雄蕊，在剝離剩余的雌蕊柱頭上摩擦，使花粉充分接觸柱頭，將此雌蕊做標記，莢果成熟后得到雜交Fl代種子，將Fl代種子再次播種，F2代生長，經PCR鑒定可得到純合體。4、cch突變體(Col背景，ABA受體的突變體)(Shen Y-Y,Wang X-F,ffu F-QjDu S-Y, Cao Z, Shang Y，Wang X-L,Peng C-C,Yu X-C,Zhu S-Y,Fan R-C,Xu Y-H,Zhang D-P(2006). The Mg-chelatase H subunit is an abscisic acid receptor. Nature 443 :823-826,公眾可從清華大學獲得。)由J. Chory博士饋贈。5、ABA 合成突變體 aba2 (CS156 :aba2_l，Col 背景，ABA 受體)購自 ABRC。植物生長條件MS培養基在光照培養箱中19_20°C，光強為80 μ molm-2^，土中生長時光照強度為120 μ Hiolm-2S-1,16h光照。6、過表達擬南芥和RNAi擬南芥1)、LHCB6 過表達載體 pCAMBIA1300_LHCB6提取哥倫比亞(Col-O)生態型為背景的擬南芥植株(ABRC :CS60000,以下簡稱野生型擬南芥，記作col)的基因組DNA，以下列引物進行PCR擴增forward primer :5，-GCTCTAGAATGGCGATGGCGGTCTCC-3，reverse primer :5，-CGGTCGACTCACAAACCAAGAGCACCGAG-3，得到777bp的PCR產物，經過測序，該產物的為序列表中的序列1(LHCB6基因的 ORF 是 777bp)。將PCR產物經^CbaI和Mil酶切，得到酶切后產物與經過同樣酶切得到的 pCAMBIAl300(Shang Y,Yan L,Liu ZQ，Cao Z，Mei C,Xin Q,Wu FQ，Wang XF,Du SY, Jiang Τ,Zhang XF,Zhao R,Sun HL, Liu R,Yu YT,Zhang D-P(2010)The Mg-chelatase H subunit antagonizes a group of WRKY transcription repressors to relieve ABA-responsive genes of inhibition. Plant Cell 22 :1909-1935含有花椰菜花葉病毒的35S啟動子和綠色熒光蛋白(GFP)，公眾可從清華大學獲得。)載體大片段連接，得到連接產物轉化大腸桿菌，提取轉化子質粒，測序為將序列表中的序列1 (LHCB6基因的0RF)插入pCAMBIA1300的 XbaI和Mil酶切位點間得到的載體，命名為pCAMBIA1300-LHCB6。2)、LHCB6 的 RNAi 干擾載體 pSK-int_LHCB6-R提取哥倫比亞(Col-O)生態型為背景的擬南芥植株的基因組DNA，以下列引物進行PCR擴增forward primer :5，-CGGTCGACATGGCGATGGCGGTCTCC-3，reverse primer :5，-CCATCGATCGAGCCATCGAGCCATTCAG-3，得到228bp的片段(序列1自5’末端第1_2觀位)，經過測序，該PCR產物具有 AF332425的第182-410位核苷酸，為LHCB6的cDNA起始密碼子后1至228bp特異結合的 228-bp的片段。將上述228bp的片段用Sall/Clal酶切后，與經過同樣酶切得到的pSK-int載體 (Shen Y-Y，Wang X-F，Wu F-Q，Du S-Y，Cao Z, Shang Y, Wang X-L，Peng C-C，Yu X-C，Zhu S-Y, Fan R-C, Xu Y-H, Zhang D-P (2006). The Mg-chelatase H subunit is an abscisic acid receptor. Nature 443 :823_826，公眾可從清華大學獲得。)片段連接，得到連接產物，將連接產物轉入大腸桿菌中，得到轉化子，提取轉化子的質粒，送去測序，結果為該質粒為將228bp的片段正向插入pSK-int載體的Sall/Clal酶切位點間得到的載體，命名為 pSK-int-228。將228bp的片段用EcoRIAbaI酶切后，與經過同樣酶切得到的pSK-int-2^載體連接，得到連接產物，將連接產物轉入大腸桿菌中，得到轉化子，提取轉化子的質粒，送去測序，結果為該質粒為將228bp的片段反向插入pSK-int-2^載體的Sall/Clal酶切位點間得到的載體，命名為pSK-int-LHCB6-R，將質粒為將228bp的片段正向、反向插入pSK-int-228載體中，為RNAi干擾載體。3)、LHCB6過表達擬南芥、RNAi轉LHCB6擬南芥、LHCB6 cch過表達擬南芥的獲得將上述過表達載體pCAMBIA1300-LHCB6和RNAi干擾載體pSK-int_LHCB6-R分別轉化入根癌農桿菌 GV3101 菌株(Shang Y, Yan L, Liu ZQ, Cao Z, Mei C, Xin Q, Wu FQ, Wang XF, Du SY, Jiang T, Zhang XF, Zhao R, Sun HL, Liu R, Yu YT, Zhang D-P(2010) The Mg-chelatase H subunit antagonizes a group of WRKY transcription repressors to relieve ΑΒΑ-responsive genes of inhibition. Plant Cell 22 :1909-1935，公眾可從清華大學獲得。)，得到重組菌1和重組菌2。分別提取重組菌1和重組菌2的質粒，分別測序， 結果為重組菌1的質粒為PCAMBIA1300-LHCB6，重紹菌2的質粒為pSK-int_LHCB6-R，將重組菌 1 命名為 GV3101/pCAMBIA1300-LHCB6，將重組菌 2 命名為 GV3101/pSK-int_LHCB6-R。將GV3101/pCAMBIA1300-LHCB6 和 GV3101/pSK-int-LHCB6-R 分別通過花苞滲透法侵染野生型擬南芥，得到TO代LHCB6過表達擬南芥和TO代RNAi轉LHCB6擬南芥。將GV3101/pCAMBIA1300-LHCB6通過花苞滲透法侵染cch突變體，得到TO代LHCB6 cch過表達擬南芥。分別從TO代LHCB6過表達擬南芥、TO代RNAi轉LHCB6擬南芥、TO代LHCB6 cch 過表達擬南芥上收獲種子、播種，繼續傳代，直到分別得到T3代LHCB6過表達擬南芥、T3代 RNAi轉LHCB6擬南芥、T3代LHCB6 cch過表達擬南芥待用。提取T3代LHCB6過表達擬南芥、T3代RNAi轉LHCB6擬南芥、T3代LHCB6 cch過表達擬南芥的RNA，反轉錄得到cDNA為模板，進行熒光定量檢測，以LHCB6 forward primer 5' -GCGATGGCAGCGGTTCTTG-3' reverse primer 5，-CCATGGCGTTGCCCACTCA-3，為引物，以 β -Actin為內參；內參的引物為 forward primer :5，-GGTAACATTGTGCTCAGTGGTGG-3，；reverse primer 5’ -AACGACCTTAATCTTCATGCTGC-3’ ；每一個數值都是三次獨立生物學重復的平均值。以野生型擬南芥col和cch突變體為對照。結果如圖IA所示，熒光定量PCR檢測四個LHCB6過表達擬南芥株系(0E1，0E2, 0E5，0E8)和三個 RNAi 轉 LHCB6 擬南芥(R8，R9，R18)株系，col、0El、0E2、0E5、0E8、R8、R9、 R18 中的 LHCB6 基因的 mRNA 相對表達量分別為 0. 85、1. 05、1. 30、1. 45、1. 10,0. 38,0. 45、 0. 30 ；與野生型擬南芥col中的表達量相比，在過表達株系中升高，RNAi株系中降低。LHCB6 在 cch 過表達的三個轉基因株系(cch/LHCB6_4，cch/LHCB6_5，and cch/ LHCB6-10)中的 LHCB6 的 mRNA 相對表達量結果如圖 IB 所示，col、cch、cch/LHCB6_4，cch/ LHCB6-5, and cch/LHCB6_10 分別為 0. 82,0. 58,0. 90,0. 90、1. 00 ；結果顯示轉基因株系中與野生型相當。7、Ihcbs突變體的互補擬南芥的獲得提取哥倫比亞(Col-O)生態型為背景的擬南芥植株(ABRC，CS60000)的基因組 DNA,以下列引物進行PCR擴增forward primer 5' -TCCCCCGGGATGGCCGCCTCAACAATGG-3，(SmaI)reverse primer :5，-ACGCGTCGACTCACTTTCCGGGAACAAAGTTG-3，(Sail)得到777bp的PCR產物，經過測序，該產物具有序列表中的序列1 (LHCB6基因的0RF)所示的核苷酸。將PCR產物經SmaI和Mil酶切，得到酶切后產物，將該酶切后產物與經過同樣酶切的 PCAMBIA1300-221 載體(Shang Y, Yan L, Liu ZQ, Cao Z, Mei C, Xin Q, Wu FQ, Wang XF, Du SY, Jiang T, Zhang XF, Zhao R, Sun HL, Liu R, Yu YT, Zhang D-P(2010) The Mg-chelatase H subunit antagonizes a group of WRKY transcription repressors to relieve ΑΒΑ-responsive genes of inhibition. Plant Cell 22 :1909-1935，公眾可從清華大學獲得。)連接，得到轉化子，提取轉化子的質粒，經過測序，該質粒為將序列表中的序列1 (LHCB6基因的0RF)插入pCAMBIA1300_221載體的SmaI和Mil酶切位點間得到的載體,命名為 pCAMBIA1300-221-LHCB6。將pCAMBIA1300-221-LHCB6轉入根癌農桿菌GV3101菌株，得到重組菌3，提取質粒送去測序，結果為重組菌3的質粒為pCAMBIA1300-221-LHCB6，將重組菌3命名為GV3101/ PCAMBIA1300-221-LHCB6。將GV3101/pCAMBIA1300-221-LHCB6通過花苞滲透法侵染突變體lhcb6，得到TO代 LHCB6互補擬南芥。將TO代LHCB6互補擬南芥收種、播種，繼續傳代，直到得到T3代LHCB6互補擬南芥，即為Ihcbs突變體的互補擬南芥，記作lhcb6*。8、chl-1為葉綠素合成突變體，購自擬南芥生物資源中心ABRC，CS3119。下述實施例中的實驗均為三次重復，涉及定量試驗的均為三次實驗取平均值。實施例1、在ABA的脅迫下LHCB6表達影響植物種子萌發、幼苗生長及耐旱一、外源施加低濃度ABA (相當于生理條件高濃度ABA)對LHCB6 mRNA和蛋白水平表達的影響分別在植物發育的兩個階段進行ABA處理幼苗期和成齡期。幼苗期普通MS培養基生長三天的野生型擬南芥(col) (ABRC, CS60000)幼苗移至含O、0. 5、1、3、5或IOyM的ABA的培養基(ABA+MS培養基)中再生長兩周；成齡期移至土壤中的野生型擬南芥幼苗生長三周后噴施不同濃度的ABA溶液 (配置IOml不同濃度的ABA水溶液)生長5h。mRNA 表達的具體檢測方法參照 Biofcid Real-Time System CFX96TM ClOOO Thermal Cycler(Singapore)儀器說明書對LHCB6的mRNA水平的表達進行RT-PCR檢測，模板為植株的 cDNA，引物為 forward primer :5，-GCGATGGCAGCGGTTCTTG-3，；reverse primer :5，-CCATGGCGTTGCCCACTCA-3，，內參為 β-Actin:內參的引物為 forward primer :5，-GGTAACATTGTGCTCAGTGGTGG-3，；reverse primer 5， -AACGACCTTAATCTTCATGCTGC-3，。LHCB6蛋白表達的具體檢測方法將植物組織(整個植株)在液氮中速凍，用預冷好的研磨鈸與研磨棒將材料在液氮中磨成粉末，裝入1.5mL離心管中。提取緩沖液成分為 50mMTris-HCl，pH 7. 5,150mMNaCl, ImM EDTA,0. 1% (v/v)Triton X-100,10% (ν/ν) glycerol，并加入蛋白酶抑制劑。按照提取緩沖液與樣品4 1的比例加入離心管，并迅速放入液氮中速凍。利用細胞破碎超聲儀將混合物超聲處理至完全解凍，然后再次放入液氮內速凍。上述步驟重復三次。將混合物IOOOOg離心3分鐘，除去不溶物和未破碎的細胞。將上清液轉移至新離心管待用，即為LHCB6蛋白。將LHCB6蛋白進行SDS-PAGE和免疫印記，具體的實驗步驟參照已發表的論文 (ffu F-Q, Xin Q, Cao Z, Liu Z-Q, Du S-Y, Mei C, Zhao C-X, Wang X-F, Shang Y, Jiang T, Zhang X-F, Yan L, Zhao R, Cui Z-N, Liu R, Sun H-L, Yang X-L, Su Z, Zhang D-P(2009). The Mg-chelatase H subunit binds abscisic acid and functions in abscisic acid signaling:New evidence in Arabidopsis. Plant Physiol 150 :1940-1954), LHCB6 的特異抗體購自 Agrisera(Stockholm, Sweden ；website :www. agrisera. com ；product No.AS01010。)。結果如圖2所示，圖2A 幼苗中0 IlJ 5 μ M ABA處理后LHCB6的mRNA表達水平升高，但10 μ M ABA 處理后LHCB6的mRNA表達水平降低。將三天的野生型幼苗，移到含不同濃度ABA的培養基上，繼續生長兩周取樣檢測(具體的檢測方法見上述mRNA表達檢測)。每組數據都是三次獨立生物學重復的平均值。O μ M ABA處理，LHCB6的mRNA相對表達量為0. 40 ；0. 5 μ M ABA 處理，LHCB6 的 mRNA 相對表達量為 0. 70 ；1 μ M ABA處理，LHCB6的mRNA相對表達量為1. 00 ；2 μ M ABA處理，LHCB6的mRNA相對表達量為0. 98 ；3 μ M ABA處理，LHCB6的mRNA相對表達量為0. 95 ；5 μ M ABA處理，LHCB6的mRNA相對表達量為1. 00 ；10 μ M ABA 處理，LHCB6 的 mRNA 相對表達量為 0. 10 ；圖2B 成齡苗中低于200 μ M ABA處理使LHCB6的mRNA表達水平升高，但高于 200 μ M ABA處理使LHCB6的mRNA表達水平降低。ABA溶液噴施三周齡的植株5小時后取樣檢測(具體的檢測方法見上述mRNA表達檢測)。每組數據都是三次獨立生物學重復的平均值。0 μ M ABA處理，LHCB6的mRNA相對表達量為1. 20 ；20 μ M ABA 處理，LHCB6 的 mRNA 相對表達量為 1. 35 ；50ABA處理，LHCB6的mRNA相對表達量為2. 00 ；100 μ M ABA 處理，LHCB6 的 mRNA 相對表達量為 1. 20 ；150 μ M ABA 處理，LHCB6 的 mRNA 相對表達量為 1.15;
200 μ M ABA 處理，LHCB6 的 mRNA 相對表達量為 1. 00 ；300 μ M ABA 處理，LHCB6 的 mRNA 相對表達量為 0. 75。圖2C 幼苗中0到5 μ MABA處理后LHCB6的蛋白表達水平升高，但10 μ M ABA處理后LHCB6的蛋白表達水平降低。材料處理同(A)。Actin為上樣對照，實驗三次重復得到相似的結果。檢測方法具體見LHCB蛋白表達檢測。圖2D 成齡苗中低于200 μ M ABA處理使LHCBs (LHCB1 6)的蛋白表達水平升高，但高于200 μ M ABA處理使LHCBs (LHCB1 6)的蛋白表達水平降低。材料處理同(B)。 Actin為上樣對照，實驗三次重復得到相似的結果。檢測方法具體見LHCB蛋白表達檢測。
從上述可以看出在幼苗期，0. 5至5μΜ的ABA濃度促進LHCB6的mRNA表達， 10 μ M時表達量下降(圖2Α)。在成齡期，低于200 μ M的ABA濃度處理擬南芥促進LHCB6 的mRNA表達，高于200 μ M時，LHCB6的mRNA表達量下降，50 μ M的ABA是促進LHCB6表達的最適濃度(圖2Β)。進一步研究ABA對LHCB蛋白表達的影響。在幼苗期，LHCB蛋白表達對于ABA處理的響應與mRNA水平完全一致，表達量在1至3 μ M處理時達到最大(圖2C)。在成齡期， 從20至300 μ M均促進LHCB蛋白的表達，隨著ABA濃度的增加，表達量增加(圖2D)，這與 mRNA的表達不同(圖2B)。實驗結果表明，LHCB的表達在轉錄與翻譯水平受到不同的調節。總之，以上數據基本說明，外源施加的低濃度，相當于生理條件下高濃度ABA，促進而不是抑制LHCB的表達。二、提高出發植物中LHCB6編碼基因的表達檢測種子的萌發率和根長變化1、種子萌發實驗將待測植物的約100粒種子消毒分三份播在MS培養基(Sigma，St. Louis,MO,USA ； full-strength MS)。培養基含有3%蔗糖和0. 8%瓊脂粉(pH 5. 9)并含有0、0. 5、1 μ M的 ΑΒΑ。種子在4°C條件下春化3天，然后放在20°C光照條件下生長，在標示的時間記錄萌發 (根的出現)的數據。上述待測植物為IhcM突變體、野生型擬南芥col、雙突變體lhcbl lhcb6(雙突變體構建方法將Ihcbl未開花的花苞用鑷子去除其雄蕊僅剩雌蕊，取下IhcM中開花或未開花的花苞中的雄蕊，在Ihcbl雌蕊柱頭上摩擦，使花粉充分接觸柱頭，將此雌蕊做標記， 莢果成熟后得到雜交Fl代種子，將Fl代種子再次播種，F2代生長，經PCR鑒定可得到純合體)、lhcb6-i (RNAi轉LHCB6擬南芥)、雙突變體lhcb4 lhcb6 (雙突變體構建方法將Ihcb 未開花的花苞用鑷子去除其雄蕊僅剩雌蕊，取下lhcb6中開花或未開花的花苞中的雄蕊， 在lhcb4雌蕊柱頭上摩擦，使花粉充分接觸柱頭，將此雌蕊做標記，莢果成熟后得到雜交Fl 代種子，將Fl代種子再次播種，F2代生長，經PCR鑒定可得到純合體)、LHCB6 (LHCB6過表達擬南芥)、cch突變體、lhcb6 cch (雙突變體構建方法將cch未開花的花苞用鑷子去除其雄蕊僅剩雌蕊，取下lhcb6中開花或未開花的花苞中的雄蕊，在cch雌蕊柱頭上摩擦，使花粉充分接觸柱頭，將此雌蕊做標記，莢果成熟后得到雜交Fl代種子，將Fl代種子再次播種，F2代生長，經PCR鑒定可得到純合體)、cch/LHCB6 (將LHCB6基因的ORF全長序列(序列1)整合到35S啟動子驅動的pCAMBIA1300-221載體中，引入cch突變體中)、chl_l (擬南芥生物資源中心ABRC，CS3119)。每一個數值都是三次獨立生物學重復的平均值。結果如圖3A-3D、圖5A-5C和圖6所示，從圖3A可以看出，IhcM在ΟμΜ的ABA的培養基中，24、36、48、60、7濁的萌發率分別為 38 % UOO %, 100 % UOO %, 100 % ；在 0. 5μΜ 的 ABA 的培養基中，24、36、48、60、72h 的萌發率分別為20%,78%,97%,100%,100% ；在1 μ M的ABA的培養基中，24、洸、48、60、 72h 的萌發率分別為 5%,60%,80%,98%,100% ；lhcb6-i (RNAi 轉 LHCB6 擬南芥)在 0 μ M 的 ABA 的培養基中，24、36、48、60、72h 的萌發率分別為30%、98%、100%、100%、100%;在0.5“] 的484的培養基中，24、36、48、60、72h的萌發率分別為37%、58%、90%、100%、100%在ΙμΜ的ABA的培養基中，24、36、48、 60、72h 的萌發率分別為 2%,57%,78%,88%,100% ；chl-1在ΟμΜ的ABA的培養基中，24、36、48、60、72h的萌發率分別為10%,80%, 98%,100%,100% ；在0. 5μΜ的ABA的培養基中，24、36、48、60、72h的萌發率分別為1%> 30%、72%、90%、100%在1 μ M的ABA的培養基中，24、36、48、60、72h的萌發率分別為0%, 20%,43%,75%,84% ；col在ΟμΜ的ABA的培養基中，24、36、48、60、72h的萌發率分別為10%,78%, 98%,100%,100% ；在0. 5μ M的ABA的培養基中，24、36、48、60、72的萌發率分別為0%, 22%、70%、86%、100%在ΙμΜ的ABA的培養基中，24、36、48、60、72h的萌發率分別為0%、 17%,35%,70%,83% ；從圖IBB可以看出，lhcb6單突變體在Ομ M的ABA的培養基中，24、36、48、60、72h的萌發率分別為 10%,90% ,100% ,100% ,100% ；在 0. 5μ M 的 ABA 的培養基中，24、36、48、60、72h 的萌發率分別為 18%、75%、98%、100%、100%在 ΙμΜ的ABA 的培養基中，24、36、48、60、72h 的萌發率分別為 10%,65%,82%,98%,100% ；雙突變體lhcbl IhcM在ΟμΜ的ABA的培養基中，24、36、48、60、7濁的萌發率分別為 10%,90%,98% ,100% ,100% ；在 0. 5μ M 的 ABA 的培養基中，24、36、48、60、72h 的萌發率分別為8 %、50 %、78 %、80 %、100 %在1 μ M的ABA的培養基中，24、36、48、60、7 的萌發率分別為 2%,35%,62%,80%,95% ；雙突變體lhcb4 IhcM在ΟμΜ的ABA的培養基中，24、36、48、60、7濁的萌發率分別為 12%,90%,98% ,100% ,100% ；在 0. 5μ M 的 ABA 的培養基中，24、36、48、60、72h 的萌發率分別為 10%、47%、78%、90%、100%在 ΙμΜ 的 ABA 的培養基中，24、36、48、60、72h 的萌發率分別為 2%,38%,56%,80%,98% ；col在ΟμΜ的ABA的培養基中，24、36、48、60、7濁的萌發率分別為8 %、80 %、 96%,100%,100% ；在0. 5μΜ的ABA的培養基中，24、36、48、60、72h的萌發率分別為2%, 22%、65%、82%、100%在1“] 的六8六的培養基中，24、36、48、60、7211的萌發率分別為0%、 10%、30%、62%、80%。從圖3C可以看出，lhcb6單突變體在1 μ M的ABA的培養基中，24、36、48、60、7 的萌發率分別為 18%,90%,95% ,100% ,100%lhcb6 cch在ΙμΜ的ABA的培養基中，24、36、48、60、7汕的萌發率分別為15%、 80%, 90%,100%,100%,野生型col在1 μ M的ABA的培養基中，24、36、48、60、7濁的萌發率分別為10%、 78%,88%,100%,100%,cch在ΙμΜ的ABA的培養基中，24、36、48、60、7濁的萌發率分別為19%、90%、 98%,100%,100% ；LHCB6在1 μ M的ABA的培養基中，24、36、48、60、72h的萌發率分別為15%,78%, 90%、100%、100%。從圖3D可以看出，cch/LHCB6在經ΟμΜ ABA處理36、48、60h的萌發率分別為98%,100%,100%,野生型col在經0μ M ABA處理36、48、60h的萌發率分別為96%、98%、100% ；cch 在經 Ομ M ABA 處理 36、48、60h 的萌發率分別為 96%、100%、100% ；cch/LHCB6 在經 3 μ M ABA 處理 36、48、60h 的萌發率分別為 40%、63%、70%，野生型col在經3μ M ABA處理36、48、60h的萌發率分別為15%、20%、35%，Cch 在經 3μ M ABA 處理 36、48、60h 的萌發率均分別為 65%、95%、100%，從圖5A-5C也可以看出，突變體LHCB6的萌發率高于野生型col。從圖5D可以看出，突變體在幼苗生長方面對于ABA脫敏，LHCB家族的雙突變體在幼苗生長方面對于ABA脫敏，突變體與cch的雙突變體在幼苗生長方面對于ABA脫敏。待測植物種子分布直接播在含有0. 5和1 μ M的ABA的MS培養基中播種，春化后生長12統計萌發率，結果如圖6所示，其中待測植物為野生型擬南芥col、LHCB6過表達擬南芥(OEl)。每一個數值都是三次獨立生物學重復的平均。從圖6中可以看出，Co 1在0. 5 μ MABA培養基上處理M、36、48、60h的種子萌發率為20%、28%、68%、 98% ；OE1在0. 5 μ MABA培養基上處理M、36、48、60h的種子萌發率為10%、18%、30%、 60% ；Col在14獻8々培養基上處理對、36、48、6011的種子萌發率為12%、23%、40%、 65% ；OEl在1 μ MABA培養基上處理M、36、48、60h的種子萌發率為8 %、12 %、25 %、 52% ；以上實驗說明1. Ihcb單突變體和LHCB6_RNAi株系在ABA抑制種子萌發方面表現出對ABA脫敏的表型；2. LHCB6在ABAR參與的ABA信號轉導過程的下游。2、根長實驗待測植物種子直接播在含有1 μ M的ABA的MS培養基中播種，春化后生長12天 (3E，3F)或10天(3G，3H)拍照觀察統計根長，以主根長度統計。待測植物為單突變體lhcb6、雙突變體lhcbl lhcb6(雙突變體構建方法將Ihcbl 未開花的花苞用鑷子去除其雄蕊僅剩雌蕊，取下Ihcbe中開花或未開花的花苞中的雄蕊， 在剝離剩余的雌蕊柱頭上摩擦，使花粉充分接觸柱頭，將此雌蕊做標記，莢果成熟后得到雜交Fl代種子，將Fl代種子再次播種，F2代生長，經PCR鑒定可得到純合體)、野生型擬南芥 C0l、CCh單突變體、雙突變體lhcb6 cch (雙突變體構建方法將IhcM未開花的花苞用鑷子去除其雄蕊僅剩雌蕊，取下cch中開花或未開花的花苞中的雄蕊，在剝離剩余的雌蕊柱頭上摩擦，使花粉充分接觸柱頭，將此雌蕊做標記，莢果成熟后得到雜交Fl代種子，將Fl代種子再次播種，F2代生長，經PCR鑒定可得到純合體)、LHCB6 cch過表達擬南芥(LHCB6cch)、 LHCB6過表達擬南芥(0E1、OEQ、RNAi轉LHCB6擬南芥(R9和R18)。每一個數值都是三次獨立生物學重復的平均。結果如圖3E-3H所示(以下都是相同時間點檢測的根長)，從3E中可以看出，lhcb6的根長為6. 5mm ；Col 的根長為 2. Omm ；
雙突變體lhcbl lhcb6的根長為5. 5mm ；從圖3F可以看出，LHCB6 cch在含1 μ M的ABA培養基上的幼苗根長為4. Omm ；lhcb6 cch雙突變體在含1 μ M的ABA培養基上的幼苗根長為6. Omm ；cch單突變體在含1 μ M的ABA培養基上的幼苗根長為6. 3mm ；野生型col在含1 μ M的ABA培養基上的幼苗根長為2. Omm ；從圖3G可以看出，LHCB6的RNAi轉基因植株和過表達轉基因植株在幼苗生長方面對ABA脫敏。以上實驗表明1. Ihcb單突變體在ABA抑制幼苗生長方面表現出對ABA脫敏的表型；2. LHCB6在ABAR參與的ABA信號轉導過程的下游。從3Η可以看出，LHCB6過表達擬南芥(OEl)的根長為1. 8mm ；LHCB6過表達擬南芥(0E5)的根長為2. 6mm ；RNAi 轉 LHCB6 擬南芥(R9)的根長為 8. Omm ；RNAi 轉 LHCB6 擬南芥(R18)的根長為 12. 5mm ；Col 的根長為 5. 6_。上述實驗可以看出，所有的Ihcb cch雙突變體(lhcbl cch, lhcb3 cch, lhcb4 cch, and lhcb6 cch)在種子萌發(圖3C)和幼苗生長(圖3F)方面表現出對ABA脫敏的表型。lhcb cch雙突變體在種子萌發方面對ABA脫敏的程度低于Ihcb或者cch單突變體， 與Ihcb雙突變體一致(圖3A至C)。在幼苗生長方面，lhcb cch雙突變體對于ABA脫敏的程度與Ihcb雙突變體、單突變體和cch單突變體表型一致(圖3E，3F)。有趣的是，發現在 cch突變體中過表達LGCB6基因，轉基因株系在所有響應ABA的表型中都能部分恢復cch突變體對于ABA脫敏的表型ABA抑制種子萌發(圖3D)，ABA抑制幼苗生長(圖3F)。三、提高出發植物中LHCB6編碼基因的表達對耐逆性的影響1、氣孔運動實驗ABA誘導的氣孔關閉體系將土壤中生長3周的待測植物葉片浸泡在含有50mM KCl和IOmMMes-Tris (pH 6. 15)的緩沖液中，以200 μ moIm-2S^1強度在冷光源下放置2. 5h， 然后加入不同濃度的(士)_ABA。在ABA處理2. 后，撕取表皮條，記錄氣孔開度。ABA抑制氣孔開放體系將土壤中生長3周的待測植物葉片浸泡在相同的緩沖液中，黑暗處理2. 5h,然后在緩沖液中加入ABA移至冷光源下照射2h，記錄氣孔開度。待測植物為col、chl-1 (購自 ABRC, CS3119)，cch, lhcb6 突變體及 LHCB6 過表達擬南芥(LHCB6)、雙突變體lhcbl lhcb6(雙突變體構建方法將lhcbl未開花的花苞用鑷子去除其雄蕊僅剩雌蕊，取下lhcb6中開花或未開花的花苞中的雄蕊，在剝離剩余的雌蕊柱頭上摩擦，使花粉充分接觸柱頭，將此雌蕊做標記，莢果成熟后得到雜交Fl代種子，將Fl代種子再次播種，F2代生長，經PCR鑒定可得到純合體)、雙突變體lhcb6 cch (雙突變體構建方法將IhcM未開花的花苞用鑷子去除其雄蕊僅剩雌蕊，取下cch中開花或未開花的花苞中的雄蕊，在剝離剩余的雌蕊柱頭上摩擦，使花粉充分接觸柱頭，將此雌蕊做標記，莢果成熟后得到雜交Fl代種子，將Fl代種子再次播種，F2代生長，經PCR鑒定可得到純合體)、 cch/LHCB6(實施例前面的LHCB6 cch過表達擬南芥(LHCB6 cch))。
結果如圖4A、圖4B和圖5F所示，其中誘導氣孔關閉為上圖，抑制氣孔開放為下圖。 每一個數值都是五次獨立生物學重復的平均。每次重復記錄60個氣孔的開度。從圖4A中可以看出，Col 在 0 μ MABA 處理 0h、0 μ MABA 處理 2. 5h、20 μ MABA 處理 2. 5h、30 μ MABA 處理 2. 5h的誘導氣孔關閉時氣孔的開度為5. 5 μ M、5. 2 μ M、2. 8 μ M、0. 8 μ M ；Col 在 O μ MABA 處理 0h、0 μ MABA 處理 2. 5h、20 μ MABA 處理 2. 5h、30 μ MABA 處理 2. 5h的抑制氣孔開放時氣孔的開度分別為1. O μ M、5. 6 μ M、2. 5 μ M、0. 8 μ M ；chl-1 在ΟμΜΑΒΑ 處理 ΟΚΟμΜΑΒΑ 處理2. 5h、20 μ MABA 處理 2. 5Κ30μΜΑΒΑ 處理 2. 5h的誘導氣孔關閉時氣孔的開度為5. 3 μ M、5. O μ M、2. 6 μ M、0. 7 μ M ；chl-1 在ΟμΜΑΒΑ 處理 ΟΚΟμΜΑΒΑ 處理2. 5h、20 μ MABA 處理 2. 5Κ30μΜΑΒΑ 處理 2. 5h的抑制氣孔開放時氣孔的開度為1. 1 μ M、5. 4 μ M、2. 6 μ M、0. 9 μ M ；lhcb6 突變體在 O μ MABA 處理 0h、0 μ MABA 處理 2. 5h、20 μ MABA 處理 2. 5h、 30 μ MABA處理2. 5h的誘導氣孔關閉時氣孔的開度為5. 5 μ M、5. 3 μ Μ、4· 9 μ Μ、4· O μ M ;lhcb6 突變體在 0 μ MABA 處理 0h、0 μ MABA 處理 2. 5h、20 μ MABA 處理 2. 5h、 30 μ MABA處理2. 5h的抑制氣孔開放時氣孔的開度為0. 8 μ Μ、5· 5 μ Μ、5· 0 μ Μ、3· 5 μ M ；LHCB6 在 0 μ MABA 處理 0h、0 μ MABA 處理 2. 5h、20 μ MABA 處理 2. 5h、30 μ MABA 處理 2. 5h的誘導氣孔關閉時氣孔的開度為5. 2 μ M、5. 1 μ Μ、1. 6 μ Μ、0. 4 μ M ;LHCB6 在 0 μ MABA 處理 0h、0 μ MABA 處理 2. 5h、20 μ MABA 處理 2. 5h、30 μ MABA 處理 2. 5h的抑制氣孔開放時氣孔的開度為0. 8μΜ、5. 6μΜ、1. 0μΜ、0. 5μΜ ；從如圖4Β可以看出，Col 在 0 μ MABA 處理 0h、0 μ MABA 處理 2. 5h、20 μ MABA 處理 2. 5h、30 μ MABA 處理 2. 5h的誘導氣孔關閉時氣孔的開度為5. 0 μ M、5. 1 μ M、2. 8 μ M、0. 3 μ M ；Col 在 0 μ MABA 處理 0h、0 μ MABA 處理 2. 5h、20 μ MABA 處理 2. 5h、30 μ MABA 處理 2. 5h的抑制氣孔開放時氣孔的開度為1. 4 μ Μ、4. 4 μ Μ、2. 2 μ Μ、0. 2 μ M ;cch 在 O μ MABA 處理 0h、0 μ MABA 處理 2. 5h、20 μ MABA 處理 2. 5h、30 μ MABA 處理 2. 5h的誘導氣孔關閉時氣孔的開度為6. 2 μ Μ、6. 3 μ Μ、5. 8 μ Μ、2. 6 μ M ；cch 在 O μ MABA 處理 0h、0 μ MABA 處理 2. 5h、20 μ MABA 處理 2. 5h、30 μ MABA 處理 2. 5h的抑制氣孔開放時氣孔的開度為1. 5 μ Μ、6. 7 μ Μ、5. 5 μ Μ、2. 3 μ M ；lhcb6 突變體在 O μ MABA 處理 0h、0 μ MABA 處理 2. 5h、20 μ MABA 處理 2. 5h、 30 μ MABA處理2. 5h的誘導氣孔關閉時氣孔的開度為5. 1 μ Μ、4· 9 μ Μ、4· 7 μ Μ、1· 5 μ M ；lhcb6 突變體在 O μ MABA 處理 0h、0 μ MABA 處理 2. 5h、20 μ MABA 處理 2. 5h、 30 μ MABA處理2. 5h的抑制氣孔開放時氣孔的開度為1. 0 μ M、5. 0 μ M、4. 1 μ Μ、1. 5 μ M ；lhcbl lhcb6 雙突變體在 0 μ MABA 處理 0h、0 μ MABA 處理 2. 5h、20 μ MABA 處理2. 5h、30yMABA處理2. 5h的誘導氣孔關閉時氣孔的開度為5·0μΜ、5· 1μΜ、5·0μΜ、 1. 7μΜ ；lhcbl lhcb6 雙突變體在 ΟμΜΑΒΑ 處理 ΟΚΟμΜΑΒΑ 處理 2. 5h、20yMABA 處理2. 5h、30 μ MABA處理2. 5h的抑制氣孔開放時氣孔的開度為1. 0 μ Μ、5. 0 μ Μ、4. 9 μ Μ、 1. 7μΜ ；lhcb6 cch 雙突變體在 0 μ MABA 處理 0h、0 μ MABA 處理 2. 5h、20 μ MABA 處理 2. 5h、30 μ MABA處理2. 5h的誘導氣孔關閉時氣孔的開度為6. 0 μ Μ、6· 1 μ Μ、5· 1 μ Μ、2· 0 μ M ；lhcb6 cch 雙突變體在 0 μ MABA 處理 0h、0 μ MABA 處理 2. 5h、20 μ MABA 處理 2. 5h、 30 μ MABA處理2. 5h的抑制氣孔開放時氣孔的開度為1. 1 μ Μ、6· 4 μ Μ、5· 5 μ Μ、2· 3 μ M ；值得注意的是，lhcb6 cch雙突變體與cch單突變體相比對ABA的脫敏沒有顯著增強。從圖5F中可以看出，col在ΟμΜΑΒΑ處理0h、0yMABA處理2. 5h、20yMABA處理 2. 5h、30 μ MABA處理2. 5h的誘導氣孔關閉時氣孔的開度分別為5. 3 μ m、5. 2 μ m、2. 8 μ m、 0. 8ym ；col 在 0 μ MABA 處理 0h、0 μ MABA 處理 2. 5h、20 μ MABA 處理 2. 5h、30 μ MABA 處理 2. 5h的抑制氣孔開放時氣孔的開度分別為1. 2 μ m、5. 4 μ m、2. 5 μ m、0. 8 μ m ；cch 在 0 μ MABA 處理 0h、0 μ MABA 處理 2. 5h、20 μ MABA 處理 2. 5h、30 μ MABA 處理 2. 5h的誘導氣孔關閉時氣孔的開度分別為6. 8 μ m、6. 8 μ m、5. 9 μ m、4. 9 μ m ；cch 在 0 μ MABA 處理 0h、0 μ MABA 處理 2. 5h、20 μ MABA 處理 2. 5h、30 μ MABA 處理
2.5h的抑制氣孔開放時氣孔的開度分別為1. 3 μ m、6. 5 μ m、6. 0 μ m、4. 2 μ m ；單突變體lhcb6 在 0 μ MABA 處理 0h、0 μ MABA 處理 2. 5h、20 μ MABA 處理 2. 5h、 30 μ MABA處理2. 5h的誘導氣孔關閉時氣孔的開度分別為5. 2 μ m、5. 1 μ m、4. 8 μ m、
4.0 μ m ；單突變體lhcb6 在 0 μ MABA 處理 0h、0 μ MABA 處理 2. 5h、20 μ MABA 處理 2. 5h、 30 μ MABA處理2. 5h的抑制氣孔開放時氣孔的開度分別為1. 0 μ m、5. 3 μ m、4. 9 μ m、
3.6 μ m ；雙突變體cch/LHCB6 (通過XbaI和Mil酶切位點將LHCB6的ORF (序列1，777bp) 與花椰菜花葉病毒的35S啟動子連接引入pCAMBIA1300載體，通過花苞滲透法侵染植物 cch,篩選陽性苗，繁衍至T3代純合體進行實驗)在0 μ MABA處理0h、0 μ MABA處理2. 5h、 20 μ MABA處理2. 5h、50yMABA處理2. 5h的誘導氣孔關閉時氣孔的開度分別為5. 5 μ m、
5.2 μ m>3. 8 μ m>2. 8 μ m ；雙突變體cch/LHCB6 在 0 μ MABA 處理 0h、0 μ MABA 處理 2. 5h、20 μ MABA 處理 2. 5h、 50 μ MABA處理2. 5h的抑制氣孔開放時氣孔的開度分別為1. 2 μ m、6. 2 μ m、3. 7 μ m、2. 0 μ m。2、干旱實驗和失水率實驗將待測植物從培養基移入土壤中生長后，不澆水進行干旱脅迫，拍照。以正常澆水為對照。將野生型和不同的Ihcb突變體，每次每個樣取5株葉片進行實驗(選取四周齡未抽薹植株上的發育成熟的葉片，放在稱量紙上，每隔Ih稱重一次，計算出葉片失水率。公式應為(Oh重量-Ih重量)/Oh重量)，統計6小時內離體葉片的失水速率。待測植物為野生型擬南芥Col、突變體lhcb6。拍照觀察的結果如圖4C-E和圖5H所示，從圖4C可以看出，為正常澆水，野生型擬南芥Col、突變體IhcM無差異。從圖4D可以看出，為干旱脅迫停止澆水18天后復水2天，野生型擬南芥Col生長較好、突變體IhcM基本枯萎。從圖4E可以看出，為干旱脅迫干旱21天后復水，2天后拍照記錄，野生型擬南芥Col生長較好、突變體IhcM基本枯萎。從5H可以看出，干旱脅迫干旱21天后復水，2天后拍照，野生型擬南芥Col生長較好、突變體IhcM基本枯萎。圖5D表明lhcb6突變體在幼苗生長方面對于ABA脫敏，lhcbl lhcb6和lhcb6 cch 雙突變體在幼苗生長方面對于ABA脫敏。。失水率的結果如圖5G所示，可以看出，lhcb6 在 ABA 處理 l、2、3、4、5、6h 的失水率分別為 16%,32%,48%,59%,76% ；col 在 ABA 處理 l、2、3、4、5、6h 的失水率分別為 12% ,24% ,34% ,44% ,54% 可以看出，在ABA誘導的氣孔關閉和抑制氣孔開放方面，IhcM突變體表現出對 ABA的脫敏表型，而LHCB6的過表達株系表現出對ABA敏感的表型。雙突變體lhcbl lhcb6 表現出相同程度的脫敏表型。chl-1突變體在ABA誘導的氣孔關閉和抑制氣孔開放方面未表現出對ABA脫敏的表型，這與以前對于chl-2突變體研究結果一致。研究發現Ihcb突變體的離體葉片在干燥的條件下同等時間失水更多。這可能是由于這些突變體在氣孔運動方面對ABA脫敏引起的。同時，發現Ihcb突變體在正常澆水條件下生長狀態與野生型一致，而在干旱條件下，突變體的保水能力低于野生型。4、Ihcbs突變體的互補擬南芥在種子萌發、幼苗生長及耐旱的研究1)種子萌發、根長Lhcb6*代表LHCB6基因的互補株系(獲得方法如上所示)。將lbcb6*和col在1 μ M的ABA培養基上春化后48小時后，統計種子萌發率。將lbcb6*和col在1 μ M的ABA培養基上春化后12天后，統計根長。結果如圖7Α所示，col、lbcb6*在1 μ M的ABA培養基上春化后48小時的萌發率分別為32%、21 %，可以看出IhcM突變體在種子萌發方面對ABA脫敏的表型是由于LHCB6 基因表達量降低引起的。col、lbcb6*在ΙμΜ的ABA培養基上春化后12天的根長(主根長度)分別為 2. 5mm、1. 7mm，可以看出IhcM突變體在幼苗生長方面對ABA脫敏的表型是由于LHCB6基因表達量降低引起的。可以看出lbcb6*可以恢復野生型表型，結合前面的實驗，lh(A6突變體在幼苗生長方面對ABA脫敏的表型是由于LHCB6基因表達量降低引起的。2)耐旱(氣孔開度)將lbcb6*和col按照上述方法進行誘導氣孔關閉及抑制氣孔開放實驗，在O μ M ABA O小時記錄初始氣孔開度，Ομ M或20μ M ABA處理2. 5小時后再記錄氣孔開度。每一個數值都是五次獨立生物學重復的平均。每次重復記錄60個氣孔的開度。字母相同表示 (在P < 0. 05差異水平)沒有顯著差異，字母不同表示有顯著差異。結果如7Β所示，ABA誘導氣孔關閉為上圖，抑制氣孔開放為下圖，col和lbcb6*在O μ M的ABA處理O小時的誘導氣孔關閉的氣孔開度分別為 6. O μ m、6. O μ m，可以看出本實驗中野生型與轉基因株系初始狀態相同。col和lbcb6*在O μ M的ABA處理O小時的抑制氣孔開放的氣孔開度分別為 1. O μ m、1.0 μ m，可以看出本實驗中野生型與轉基因株系初始狀態相同。col和lbcb6*在Ομ M的ABA處理2. 5小時的誘導氣孔關閉的氣孔開度分別為5. 1 μ m、5. 0 μ m，可以看出本實驗中，以水作為負對照處理野生型與轉基因株系，其表型一致。col和lbcb6*在O μ M的ABA培養基上春化后2. 5小時的抑制氣孔開放的氣孔開度分別為5. 5 μ m、5. 8 μ m，可以看出本實驗中，以水作為負對照處理野生型與轉基因株系，
其表型一致。col和lbcb6*在20 μ M的ABA處理2. 5小時的誘導氣孔關閉的氣孔開度分別為 3. 2 μ m、2. 4 μ m，可以看出在ABA處理后，轉基因株系基本恢復IhcM突變體在氣孔運動方面對ABA脫敏的表型，說明IhcM突變體對ABA脫敏的表型是由于LHCB6基因表達量降低引起的。col和lbcb6*在20 μ M的ABA處理2. 5小時的抑制氣孔開放的氣孔開度分別為 2. 4 μ m、2. 2 μ m，可以看出在ABA處理后，轉基因株系基本恢復IhcM突變體在氣孔運動方面對ABA脫敏的表型，說明IhcM突變體對ABA脫敏的表型是由于LHCB6基因表達量降低引起的。實施例2、LHCB6基因的表達由ABAR-WRKY40信號通路調節一、LHCB6基因的正常表達需要ABA的參與為了檢測ABA對LHCB6的表達是否是必須的，利用ABA缺陷突變體aba2進行實驗。LHCB6的mRNA的表達檢測方法三天的aba2幼苗移到不含或含有(1_60 μ M) ABA的培養基上，繼續生長兩周后取樣，進行熒光定量PCR(模板樣品的cDNA ； 弓I ^ :LHCB6 forward primer 5' -GCGATGGCAGCGGTTCTTG-3‘ reverse primer 5，-CCATGGCGTTGCCCACTCA-3，內參β -Actin、內參的引物為 forward primer :5，-GGTAACA TTGTGCTCAGTGGTGG-3，reverse primer 5，-AACGACCTTAATCTTCATGCTGC-3，)檢測 LHCB6 的表達水平，以野生型擬南芥(col)為對照。每組數據都是三次獨立的生物學重復的平均值。結果如圖8A所示，可以看出，ABA合成突變體aba2中，LHCB6的表達是被調低的(aba2-ABA)，ABA處理后能夠使ABA合成突變體aba2中的LHCB6的表達得到恢復 (aba2+ABA)，但是當ABA濃度高于40 μ M時出現抑制作用。LHCB6蛋白表達的檢測方法三天的aba2幼苗移到含有(0，1，3，5，10，20，40， and60 μ Μ) ABA的培養基上，繼續生長兩周后取樣，提取總蛋白，進行Wfestern blot檢測(特異抗體購自 Agrisera(Stockholm, Sweden ；website :www. agrisera. com ；product No. AS01010)，，結果如圖8B所示，Western blot條帶濃度表示蛋白相對表達量。條帶下面的數值代表蛋白表達的相對水平。設定Col中LHCB蛋白量為100，突變體中LHCB蛋白量與之相比進行量化。Actin為上樣對照，實驗三次重復得到相似的結果。從上述可以看出，LHCB6的mRNA和蛋白表達量在aba2突變體中均低于野生型。 ABA的處理可以恢復各個LHCB成員在aba2突變體中的表達水平，但是較高濃度的ABA處理 (> 20or > 40 μ M 處理 LHCB mRNAs ； > 20 μ M 處理除 LHCB5 蛋白的 LHCB 蛋白> 40 μ Μ) mRNA和蛋白水平在突變體中的表達均開始下降(圖8A，8B)。這些實驗結果表明LHCB6在轉錄和翻譯水平的正常表達需要ABA的參與。值得注意的是，在aba2突變體中，LHCB6對于ABA的響應在蛋白水平與mRNA水平完全一致(圖8A，8B)。然而，在aba2突變體中，刺激LHCB表達的最高濃度是野生型實驗體系中的三倍。二、Promoter-GUS 分析基因表達以野生型擬南芥的基因組DNA為模板，利用正向引物5’ -CCCAAGCTTCCGGACATGGG TTCAAATCA-3，和反向引物 5，-C GGGATCCAACCAAGCCCACTGAGGACA-3，擴增，得到 1109bp 的產物，將該產物送去測序，結果為該產物具有序列表中的序列6核苷酸，即為擬南芥 Atlgl5820(LHCB6)基因的啟動子 pLHCB6。將啟動子pLHCB6DNA利用I^stl/BamHI酶切位點，將啟動子片段連入載體到 pCAMBIAl391(Shang Y,Yan L,Liu ZQ，Cao Z，Mei C,Xin Q,Wu FQ，Wang XF,Du SY,Jiang Τ,Zhang XF,Zhao R，Sun HL,Liu R,Yu YT,Zhang D-P(2010)The Mg-chelatase H subunit antagonizes a group of WRKY transcription repressors to relieve ABA-responsive genes of inhibition. Plant Cell 22 :1909_1935，公眾可從清華大學獲得。含有 gus 基因。)中，轉化至農桿菌GV3101，通過花侵染法分別轉化野生型擬南芥(Col)，wrky40突變體及wrky40wrkyl8雙突變體(雙突變體構建方法將wrky40未開花的花苞用鑷子去除其雄蕊僅剩雌蕊，取下wrkylS中開花或未開花的花苞中的雄蕊，在剝離剩余的雌蕊柱頭上摩擦，使花粉充分接觸柱頭，將此雌蕊做標記，莢果成熟后得到雜交Fl代種子，將Fl代種子再次播種，F2代生長，經PCR鑒定可得到純合體。)，分別得到TO代轉pLHCB6的野生型擬南芥、TO代轉pLHCB6的wrky40突變體和TO代轉pLHCB6的wrky40wrkyl8雙突變體。將上述TO代植株傳代，得到T3代植株。采用GUS染色方法篩選T3代植株，GUS染色方法參照 Jefferson RA, Kavanagh ΤΑ, Bevan MW(1987) GUS fusions β -glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J 20 3901-3907，結果如圖9A-9I所示，(A)干種子；(B)和(C)萌發的種子；(D) 9天的幼苗；(E) 和(F)成熟葉片的氣孔；主要在氣孔的保衛細胞中表達。(G)根；(H)花；⑴角果。可以看出，LHCB6在T3代轉pLHCB6的野生型擬南芥的如上組織中均有LHCB6的表達。分別提取野生型擬南芥的不同組織的RNA，反轉錄得到cDNA，LHCB6 forward primer :5’ -GCGATGGCAGCGGTTCTTG-3’ reverse primer :5’ -CCATGGCGTTGCCCACTCA-3’ 內參β -Actin、內參的引物為 forward primer :5，-GGTAACATTGTGCTCAGTGGTGG-3，reverse primer 5，-AACGACCTTAATCTTCATGCTGC-3，，熒光定量 PCR 檢測，結果如圖 9J，LHCB6 在野生型植株中的根、莖、葉、花、角果和種子中的mRNA相對表達量分別為0. 05、0. 55、1. 75,0. 40、 0. 20,0. 00。三、WRKY40轉錄因子與LHCB家族成員的啟動子結合并抑制其表達嘗試研究直接作用于ABAR下游的一個關鍵轉錄抑制子——WRKY40轉錄因子是否能直接與LHCB的啟動子區域結合而調節LHCB的表達。1、通過染色質免疫共沉淀實驗的PCR和實時熒光定量PCR具體實驗見下述的圖10A-10D所示，圖10A為LHCB6基因啟動子的結構:ffn(ffl, W2,…)代表從左到右ff-box的順序及它們相對于起始密碼子(ATG)的位置。紅線代表CHIP分析(圖10B)中檢測的序列片段。 箭頭代表凝膠阻滯分析中所用的序列片段，同一片段用相同顏色的兩個箭頭表示，Pl, P2… 代表所選片段的數目。圖10B為WRKY40與LHCB6基因的啟動子互作
具體方法用WRKY40的N端特異抗體(WRKY40的N端的為genbank號 CP002684的第21-131位核苷酸，WRKY40的核苷酸序列為序列表的序列5，氨基酸序列為序列表中的序列4)進行CHIP分析的PCR電泳檢測結果(CHIP分析參照之前的方 法(Saleh A，Alvarez-Venegas R，Avramova Z (2008)An efficient chromatin immunoprecipitation (Chip)protocol for studying hi stone modifications in Arabidopsis plants. Nat Protoc 3 :1081-1025 ；Shang Y，Yan L，Liu ZQ, Cao Z，Mei C， Xin Q，Wu FQ，Wang XF，Du SY，Jiang T，Zhang XF，Zhao R，Sun HL，Liu R，Yu YT，Zhang D-P (2010) The Mg-chelatase H subunit antagonizes a group of WRKY transcription repressors to relieve ΑΒΑ-responsive genes of inhibition. Plant Cell 22: 1909-1935)。實驗材料為野生型擬南芥的兩周齡苗。WRKY40的特異抗體為WRKY40的N-端抗體(Shang Y，Yan L，Liu ZQ，Cao Z，Mei C，Xin Q，Wu FQ，Wang XF，Du S Y，Jiang T， Zhang XF，Zhao R，Sun HL，Liu R，Yu YT，Zhang D-P(2010) The Mg-chelatase H subunit antagonizes a group of WRKY transcription repressors to relieve ABA-responsive genes of inhibition. Plant Cell 22:1909-1935)。為了檢測 WRKY40 與 LHCB 啟動子的結合活性，參照(Mukhopadhyay A，Deplancke B, Walhout AJM, Tissenbaum HA(2008). Chromatin immunoprecipitation(Chip) coupled to detection by quantitative real-time PCR to study transcription factor binding to DNA in Caenorhabditis elegans. Nat Protoc 3 :698-709 ；Shang Y， Yan L, Liu ZQ, Cao 1, Mei C， Xin Q, Wu FQ, Wang XF, Du SY, Jiang T，Zhang XF, Zhao R，Sun HL, Liu R，Yu YT, Zhang D-P (2010) The Mg-chelatase H subunit antagonizes a group of WRKY transcription repressors to relieve ΑΒΑ-responsive genes of inhibition. Plant Cell 22 :1909-1935)方法，以 Actin2的3’非翻譯區序列為內參對照進行實時定量PCR檢測。內參引物Actin2:forward primer :5，-GGTAACATTGTGCTCAGTGGTGG-3，reverse primer :5，-AACGACCTTAATCTTCATGCTGC-3，啟動子片段的序列在(圖10A)中標示。結果如圖IOB所示，iInput'泳道野生型擬南芥兩周齡苗的基因組DNA為模板，擴增的PCR產物；‘control’泳道免疫前血清沉淀(抗體制作公司提供)得到的DNA為模板，擴增的PCR產物；‘LHCB-p’泳道:WRKY40N端特異抗體沉淀得到的DNA為模板，擴增的PCR產物。pLHCB6-l forward primer :5，-TCCCGTGACTTTGCCTCCA-3，reverse primer :5，-ACCAATAGAGTCCATCCCAACAAT-3，擴增得到的片段序列為序列7。可以看出，WRKY40與LHCB6基因的啟動子結合。圖IOC為WRKY40與LHCB6基因的啟動子互作用WRKY40的N端特異抗體進行CHIP 分析的熒光定量PCR。結果如IOC所示，Actin啟動子(Actin-p)(是以Actin2的3’非翻譯區序列為內參對照進行實時定量PCR的產物)為負對照。可以看出，LHCB6基因的啟動子(LHCB6_p)與WRKY40結合的相對結合率為沈。
23
每組數據都是三次獨立的生物學重復的平均值。顯示，WRKY40與LHCB基因的啟動子結合。圖IOD為酵母單雜交實驗酵母單雜交利用Clontech試劑盒(Matchmaker. One-Hybrid Library Construction&Screening Kit CATALOG No. 630304)提供的AH109 菌株。以野生型擬南芥植株全基因組DNA為模板，以下列引物進行PCR擴增，得到1137bp 產物(測序為序列表中的序列6的自5’末端第1-1137位核苷酸)LHCB6 promoter (1137bp)forward primer :5，-TCCCCCGGGACCAGTCAACATTAACGCCACC-3，reverse primer :5，-CGACGCGTTCCGGTGAGGAACGAAGAAC-3，用Smal/Mlul酶切1137 bp產物，與經同樣酶切的pHIS2載體(Clontech試劑盒 (Matchmaker One-Hybrid Library Construction&Screening Kit CATALOG No. 630304) 連接，得到 pHIS2-pLHCB6。利用AH109菌株的酵母單雜交方法根據手冊的說明進行。用包括靶基因啟動子的pHIS2載體和含有WRKY40開放讀碼框的獵物載體(pGADT7_WRKY40 (Clontech試劑盒 (Matchmaker One-Hybrid Library Construction&Screening Kit CATALOG No. 630304), 共同轉化酵母細胞。同時轉化空載體 pGADT7 (Clontech 試劑盒(MatchmakerTM One-Hybrid Library Construction&Screening Kit CATALOG No. 630304))和 pHIS2 O^lontech 試劑盒 (Matchmaker One-Hybrid Library Construction&Screening Kit CATALOG No. 630304)) 到酵母細胞，作為負對照。該實驗重復三次，得到同樣的結果。轉化后的酵母細胞先在SD-Trp-Leu培養基上生長確認載體轉化進入細胞，然后將轉化的細胞在SD-Trp-Leu-Hi s培養基上生長。SD-Trp-Leu或SD-Trp-Leu-Hi s培養基包含 25mM 3-AT (SIGMA) (WRKY40-LHCB1-, LHCB2-或 LHCB5-promoter 互作)或者 10mM(WRKY40-LHCB3啟動子或LHCB6-啟動子互作)。酵母平板在30°C生長3天。結果如10D所示，從圖中看出，WRKY40與LHCB6基因的啟動子結合。圖10E為凝膠阻滯實驗利用從大腸桿菌中純化的His-WRKY40融合蛋白(WRKY40 蛋白序列見序列4，為WRKY40的全長，將WRKY40蛋白編碼基因連接到pET48_b載體上，構成 His-WRKY40 融合蛋白，HIS 為 pET48-b 載體(Shang Y, Yan L，Liu ZQ, Cao Ζ,Mei C,Xin Q, Wu FQ,Wang XF,Du SY,Jiang Τ,Zhang XF,Zhao R，Sun HL,Liu R，Yu YT,Zhang D-P(2010) The Mg-chelatase H subunit antagonizes a group of WRKY transcription repressors to relieve ABA-responsive genes of inhibition. Plant Cell 22 :1909-1935,公眾可從清華大學獲得)上帶有的標簽)進行凝膠阻滯實驗，具體如下LHCB6啟動子的片段(測序為序列表中的序列6的自5’末端第704-905位核苷酸)是利用下述引物從PCR產物中純化而來的，模板為野生型Col的cDNA LHCB6 啟動子(pLHCB6 ；-374 _173，202bp) forward primer5' -A T T C A T T G C T G T C A T T T A C A T T T C - 3 ‘ reverse primer 5’ -GATAGATTTCTGACCAATTAGGAG-3'LHCB6啟動子在W-box的關鍵位點進行了突變，由GTCA變為GTTA或者TGAC變為TTAC，方法是利用下列引物(突變位點已下標)和上述相應引物進行兩次獨立的PCR:forward primer 5’ -ATTCATTGCTGTCATTTACATTTC-3’ reverse primer5， -GATAGATTTCTAACCAATTAGGAGTTAG-3，將 W-boxes Wl(GTCA_GTTA)和 W2(TGAC_ TTAC)突變；forward primer 5’ -AATTTCCACGTGTTATTTTATTTTCC-3’ reverse primer5，-GATAGATTTCTGACCAATTAGGAG-3，將 W_box W3 (GTCA_GTTA)突變；forward primer 5， -ATTCATTGCTGTTATTTACATTT-3，和 reverse primer5，-GATAGATTTCTGACCAATTAGGAG-3，將 W_box W4 (GTCA-GTTA)突變。LHCB6啟動子的W1-W4位置已標注在圖IOA0每一個啟動子利用由PCR擴增得來的等摩爾質量的片段，作為第三次PCR的模板。突變體的序列經測序鑒定。每一個啟動子的片段根據操作手冊由地高辛-dUTP (Roche，Mannheim，Germany)標記。標記反應的操作方法參照已發表的論文(Shang Y, Yan L，Liu ZQ, Cao Ζ,Mei C, Xin Q,ffu FQ, Wang XF, Du SY, Jiang Τ,Zhang XF,Zhao R，Sun HL,Liu R，Yu YT,Zhang D-P(2010)The Mg-chelatase H subunit antagonizes a group of WRKY transcription repressors to relieve ABA-responsive genes of inhibition. Plant Cell 22:1909-1935)。使用 50ng His_WRKY40 融合蛋白和 ^ng相應的地高辛標記過的啟動子片段。競爭性實驗使用5-20倍未標記片段。結果如圖10G，Y40 純化的6His_WRKY40融合蛋白；Lp 標記的啟動子探針(ATTCA TTGCTGTCATTTACATTTCAATAAGAAAATAAATTAATTTCCACGTGTCATTTTATTTTCCTCTCACAATTTAGATT TAGATAAGTAAAGTATTAGAAAAATGTAAATACTGAGTTGGCAGAATAAGACAGTGGTGAGTGTGGGTGATGTGGAT ATGGTGAAGTAGTTTCTGACTCCTAATTGGTCAGAAATCTATC ；5p, IOp, 20p 分別代表 5 倍，10 倍，20 倍非標記的探針量，(G)圖中Lpl/2mW，Lp3mff and Lp4mW分別代表對LHCB6啟動子中的第一個和第二個、第三個、第四個W-box進行點突變(Wl，W2，W3 and W4已在圖10A中標出)。 6His代表帶6個組氨酸標簽的肽，BSA代表牛血清白蛋白，6His和BSA分別作為負對照。該實驗重復三次，得到同樣的結果。驗證了 WRKY40與啟動子的結合(WRKY40與LHCB6的啟動子上W-box區域結合)。2、WRKWO與啟動子互作的體內實驗此實驗方法參照已發表的論文Shang Y，Yan L，Liu ZQ, Cao Z，Mei C，Xin Q，Wu FQ, Wang XF, Du SY, Jiang T, Zhang XF,Zhao R,Sun HL, Liu R, Yu YT, Zhang D-P(2010) The Mg-chelatase H subunit antagonizes a group of WRKY transcription repressors to relieve ΑΒΑ-responsive genes of inhibition. Plant Cell 22:1909-1935。WRKY40的cDNA利用下列引物通過PCR擴增得到(模板為野生型Col的cDNA)5， -CGCGGATCCATGGATCAGTACTCAT-3，和 reverseprimer5' -CCGCTCGAGCTATTTCTCGGTATGA-3，，PCR 產物(序列表中的序列幻利用 8&1^1/^101位點連接在卩81121載體(511&1^ Y, Yan L，Liu ZQ, Cao Ζ,Mei C,Xin Q,ffu FQ, Wang XF, Du SY, Jiang Τ, Zhang XF, Zhao R, Sun HL, Liu R, Yu YT, Zhang D-P(2010) The Mg-chelataseH subunit antagonizes a group of WRKY transcription repressors to relieve ΑΒΑ-responsive genes of inhibition. Plant Cell 22 :1909-1935，公眾可從清華大學獲得。)的CaMV 35S啟動子下游，得到PBI121-WRKY40。LHCB6啟動子利用下列引物擴增得到
LHCB6 forward primer5' -GGGGTACCTCCCGTGACTTTGCCTCCA-3，reverse primer5' -TCCCCCGGGTCCGGTGAGGAACGAAGAAC-3‘ (1109 bp)。擴增得到的片段序列為序列8。LUC的cDNA序列利用下列引物以包含LUC的cDNA片段的pGL3_Basic載體(Shang Y, Yan L, Liu ZQ, Cao Z, Mei C, Xin Q, Wu FQ, Wang XF, Du SY, Jiang T, Zhang XF, Zhao R, Sun HL, Liu R, Yu YT, Zhang D-P (2010)The Mg-chelatase H subunit antagonizes a group of WRKY transcription repressors to relieve ΑΒΑ-responsive genes of inhibition. Plant Cell 22 :1909_1935，公眾可從清華大學獲得。)為模板擴增得到: forward primer 5’ -TCCCCCGGGATGGAAGACGCCAAAAAC-3reverseprimer 5，-CGGGATCCTTACACGGCGATCTTTCCGC-3，，得到 LUC 的 cDNA。LHCB6啟動子利用KpnI/Smal位點連接pCAMBIA1300載體，得到 PCAMBIA1300-LHCB6。將LUC 的 cDNA 序列通過 Smal/BamHI 位點連接在 pCAMBIA1300_LHCB6 的 LHCB6 啟動子的下游，得到pLHCB-LUC (單轉)，轉入GV3101菌株，得到GV3101/pLHCB-LUC_LHCB6 (單轉)。將PBI121-WRIW40 轉入 GV3101 菌株，得到 GV3101/PBI121-WRKY40。用無針注射器將GV3101/pLHCB-LUC_LHCB6(單轉)注射進幼嫩同時完全伸展的七周的煙草 N. benthamiana 葉片(Shang Y, Yan L, Liu ZQ, Cao Z, Mei C, Xin Q, Wu FQ, Wang XF, Du SY, Jiang T, Zhang XF, Zhao R, Sun HL, Liu R, Yu YT, Zhang D-P(2010) The Mg-chelatase H subunit antagonizes a group of WRKY transcription repressors to relieve ΑΒΑ-responsive genes of inhibition. Plant Cell 22 :1909-1935，公眾可從清華大學獲得。)，得到轉pLHCB-luc煙草。用無針注射器將GV3101/pLHCB-LUC-LHCB6 和 GV3101/PBI121-WRKY40 混合菌液一同注射進幼嫩同時完全伸展的七周的N. benthamiana葉片；得到轉pLHCB_luc+WRKY40煙草。實驗組載體與對照組載體GV3101/pLHCB-LUC_LHCB6總量相同。注射后，將煙草黑暗處理12h，然后放在室溫(25度)條件16h/天光照下繼續生長 60h。LUC活性通過CCD(AndoriXon，Andor，UK)圖像設備觀察。以LUC空載體和對照組載體GV3101/pLHCB-LUC-LHCB6為對照，本實驗獨立重復五次以上，且實驗結果相同。結果如圖11所示，圖IlA為WRKY40和LHCB啟動子-熒光素酶(Luc)載體共同轉化煙草葉片的結果， 可以看出，活體內WRKY40顯著抑制LHCB6基因的啟動子活性。共轉pLHCB_LUC+WRKY40后， pLHCB-LUC的表達明顯變弱甚至不表達。實驗三次重復，得到同樣的結果。為了檢測LHCB基因的表達在這兩個突變體中是否受到影響，將 PCAMBIA1391-LHCB6轉化wrky40單突變體和wrky40wrkyl8雙突變體，得到野生型擬南芥 (Col)-⑶S、突變體 wrky40-GUS、雙突變體 wrky40/18_GUS。結果如圖IlB所示，圖IlB為野生型擬南芥(Col)-GUS、突變體wrky40_GUS、雙突變體wrky40/18-GUS的T3代純合體在13天的幼苗⑶S染色結果，其中，最上面(a，b)是野生型擬南芥(Col)-GUS，中間(c，d)是突變體wrky40-GUS，下面(e，f)是雙突變體 wrky40/18-GUS。可以看出，wrky40和wrky4018b中LHCB6的表達明顯增強。WRKY18是與 WRKY40同源性較高的基因，它與WRKY40共同參與ABA信號轉導過程。發現在wrky40單突變體和wrky40wrkyl8雙突變體中LHCB6基因的表達量顯著提高。圖1IC為檢測野生型擬南芥(Col)突變體wrky40、雙突變體wrky40/18的 LHCB6的mRNA表達和蛋白表達實時定量PCR檢測野生型擬南芥(Col)、突變體wrky40、 雙突變體 wrky40/18 的 LHCB6 的 mRNA 水平表達，LHCB6 forward primer :5，-GCGAT GGCAGCGGTTCTTG-3’ reverse primer :5’ -CCATGGCGTTGCCCACTCA-3’ 內參β -Actin、 內參的引物為 forward primer 5' -GGTAACATTGTGCTCAGTGGTGG-3‘ reverse primer 5’ -AACGACCTTAATCTTCATGCTGC-3’。免疫印跡檢測蛋白水平的表達，Actin為上樣對照擬南芥總蛋白提取方法參照 LHCB抗體供應商Agrisera建議的方案進行，SDS-PAGE和免疫印跡檢測參照Siang Y，Yan L, LiuZQ, Cao Z, Mei C, Xin Q, Wu FQ, Wang XF, Du SY, Jiang T, Zhang XF, Zhao R, Sun HL, Liu R, Yu YT, Zhang D-P (2010)The Mg-chelatase H subunit antagonizes a group of WRKY transcription repressors to relieve ΑΒΑ-responsive genes of inhibition. Plant Cell 22 :1909_1935。上述結果如圖IlC所示，方框中的數值代表蛋白的相對表達水平。設定Col (野生型擬南芥)中LHCB蛋白量為標準，突變體中LHCB蛋白量與之相比進行量化。免疫印跡分析進行三次獨立生物學重復，得到類似的結果。RT-PCR的每組數據是三次獨立生物學重復的平均值。可以看出，在wrky40單突變體和wrky40wrkyl8雙突變體中，LHCB6的表達量顯著提高，LHCB6蛋白表達量在wrky40單突變體中顯著提高。然而，在wrky40wrkyl8雙突變體中，LHCB6表達量沒有顯著變化。綜上所述，以上實驗結果表明，WRKY40和WRKY18共同抑制LHCB基因表達。為了研究ABA對LHCB表達的刺激作用在一定程度上依賴于ABAR和WRKY40的功能，進行如下實驗將cch、wrky40、col生長三天的幼苗分別移至含0、1、3、5μΜ ABA的培養基上繼續生長兩周后取樣檢測。實時定量PCR檢測野生型擬南芥(Col)、突變體wrky40、 雙突變體 wrky40/18 的 LHCB6 的 mRNA 水平表達，LHCB6 forward primer :5，-GCGAT GGCAGCGGTTCTTG-3’ reverse primer :5’ -CCATGGCGTTGCCCACTCA-3‘內參β -Actin、 內參的引物為 forward primer 5' -GGTAACATTGTGCTCAGTGGTGG-3，reverse primer 5’ -AACGACCTTAATCTTCATGCTGC-3’。免疫印跡檢測蛋白水平的表達，Actin為上樣對照擬南芥總蛋白提取方法參照 LHCB抗體供應商Agrisera建議的方案進行，SDS-PAGE和免疫印跡檢測參照Siang Y，Yan L, Liu ZQ, Cao Z, Mei C, Xin Q, Wu FQ, Wang XF, Du SY, Jiang T, Zhang XF, Zhao R, Sun HL, Liu R, Yu YT, Zhang D-P (2010)The Mg-chelatase H subunit antagonizes a group of WRKY transcription repressors to relieve ΑΒΑ-responsive genes of inhibition. Plant Cell 22 :1909-1935，實驗重復三次，結果一致。結果圖IlD和IlE所示，
其中，IlD左側圖所示，cch和野生型擬南芥相比，cch的LHCB6 ( ‘*’標出)在蛋
白水平的只有輕微升高。圖IlD右側圖所示，cch和wrky40相比，LHCB6的蛋白表達不受影響。根據免疫印跡條帶的濃度對蛋白表達量進行估計，以不進行ABA處理的野生型中的表達量為標準參照(柱形圖中紅色箭頭所示)。結果如圖IlE所示，在1，3，5μΜ的ABA 對LHCB6表達的刺激作用，在cch和wrky40突變體中顯著低于野生型中。數據為三次獨立生物學重復的平均值。Cch 在 0、1、3、5 μ M 的 ABA 處理下 LHCB6 相對表達量為 40,50,55,wrky40 突變體在 0、1、3、5 μ M 的 ABA 處理下 LHCB6 相對表達量為 500，500，500，co 1 在0、1、3、5 μ M的ABA處理下LHCB6相對表達量為100，400，270，150。四、ABAR和WRKY40的突變體影響ABA對LHCB表達的調控將abar-3突變體(ABAR等位基因的單點突變體，Shang Y, Yah L, Liu ZQ, Cao Z, Mei C, Xin Q, Wu FQ, Wang XF, Du SY, Jiang T, Zhang XF, Zhao R, Sun HL, Liu R, Yu YT, Zhang D-P (2010)The Mg-chelatase H subunit antagonizes a group of WRKY transcription repressors to relieve ΑΒΑ-responsive genes of inhibition. Plant Cell 22 :1909-1935,公眾可從清華大學獲得。)和野生型Col提取RNA和蛋白質，通過熒光定量PCR和免疫印跡檢測(檢測方法同上)LHCB基因mRNA和蛋白水平的表達，免疫印跡以Actin為上樣對照。蛋白條帶下方框內的數值代表LHCB蛋白的相對表達量。以Actin 條帶為標準。免疫印跡三次生物學重復，結果一致。每一個數值都是三次獨立生物學重復的平均值。結果如圖12所示，col的LHCB6基因mRNA相對表達量為1. 00 ；
abar-3突變體的LHCB6基因mRNA相對表達量為0. 75 ；結合上述LHCB家族成員的蛋白水平在低濃度ABA(1，3或5μΜ)處理下表達量提高，但是在cch和wrky40突變體中LHCB3，LHCB4和LHCB6響應ABA的能力顯著地下降的結果，表明ABA通過ABAR-WRKY40介導的信號通路促進LHCB的表達。五、ABAR和LHCB因的雙突變體具有對ABA脫敏的表型，cch突變體中過表達LHCB6 基因可以部分恢復其對ABA的脫敏表型Mf 雙突變體 lhcbl lhcb3，lhcbl lhcb6、lhcbl cch、lhcb3 cch、lhcb4 cch、lhcb6 cch和野生型Col提取RNA和蛋白質，通過熒光定量PCR和免疫印跡檢測(檢測方法同上) LHCB基因mRNA和蛋白水平的表達，免疫印跡以Actin為上樣對照。蛋白條帶下方框內的數值代表LHCB蛋白的相對表達量。結果如圖13所示圖13A為雙突變體lhcbl lhcb3, Ihcbl lhcb6 中不同 LHCB基因的表達，圖 1 為雙突變體 lhcbl cch、lhcb3 cch、lhcb4 cch、lhcb6 cch中不同LHCB基因的表達。mRNA水平的表達通過熒光定量PCR檢測(圖13A，13B中的柱形圖)，蛋白水平表達通過免疫印跡檢測，Actin為上樣對照。圖13A中蛋白條帶下面的數值表示LHCB蛋白的相對表達量，以野生型為標準進行比較量化。六個LHCB (LHCB1-LHCB6) 的表達在cch突變體(圖13B)及所有雙突變體(13A，13B)中都做了檢測。免疫印跡分析三次獨立生物學重復，結果相似。熒光定量PCR的每一個數值都是三次獨立生物學重復的平均值。
為了研究ABAR與LHCBs基因在遺傳學的上下游關系，以cch-lhcbs雙突變體 lhcbl cch，lhcb3 cch，lhcb4 cch，和lhcb6 cch為對象研究其響應ABA的表型。cch突變體中，LHCB基因表達量顯著下降(圖13B)。然而，單個LHCB下調的突變體(lhcbl，lhcb4， 或lhcb6)與cch雜交后得到的雙突變體與cch單突變體相較，LHCB家族基因含量并沒有顯著下調，反而促進了其他LHCB家族成員的表達。LHCB3敲除突變體與cch突變體雜交后得到的雙突變體中，LHCB3基因被敲除，但是LHCB2，LHCB4, LHCB6基因的mRNA被調高，LHCB4 蛋白水平表達被調高(圖13B)。這些數據說明在雙突變體中有一套復雜的反饋調節機制來維持LHCB基因家族整體的穩定性。六、調低或敲除LHCB基因影響活性氧的穩態和一系列參與ABA信號通路的基因和響應ABA的基因的表達1、影響活性氧的穩態眾所周知，活性氧(ROS)參與ABA信號轉導過程(Pei et al,2000 ；Murata et al,2001 ；Mustilli et al,2002 ；Kwak et al,2006 ；Miao et al,2006 ；Zhang et al, 2009)，并且在植物細胞中ROS主要產生于葉綠體中(Kwak et al，2006 ；Nott et al,2006 ； Galvez-Valdivieso和Mullineaux，2010)。葉綠體內，ROS的產生主要與光吸收和電子傳遞有關,而LHCB也在這兩個過程中起到重要作用(Jansson，1994，1999 ；Galvez-Valdivieso 和 Mullineaux，2010)。因此，檢測lh(A6突變體中ROS的含量。葉片取自土壤中生長三周的野生型擬南芥植株，在50mMKCl，IOmMMes-Tris (pH 6.15)并含有不同濃度的ABA的緩沖液中，置于200μΜο1 n^sec—1光照下預處理lh。然后將緩沖液中加入0. lmg/mL NBT(溶于IOOmM磷酸鉀溶液)并抽真空滲透使葉子染色 (Amresco, Solon, OH, USA)。樣品在室溫黑暗放置2h.然后移入80 %乙醇，沸水浴處理 IOmin,以去除葉綠素的干擾。保衛細胞中ROS含量的檢測利用H2DCF-DA(SIGMA，D6883) 浸染剝落的葉片表皮條，方法參照Miao Y，Lv D，Wang P，Wang XC，Chen J, Miao C， Song CP (2006)An Arabidopsis glutathione peroxidase functions as both a redox transducer and a scavenger in abscisic acid and drought stress responses. Plant Cell 18 :2749-2766。在含有0(相同體積乙醇作為對照)或者5 μ M(士)-ABAMES-Tris緩沖液(同上文)中預處理表皮條，促進氣孔張開。然后將表皮條浸入50mMTriS-KCl(pH 7.2) 包含50mM H2DCF-DA的緩沖液中黑暗處理20分鐘。利用MES-Tris緩沖液漂洗樣品，去除多余的染料。利用fluorescence microscopy (Olympus, BX51, Japan)檢測表皮條中的熒光。ROS浸染熒光按一下參數觀察激發光，488nm;透射光，525nm。實驗結果如圖14所示， 圖14A為NBT染色檢測不同濃度ABA (野生型col 0-50 μ Μ, lhcb6突變體中0_10 μ Μ)處理野生型和Ihcbs突變體葉片后ROS的產生。實驗重復三次得到相似的結果。圖14Β為圖14Α中ROS產生的量化。通過掃描染色亮度進行估計，將野生型中ROS 的染色濃度定為100%，其他與之相比進行量化。結果為lhcb6 在 O、5、10 μ MABA 處理下的 ROS 量為 150%，50%，50% ；col 在 0、5、10、50μΜΑΒΑ 處理下的 ROS 量為 100%，150%，100%，50% ；圖14C為5 μ M ABA處理野生型和不同Ihcb突變體的表皮條，通過&DCF_DA染色觀察保衛細胞中的ROS產生情況。實驗三次重復得到類似的結果。
圖14D為實時定量PCR檢測Ihcbs突變體中一系列ABA響應基因的表達。每組數據都是三次獨立生物學重復的平均值。從上述可以看出，Ihcb突變體中ROS的含量高于野生型植株，這在葉片和保衛細胞中都有體現(圖14A至C)。發現用較低濃度(1至5 μ M)的ABA處理葉片會促進ROS的產生。這與以前的研究結果一致(Pei et al,2000 ；Murata et al,2001 ；Mustilli et al, 2002 ；Kwak et al，2006 ；Miao et al，2006 ；Zhang et al，2009)；而用較高濃度(10 μ M)的 ABA處理就不再有促進效應甚至會降低ROS的含量(50 μ Μ)(圖14Α)。然而在Ihcb突變體中，用較低濃度ABA處理植株，不論是完整的葉片(1至10 μ M ΑΒΑ,圖14Α和圖12Β)還是保衛細胞內(5 μ M ABA處理，圖14C)的ROS含量都下降。這些實驗結果表明調低或敲除LHCB 基因都將影響植物細胞內ROS的穩態和ROS對ABA的響應。2、調低或敲除LHCB基因影響一系列參與ABA信號通路的基因和響應ABA的基因的表達采用熒光定量檢測了 Ihcb突變體1-6中下列參與ABA信號通路基因及ABA響應基因的表達ABF1，ABF2/AREB1, ABF3, ABF4/AREB2 (Choi et al，2000 ；Uno et al，2000)， ABIl (Leung et al, 1994 ；Meyer et al, 1994 ；Gosti et al, 1999), ABI2 (Leung et al, 1997), ABI3(Giraudat et al，1992)，ABI4(Finkelstein et al，1998)，ABI5 (Finkelstein and Lynch, 2000), ERDlO (Kiyosue et al，1994)，KINl 禾口 KIN2 (Kurkela and Borg-Franck, 1992)，MYB2 和 MYC2 (Abe et al，2003)，OSTl (Mustilli et al，2002)，RAB18 (Lang and Palva, 1992), RD29A (Yamaguchi-Shinozaki and Shinozaki，1994)。引物如下
ABFl(Atlg49720)
forward primer :5，-TCAACAACTTAGGCGGCGATAC-3’
reverse primer :5，-GCAACCGAAGATGTAGTAGTCA-3’
ABF2 (Atlg45249)
forward primer :5，-TTGGGGAATGAGCCACCAGGAG-3’
reverse primer :5，-GACCCAAAATCTTTCCCTACAC-3’
ABF3(At4g34000)
forward primer :5，-CTTTGTTGATGGTGTGAGTGAG-3’
reverse primer :5，-GTGTTTCCACTATTACCATTGC-3’
ABF4(At3gl9290)
forward primer :5，-AACAACTTAGGAGGTGGTGGTC-3’
reverse primer :5，-CTTCAGGAGTTCATCCATGTTC-3’
ABIl(At4g26080)
forward primer :5，-AGAGTGTGCCTTTGTATGGTTTTA-3’
reverse primer :5，-CATCCTCTCTCTACAATAGTTCGCT-3
ABI2(At5g57050)
forward primer :5，-GATGGAAGATTCTGTCTCAACGATT-3
reverse primer :5，-GTTTCTCCTTCACTATCTCCTCCG-3’
ABI3(At3g24650)j
forward primer5-TCCATTAGACAGCAGTCAAGGTTT-3，
reverse primer5-GGTGTCAAAGAACTCGTTGCTATC-3，
ABI4(At2g40220)
forward primer5-GGGCAGGAACAAGGAGGAAGTG-3，
reverse primer5-ACGGCGGTGGATGAGTTATTGAT-3，
ABI5(At2g36270)
forward primer5-CAATAAGAGAGGGATAGCGAACGAG-3，
reverse primer5-CGTCCATTGCTGTCTCCTCCA-3’
ERDlO(Atlg20450)
forward primer5-TCTCTGAACCAGAGTCGTTT-3’
reverse primer5-CTTCTTCTCACCGTCTTCAC-3，
KINl(At5gl5960)
forward primer5-ACCAACAAGAATGCCTTCCA-3’
reverse primer5-CCGCATCCGATACACTCTTT-3’
KIN2(At5gl5970)
forward primer5-ACCAACAAGAATGCCTTCCA-3’
reverse primer5-ACTGCCGCATCCGATATACT-3’
MYB2(At2g47190)
forward primer5-TGCTCGTTGGAACCACATCG-3’
reverse primer5-ACCACCTATTGCCCCAAAGAGA-3，
MYC2(Atlg32640)
forward primer5-TCATACGACGGTTGCCAGAA-3’
reverse primer5-AGCAACGTTTACAAGCTTTGATTG-3，
OSTl (At4g33950)
forward primer5-TGGAGTTGCGAGATTGATGAGAG-3，
reverse primer5-CCTGTGGTTGATTATCTCCCTTTTT-3，
RAB18(At5g66400)
forward primer5-CAGCAGCAGTATGACGAGTA-3’
reverse primer5-CAGTTCCAAAGCCTTCAGTC-3’
RD29A(At5g52310)
forward primer5-ATCACTTGGCTCCACTGTTGTTC-3，
reverse primer5-ACAAAACACACATAAACATCCAAAGT-3，
結果如圖14D所示，其中十個重要的基因:ABI4, ABI5, ERD10, KIN1, KIN2, MYB2,
MYC2，OST1, RAB18和RD29A在Ihcb突變體中的表達被顯著抑制。所有這些被抑制的基因都是正響應ABA的基因或編碼ABA信號通路的正調節子。三個編碼重要轉錄因子——ABA 信號通路的正調節子的基因，ABFl, ABF4和ABI3，在lhcb2，lhcb4，lhcb5突變體中也被顯著抑制。ABFl和ABF4在IhcM突變體中的表達并沒有明顯變化，ABI3的表達在Ihcbl和 lhcb3突變體中也沒有顯著變化(圖14D)。然而，ABIl和ABI2這兩個直接作用于ABA受體PYR/PYL/RCAR(Fujii et al，2009)下游的，編碼ABA信號通路負調節子的基因，在Ihcb突變體中的表達量并沒有顯著變化(圖14D)。相反地，ABF2和ABF3這兩個編碼ABA信號通路正調節子的基因在除lh(A5和lhcb6以外的Ihcb突變體中表達量上調，在lh(A5和 lhcb6突變體中，ABF2和ABF3基因表達量沒有明顯變化(圖14D)。這些ABA信號轉導過程相關基因的表達量變化從根本上說明LHCB基因ABA信號的正調節子，但是這其中有一個潛在的復雜機制。九、調低或者敲除LHCB基因部分抑制wrky40突變體對ABA敏感的表型1、蛋白表達和萌發速率將 wrky401hcbl> wrky401hcb3> wrky401hcb6 突變體(wrky40Ihcbl 雙突變體構建方法將Ihcbl未開花的花苞用鑷子去除其雄蕊僅剩雌蕊，取下wrky40中開花或未開花的花苞中的雄蕊，在剝離剩余的雌蕊柱頭上摩擦，使花粉充分接觸柱頭，將此雌蕊做標記， 莢果成熟后得到雜交Fl代種子，將Fl代種子再次播種，F2代生長，經PCR鑒定可得到純合體；wrky401hcb3雙突變體構建方法將Ihcb殊開花的花苞用鑷子去除其雄蕊僅剩雌蕊，取下wrky40中開花或未開花的花苞中的雄蕊，在剝離剩余的雌蕊柱頭上摩擦，使花粉充分接觸柱頭，將此雌蕊做標記，莢果成熟后得到雜交Fl代種子，將Fl代種子再次播種，F2代生長，經PCR鑒定可得到純合體；wrky401hcb6雙突變體構建方法將lhcb6未開花的花苞用鑷子去除其雄蕊僅剩雌蕊，取下wrky40中開花或未開花的花苞中的雄蕊，在剝離剩余的雌蕊柱頭上摩擦，使花粉充分接觸柱頭，將此雌蕊做標記，莢果成熟后得到雜交Fl代種子，將 Fl代種子再次播種，F2代生長，經PCR鑒定可得到純合體)>wrky40和野生型Col提取RNA 和蛋白質，通過熒光定量PCR和免疫印跡檢測(檢測方法同上)LHCB6基因mRNA和蛋白水平的表達，免疫印跡以Actin為上樣對照。蛋白條帶下方框內的數值代表LHCB蛋白的相對表達量，并統計春化后72小時的萌發速率。以col為對照。結果如圖15A所示，wrky401hcbl在0、0. 5、1、3μΜΑΒΑ培養基上的萌發速率為 100%,80%,65%,40% ；wrky401hcb3 在 0、0. 5、1、3μΜΑΒΑ 培養基上的萌發速率為 100 %、85 %、65 %、 50% ；wrky401hcb6突變體在0、0. 5、1、3 μ MABA培養基上的萌發速率為100%、80%、 62%,47% ；wrky40 在 0、0. 5、1、3μΜΑΒΑ 培養基上的萌發速率為 100%、75%、50%、25% ；col 在 0,0. 5、1、3 μ MABA 培養基上的萌發速率為 100% ,100% ,90% ,59% ；可以看出，雙突變體可以顯著抑制wrky40突變體在ABA抑制種子萌發方面對于 ABA敏感的表型。2、LHCBl，LHCB3, LHCB6表達量降低使wrky40突變體在萌發后生長方面對ABA的敏感性減弱將 wrky401hcbl、wrky401hcb3、wrky401hcb6 突變體、wrky40 種子直接播種在不含或含(0.6 μ M) ABA的培養基上生長9天后的結果。結果如圖15Β所示，上圖為表型觀察圖，下面的柱形圖顯示了在含有0.6μΜ ABA 的培養基上生長9天后，野生型和突變體主根伸長長度；wrky40Ihcbl的主根伸長長度為0. 58cm ；wrky401hcb3的主根伸長長度為0. 58cm ；
wrky401hcb6突變體的主根伸長長度為0. 58cm ；wrky40的主根伸長長度為0. 34cm ；col的主根伸長長度為1. OOcm ；3、在ABA誘導氣孔關閉(上)及ABA抑制氣孔開放方面，LHCB1, LHCB3, LHCB6表達量降低不影響wrky40突變體對ABA的響應將 wrky401hcbl> wrky401hcb3、wrky401hcb6 突變體、wrky40 種子直接播種在含 (0. 6 μ Μ) ABA的培養基上生長9天后的結果。結果如圖15C所示，wrky40Ihcbl 在 0 μ M ABA 處理 0h、0 μ M ABA 處理 2. 5h、20 μ M ΑΒΑ 處理 2. 5h、 30 μ MABA處理2. 5h誘導氣孔關閉的氣孔開度分別為6. 0 μ m、5. 9 μ m、2. 5 μ m、0. 9 μ m ；wrky401hcb3 在 0 μ M ABA 處理 0h、0 μ M ABA 處理 2. 5h、20 μ M ABA 處理 2. 5h、 30 μ MABA處理2. 5h誘導氣孔關閉的氣孔開度分別為5. 7 μ m、5. 9 μ m、2. 0 μ m、1. 0 μ m ；wrky401hcb6 在 0 μ M ABA 處理 0h、0 μ M ABA 處理 2. 5h、20 μ M ABA 處理 2. 5h、 30 μ MABA處理2. 5h誘導氣孔關閉的氣孔開度分別為6. 0 μ m、5. 9 μ m、2. 5 μ m、1. 0 μ m ；wrky40 在 0 μ M ABA 處理 0h、0 μ M ABA 處理 2. 5h、20 μ M ABA 處理 2. 5h、30 μ MABA 處理2. 5h誘導氣孔關閉的氣孔開度分別為5. 9 μ m、5. 9 μ m、2. 7 μ m、0. 8 μ m ；col 在 0 μ M ABA 處理 0h、0 μ M ABA 處理 2. 5h、20 μ M ABA 處理 2. 5h、30 μ MABA 處理2. 5h誘導氣孔關閉的氣孔開度分別為6. 0 μ m、6. 0 μ m、2. 3 μ m、1. 0 μ m ；wrky40Ihcbl 在 0 μ M ABA 處理 0h、0 μ M ABA 處理 2. 5h、20 μ M ABA 處理 2. 5h、 30 μ MABA處理2. 5h抑制氣孔開放的氣孔開度分別為0. 8 μ m、6. 0 μ m、3. 0 μ m、l. 0 μ m ；wrky401hcb3 在 0 μ M ABA 處理 0h、0 μ M ABA 處理 2. 5h、20 μ M ABA 處理 2. 5h、 30 μ MABA處理2. 5h的抑制氣孔開放的氣孔開度分別為0. 8 μ m、5. 8 μ m、3. 0 μ m、l. 2 μ m ；wrky401hcb6 在 ΟμΜ ABA 處理 ΟΚΟμΜ ΑΒΑ 處理 2. 5h、20 μ M ΑΒΑ 處理 2. 5h、 30 μ MABA處理2. 5h的抑制氣孔開放的氣孔開度分別為0. 8 μ m、5. 6 μ m、3. 0 μ m、l. 0 μ m ；wrky40 在 0 μ M ABA 處理 0h、0 μ M ABA 處理 2. 5h、20 μ M ABA 處理 2. 5h、30 μ MABA 處理2. 5h的抑制氣孔開放的氣孔開度分別為0. 6 μ m、5. 8 μ m、2. 8 μ m、l. 2 μ m ；col 在 0 μ M ABA 處理 0h、0 μ M ABA 處理 2. 5h、20 μ M ABA 處理 2. 5h、30 μ MABA 處理2. 5h的抑制氣孔開放的氣孔開度分別為0. 8 μ m、5. 7 μ m、2. 9 μ m、l. 0 μ m ；1-3每組數據為三次獨立生物學重復的平均值。以前的實驗結果證明wrky40突變體在ABA抑制種子萌發、抑制幼苗生長方面表現出對ABA敏感的表型，但是在ABA誘導的氣孔關閉與ABA抑制氣孔開放方面未表現出響應 ABA的表型。將lhcbl、lhcb3、lhcb6突變體分別與wrky40突變體雜交發現，雙突變體可以顯著抑制wrky40突變體在ABA抑制種子萌發和幼苗生長方面對于ABA敏感的表型(圖 15A，15B)；但是對于wrky40突變體在響應ABA誘導的氣孔關閉和ABA抑制氣孔開放方面的表型并沒有改變(圖15C)。這可能是因為WRKY40參與的ABA信號通路在調節氣孔運動方面有一套復雜的機制引起的，在這個過程中WRKY40功能的缺失可能會導致ABA信號通路復雜的效應。然而，這些數據提供了足夠的遺傳學證據表明LHCB作用于WRKY40轉錄因子的下游，與LHCB基因是WRKY40轉錄抑制子的直接靶基因結果一致。十、突變體lhcbl-6的分子和生化鑒定
圖 16 (A-F) LHCB1-6 的 T-DNA 插入示意圖.A，lhcbl-1 (salk-134810)； B, lhcb2(salk-005614) ；C, lhcb3(salk-036200) ；D, lhcb4 (salk-032779) ；Ε, lhcb5(salk-139667) ；F, lhcb6 (salk-074622). LP 和 RP 分別是鑒定 Ihcbs 用的基因組上左端引物和右端引物；LBal, T-DNA序列左端引物；RBal, T-DNA序列右端引物；T-DNAl和 T-DNAn分別代表插入的同一位點插入的第一個拷貝和最后一個拷貝(一個以上拷貝反向串聯插入)。圖16 (A)在LHCBl中，單拷貝的T-DNA序列插入到LHCBl基因的promoter區，具體的插入位置在啟始密碼子ATG上游-592nt和_523nt之間，插入導致70bp缺失；圖16(B)在LHCB2中，T-DNA序列插入到LHCB2基因的啟動子區，具體的插入位置在啟始密碼子ATG上游-102nt和之間，插入導致Mbp的缺失；圖16(C)LHCB3中，T-DNA序列插入到LHCB3基因的第一個外顯子區，具體的插入位置在啟始密碼子ATG下游120nt和125nt之間，插入導致6bp的缺失；圖16(D)LHCB4中，T-DNA序列以反向串聯的方式插入到LHCB4基因的promoter 區，具體的插入位置在啟始密碼子ATG上游-1263nt和-1247nt之間，插入導致17bp的缺失；圖16(E)LHCB5中，T-DNA序列插入到LHCB5基因的promoter區，具體插入位置在啟始密碼子ATG上游-483nt和_477nt之間，插入導致7bp的缺失；圖16(F)LHCB6中，T-DNA序列插入到LHCB6基因的promoter區，具體插入位置在啟始密碼子ATG上游-391nt和_346nt之間，插入導致46bp的缺失。圖16 (G) RT-PCR和western blot檢測突變體Ihcbl 6中LHCB的轉錄和翻譯水平。免疫印跡檢測以Actin為上樣對照。實時定量PCR的柱形圖，以野生型中相應基因的表達設為標準，突變體中的表達量為相對值，其中Ihcbl-I，lhcb2，hcb4, lhcb5, lhcb6 是被不同程度調低的，lhcb3是基因敲除突變體。Western blot檢測，方框中的數值代表蛋白表達的相對水平。設定Col中LHCB蛋白量為100，突變體中LHCB蛋白量與之相比進行量
化。該實驗重復三次，結果一致。圖16(H)突變體(lhcbl lhcb6)中葉綠素a/b含量沒有顯著受到影響。左圖 不同突變體中葉綠素a、葉綠素b及總的葉綠素含量。每一個數值都是三次獨立生物學重復的平均值。右圖不同突變體的幼苗生長狀態沒有葉綠素缺失的表型。十一、不同Ihcb突變體中內源ABA含量及干物質含量測定分析材料為生長兩周的幼苗(野生型擬南芥col和突變體lhcb6)。(A) ABA水平。試劑盒通過ELISA測定蓮座葉片中的ABA含量(Sigma試劑盒，Plant GrowthRegulator Immmunoassay DETECTION Kit)。(B)通過干重/鮮重估計干物質含量。結果如圖17所示，顯示突變體與野生型中的ABA及干物質含量沒有顯著差異。十二、wrky40 及 wrky40wrkyl8 突變體沒有 gun 表型A、將野生型Col、cch, wrky40單突變體、wrky40wrkyl8雙突變體種子直接播在不含或含5yMNF(NF Aorflurazon，是一種除草劑，將它添加進培養基后，幼苗的質體發育被嚴重破壞，質體向細胞核發出質體-核逆向信號；而這個過程產生的突變體，即不受NF影響，細胞核能繼續編碼質體基因的表型為與核解偶聯的表型——GUN表型)的培養基上，春化三天后，放到IOOym0InT2s-1光照下，進行M小時連續光照，6天后取樣熒光定量PCR檢測。實驗重復三次得到同樣的結果。引物為以 LHCB6 forward primer 5‘-GCGATGGCAGCGGTTCTTG-3‘reverse primer 5，-CCATGGCGTTGCCCACTCA-3，為引物，以 β -Actin 為內參、內參的引物為 forward primer 5， -GGTAACATTGTGCTCAGTGGTGG-3， reverse primer 5’ -AACGACCTTAATCTTCATGCTGC-3，，結果如圖18A所示，在wrky40單突變體及wrkywrkyl8雙突變體中均檢測不到LHCBsmRNA的表達。B、將野生型Col、cch, wrky40單突變體種子直接播在不含或含5 μ MNF的培養基上，春化三天后，放到100 μ Hi0InT2s-1光照下，進行M小時連續光照，6天后取樣免疫印跡檢測。實驗重復三次得到同樣的結果。結果如圖18Β所示，與在野生型、wrky40及wrkywrkyl8突變體一樣，NF處理cch 后，LHCBs六個基因的表達均檢測不到，顯示了 GUN-type葉綠體反向信號的復雜性。所有這些結果表明wrky40和wrky40wrkyl8突變體是非gun突變體。從上述可以看出，LHCBs蛋白響應生理水平濃度ABA而增加的一個模式圖如圖19 所示，WRKY40轉錄因子抑制LHCB的表達，ABA促進WRKY40從細胞核進入細胞質，促進ABAR 與WRKY40互作，通過下調WRKY40的表達解除對LHCBs (LHCB1/2/3/4/5/6)基因的抑制作用。細胞質內合成的LHCB蛋白轉運到葉綠體以維持LHCB蛋白的穩態，使植物適應環境的挑戰，LHCB蛋白的穩態對ROS穩態的建立是必需的。
權利要求
1.一種控制植物性狀的方法，是提高出發植物中LHCB6蛋白編碼基因的表達，得到具有下述1)或幻特征的目的植物1)耐逆性高于所述出發植物；2)生長延緩于所述出發植物。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述目的植物生長延緩于所述出發植物為如下A或B A、所述目的植物種子的萌發遲于所述出發植物；B、所述目的植物根的生長遲于所述出發植物；所述提高出發植物中LHCB6蛋白編碼基因的表達是在激素脅迫下進行； 所述激素具體為ABA ；所述LHCB6蛋白的編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列1。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于 所述耐逆性為耐干旱性；所述出發植物為單子葉植物或雙子葉植物，所述單子葉植物為擬南芥。
4.根據權利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于所述提高出發植物中LHCB6蛋白編碼基因的表達是通過向出發植物中導入所述LHCB6 編碼基因實現的。
5.根據權利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于 所述ABA脅迫為在植物幼苗期或者植物成齡期進行；所述在植物幼苗期ABA脅迫的濃度為0. 5-5 μ M ；所述在植物幼苗期ABA脅迫的濃度具體為 0. 5 μ Μ、1 μ Μ、2 μ Μ、3 μ Μ、或 5 μ M ；所述在植物成齡期ABA脅迫的濃度低于200 μ Μ,所述在植物成齡期ABA脅迫的濃度具體為 20 μ Μ、50 μ Μ、100 μ Μ、150 μ Μ、200 μ Μ、300 μ Mo
6.根據權利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于 所述耐干旱性通過氣孔開度和/或失水率體現； 所述根生長通過主根長度體現。
7.根據權利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于所述提高LHCB6蛋白編碼基因的表達是通過外源ABA激活ABAR-WRKY40信號通路實現。
8.根據權利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于所述激活ABAR-WRKY40信號通路為外源的ABA激活植物的ABA受體，使ABA受體與結合有轉錄因子WRKY40的LHCB6啟動子競爭結合轉錄因子WRKY40，釋放LHCB6的啟動子，使 LHCB6蛋白編碼基因表達；所述ABA受體的氨基酸序列為序列表中的序列2 ；所述ABA受體的編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列3 ；所述轉錄因子WRKY40的氨基酸序列為序列表中的序列4 ；所述轉錄因子WRKY40的編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列5 ；所述LHCB6啟動子的核苷酸序列為序列表中的序列6。
9.一種控制植物性狀的方法，是降低目的植物中LHCB6蛋白編碼基因的表達，得到具有下述1)或幻特征的植物1)耐逆性低于所述目的植物；2)生長快于所述目的植物。
10.根據權利要求9所述的方法，其特征在于 所述植物的生長快于所述出發植物為如下A或B A)所述植物的種子的萌發早于所述目的植物；B)所述植物的根的生長早于所述目的植物；所述降低目的植物中LHCB6蛋白編碼基因的表達是在激素脅迫下進行； 所述激素具體為ABA ；所述LHCB6蛋白的編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列1 ； 所述耐逆性為耐干旱性；所述出發植物為單子葉植物或雙子葉植物，所述單子葉植物為擬南芥； 所述ABA脅迫為在植物幼苗期或者植物成齡期進行；所述在植物幼苗期ABA脅迫的濃度為0. 5-5 μ M ；所述在植物幼苗期ABA脅迫的濃度具體為 0. 5 μ Μ、1 μ Μ、2 μ Μ、3 μ Μ、或 5 μ M ；所述在植物成齡期ABA脅迫的濃度低于200 μ Μ,所述在植物成齡期ABA脅迫的濃度具體為 20μΜ、50μΜ、100μΜ、150μΜ、200μΜ、300μΜ ；所述耐干旱性具體通過氣孔開度和/或失水率體現； 所述根生長具體通過主根長度體現；所述降低LHCB6蛋白編碼基因的表達是通過外源ABA激活ABAR-WRKY40信號通路實現；所述激活ABAR-WRKY40信號通路具體為外源的ABA激活植物的ABA受體，使ABA受體與結合有轉錄因子WRKY40的LHCB6啟動子競爭結合轉錄因子WRKY40，釋放LHCB6的啟動子，使LHCB6蛋白編碼基因表達；所述ABA受體的氨基酸序列為序列表中的序列2 ；所述ABA受體的編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列3 ；所述轉錄因子WRKY40的氨基酸序列為序列表中的序列4 ；所述轉錄因子WRKY40的編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列5 ；所述LHCB6啟動子的核苷酸序列為序列表中的序列6。
11.一種提高植物耐逆性或延緩植物生長的方法，包括如下步驟用ABA對植物進行脅迫，得到具有如下性狀的植物1)目的植物耐逆性高于出發植物；2)目的植物的生長延緩于出發植物；將處理前的植物記作出發植物，將處理后的植物記作目的植物。
12.根據權利要求11所述的方法，其特征在于 所述ABA脅迫為在植物幼苗期或者植物成齡期進行；所述在植物幼苗期ABA脅迫的濃度為0. 5-5 μ M ；所述在植物幼苗期ABA脅迫的濃度具體為 0. 5 μ Μ、1 μ Μ、2 μ Μ、3 μ Μ、或 5 μ M ；所述在植物成齡期ABA脅迫的濃度低于200 μ Μ,所述在植物成齡期ABA脅迫的濃度具體為 20μΜ、50μΜ、100μΜ、150μΜ、200μΜ、300μΜ ；所述出發植物為單子葉植物或雙子葉植物，所述單子葉植物為擬南芥。
全文摘要
本發明公開捕光色素葉綠素a/b結合蛋白LHCB6在植物育種中的應用。本發明提供了LHCB6蛋白提高植物耐逆性中的應用。所述提高植物耐逆性受激素脅迫。所述激素為ABA；所述LHCB6蛋白的編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列2。所述提高植物耐逆性為如下1)或2)1)向LHCB6表達失活的突變體植物中導入LHCB6蛋白的編碼基因，得到LHCB6蛋白表達恢復的植物，所述LHCB6蛋白表達恢復的植物的耐逆性高于所述LHCB6蛋白表達失活的突變體；2)LHCB6蛋白表達失活的突變體的耐逆性高于LHCB6表達的植物。本發明的實驗證明，ABA調節LHCB6的表達是通過ABAR/CHLH參與的信號通路。
文檔編號C12N15/84GK102229955SQ20111014893
公開日2011年11月2日 申請日期2011年6月3日 優先權日2011年6月3日
發明者嚴璐, 劉志強, 劉蕊, 張大鵬, 徐艷紅, 王小芳 申請人:清華大學