專利名稱：高產桿狀病毒的轉基因卵巢細胞系及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及ー種轉基因昆蟲細胞系及其制備方法和應用，尤其涉及ー種高產桿狀病毒的轉基因卵巢細胞系及其制備方法和應用，屬于轉基因動物技術領域。
背景技術：
昆蟲細胞系的主要用途表現在作為研究材料，一直是生理學、發育生物學、細胞生物學、分子生物學和生物化學等科學研究的重要工具；作為桿狀病毒表達載體系統的重要組成部分，可表達具有重大經濟價值和科學意義的外源蛋白質；作為生物反應器，擴增昆蟲桿狀病毒，特別是含有外源基因的重組桿狀病毒，生產生物殺蟲劑。昆蟲細胞系具有重要的經濟和應用價值，但它的建立往往需要消耗大量的時間和精力。據報道，在1965年第一株昆蟲細胞系成功建立后至今，近40年的時間內，已經建立的昆蟲細胞系超過500種。它們分別來源于鱗翅目、雙翅目、同翅目、膜翅目、直翅目和鞘翅目等170多種昆蟲，其中大部 分來源于鱗翅目和雙翅目昆蟲。鱗翅目(L印idoptera)是昆蟲綱第二大的目，全世界已知種達十萬種以上，與農業有關的有兩個亞目。鱗翅目昆蟲具有重大經濟意義，除極少數取食顯花植物外，許多是農林重要害蟲。建立鱗翅目昆蟲細胞系為科學研究與生物防治提供了寶貴的生物學材料。鱗翅目的細胞系來源于多種組織，包括卵巣、胚胎、血細胞、脂肪體等。到目前為止，來自甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)的細胞系共有6株。Gelernter和 Federici(Gelernter, W. D. and B.A.Federici J. Invertebr. Pathol. 1986, 48 :199 207)從剪碎的甜菜夜蛾初孵幼蟲組織中，建立了甜菜夜蛾第一個細胞系UCR-SE-1。經克隆形成法，他們又從UCR-SE-I細胞系中分離了 SE-UCR-IA細胞系。在SE-UCR-IA細胞系的基礎上，Mccarthy 和 Mckedy (Mccarthy W J, Mckedy D. Dev. Biol. , 1990, 26 (8) :824 828)篩選獲得一個缺失了核苷激酶的細胞系。Hara等(Hara, K. , K. Tsuda, M. Funakoshiand T. Kawarabata In Vitro Cell. Dev. Biol. 1993，29A (12) :904 907)也從甜菜夜蛾初孵幼蟲組織中建立了第二株細胞系Se3HL Se3Hl對SeNPV敏感，生長速度比UCR-SE-I快。經克隆分離的Se301細胞系100%能被SeNPV感染，生長速度比Se3Hl快，產生的空斑比Se3Hl大。第三株Le-H-HNU7細胞系是通過甜菜夜蛾血細胞建立的，該細胞系對斜紋夜蛾核多角體病毒敏感。第四株SeHe920-la細胞系也是來源于甜菜夜蛾血細胞，接入微孢子蟲(Vairimorpha sp.)的孢子后，比其它來源于鱗翅目昆蟲非血細胞的細胞系具有更高的感染細胞能力。其12個克隆株SeHe920Yl至SeHe920Y12中SeHe920Y7感染微孢子蟲的能力最強。另外兩株是由本實驗室建立的來源于甜菜夜蛾幼蟲脂肪體的細胞系，這兩株細胞系對甜菜夜蛾核型多角體病毒和苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒均非常敏感。盡管前述文獻已有甜菜夜蛾細胞系的有關報道,然而到目前為止,還沒有來源于甜菜夜蛾卵巣的細胞系。昆蟲的卵巣通常是成對的，是卵子發生和發育的場所。卵巢是由卵巣管(ovariole)組成，在各類昆蟲中卵巣管的數目差異很大，鱗翅目昆蟲一般為4、6或8條。自Grace利用卵巢組織建立了第一個昆蟲細胞系以來，卵巢一直是細胞系建立的重要組織來源。解剖將要羽化的蛹獲得的卵巢組織更易于操作，減少污染機會。更多種類的昆蟲細胞系仍存在很大的需求，建立新的來源于昆蟲卵巢的細胞系，構建更加高效的桿狀病毒表達載體系統是十分有意義的。與哺乳動物細胞成熟的培養技術相比，昆蟲細胞培養技術亟待建立與完善。昆蟲是世界上種類最多的生物群體，有著豐富的細胞遺傳學系統。細胞在體外培養過程中，由于受到各種環境因子的影響，有時會發生自發轉化，即永生化。永生化的細胞在生長過程中失去接觸抑制，可無限繁殖傳代，這樣的轉化不僅所需時間長，而且轉化率極低。建立ー株細胞系往往需要培養大量原代細胞，費時費力，經常守株待兔式地等待細胞自發轉化，條件難以控制，常常因污染而前功盡棄。體外培養細胞成功傳代后，當培養到一定代數時，通常會進入生長抑制狀態，生命力明顯減弱，増殖能力下降，生長停滯并最終死亡。人工誘導體外培養細胞轉化是獲得細胞永生化的重要手段。在人工設計的誘變因素下使細胞發生轉化，通常只需1-3個月就可實現，而且轉化率較高，傳代細胞生長周期長、性狀穩定。目前發現，細胞永生化與端粒和端粒酶關系密切。端粒與端粒酶是真核細胞染色體末端的ー種特殊結構，由端粒DNA和端粒蛋白質組成。端粒DNA是富含G的高度保守的重復核苷酸序列，參與DNA復制，并對維持染色體的穩定和完全復制有重要作用。體外 培養的細胞每分裂一次，端粒縮短50-200bp，當縮短至ー臨界值時，細胞就會停止分裂，走向衰老和死亡。人類細胞端粒是由10-15kb的重復序列(TTAGGG)n組成；在植物中端粒以(TTTAGGG)n重復序列出現；昆蟲細胞端粒一般是由6-8kb的重復序列(TTAGG)n組成。目前已知，在昆蟲中存在三種端粒DNA類型家蠶(Bombyx mori)的端粒DNA由重復序列(TTAGG)n 構成(Okazaki et al. 1993);果妮(Drosophila melanogaster)端粒 DNA 由轉座因子 HeT-A 和 TART 組成(Biessmann et al. 1990, Levis et al. 1993);搖蚊中的端粒 DNA由復雜的基因串聯重復序列組成(Nielsen & EdstroEm 1993, Zhang et al. 1994)。端粒酶是ー種核糖核蛋白酶，由RNA和蛋白質組成，具有逆轉錄酶的功能，以自身的RNA為模板合成端粒DNA，以維持端粒的長度。在原代培養的細胞中穩定表達人端粒酶逆轉錄酶基因(hTERT)能穩定端粒的長度，使細胞易于永生化(Cemi C. Telomeres, telomerase, and myc.An update[J]. Mutat Res. 2000,462(I) :31-47.)。雖然有關將端粒酶基因應用于哺乳動物細胞永生化的報道很多，但未見涉及利用轉染人端粒酶逆轉錄酶基因(hTERT)獲得昆蟲永生化細胞系的報道。通過人工誘導體外轉化方法建立來源于昆蟲蛹卵巣并表達人端粒酶逆轉錄酶基因的細胞系，為獲得永生化昆蟲細胞系提供了重要途徑。
發明內容
因此，本發明的目的是針對目前尚無含有人端粒酶昆蟲細胞系的不足，提供ー種高產桿狀病毒的轉基因卵巢細胞系，其含有人端粒酶逆轉錄酶基因，為獲得永生化昆蟲細胞系提供了重要途徑。本發明的另一目的是提供ー種高產桿狀病毒的轉基因卵巢細胞系的制備方法。本發明的再一目的是提供ー種高產桿狀病毒的轉基因卵巢細胞系的應用。針對上述目的，本發明的技術方案如下本發明一方面提供了ー種高產桿狀病毒的轉基因卵巢細胞系，該細胞系的名稱為IOZCAS-Spex IX的轉基因昆蟲細胞系，其保藏號為CGMCC No. 4506。
優選地，所述轉基因卵巢細胞系含有人端粒酶逆轉錄酶基因(hTERT)。優選地,所述人端粒酶逆轉錄酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO I所示。本發明的又一方面提供了ー種高產桿狀病毒的轉基因卵巢細胞系的制備方法，包括以下步驟步驟I :培養甜菜夜蛾卵巢細胞；步驟2 :將含人端粒酶逆轉錄酶基因轉化入已知表達載體中，獲得重組表達載體；步驟3 :將所述重組表達載體導入所述的甜菜夜蛾卵巢細胞中；和步驟4:使所述甜菜夜蛾卵巢細胞能夠表達人端粒酶逆轉錄酶，獲得轉基因昆蟲細胞系。
優選地，在步驟I)中，所述培養甜菜夜蛾卵巢細胞，包括以下步驟步驟I. I :將甜菜夜蛾雌性蛹浸沒在3%次氯酸溶液中5分鐘，75%こ醇溶液中10-20分鐘，進行表面消毒，然后用無菌蒸餾水清洗昆蟲，再吸干蛹表面水分；步驟I. 2 :解剖昆蟲，取出甜菜夜蛾卵巢組織；步驟I. 3 :用生理鹽水清洗步驟2中獲得的組織2-3次，再用細胞培養液I清洗，清洗后把該組織放入含有ImL細胞培養液I潤洗過的細胞培養瓶中，蓋緊瓶蓋，放入27°C無光照的細胞培養箱中培養24小時；步驟I. 4 :加入適量的細胞培養液I，使組織完全或大部分浸沒在該培養液中，在與步驟I. 3同樣條件下培養；步驟I. 5 :每7-10天吸出半量的培養液，并同時換入半量新的細胞培養液II，直至觀察到不斷擴展并開始增殖的細胞充滿了整個培養瓶。優選地，在步驟2中，所述已知的表達載體為pIZT-V5_His或pIB-V5_His。優選地，在步驟3)中，所述重組表達載體通過脂質體導入所述的甜菜夜蛾卵巢細胞中。優選地，在步驟4)中，具體通過以下步驟獲得轉基因卵巢細胞系步驟4. I :放入與步驟I. 3同樣條件下培養至少4小吋，并不時晃動。轉染后換適量細胞培養液II繼續在與步驟I. 3同樣條件下培養；步驟4. 2 :72小時后熒光倒置顯微鏡觀察轉染效果，換含有真核細胞篩選抗生素的細胞培養液III或者細胞培養液IV篩選，成功表達hTERT的細胞繼續與步驟I. 3同樣條件下培養；步驟4. 3 :在將該細胞與步驟I. 5相同培養細胞，直至獲得轉基因昆蟲細胞系。上述整個過程都是在無菌條件下進行的；其中所述的四種細胞培養液分別是細胞培養液I是昆蟲細胞培養液與青霉素、鏈霉素、苯基硫脲和胎牛血清的混合物；細胞培養液II是昆蟲細胞培養液與青霉素、鏈霉素和胎牛血清的混合物，細胞培養液III是昆蟲細胞培養液與青霉素、鏈霉素、博萊霉素(zeocin)和胎牛血清的混合物，細胞培養液IV是昆蟲細胞培養液與青霉素、鏈霉素、殺稻瘟菌素(blasticidin)和胎牛血清的混合物，配成的細胞培養液pH為6. 0-6.8。昆蟲細胞培養液可以是各種商品化的昆蟲細胞培養液，如TNM-FH，Grace’ s, Sf900，TC-100, IPL-41, Ex-Cell 400 等等。通常，細胞培養液中青霉素含量為100U/mL、鏈霉素含量為100U/mL ;篩選轉基因細胞的培養液為上述培養液含博萊霉素(zeocin) 400 ii g/mL ;轉基因細胞系培養液為上述培養液含博萊霉素(zeocin) 50 ii g/mL ;動物血清含量為細胞培養液的10% (體積比)。本發明的再一方面提供ー種高產桿狀病毒的轉基因卵巢細胞系的應用，所述轉基因卵巢胞系在桿狀病毒生產中的應用。優選地，所述桿狀病毒為甜菜夜蛾核型多角體病毒(SeNPV)或苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcMNPV)。本發明中表達了人端粒酶逆轉錄酶(hTERT)基因的甜菜夜蛾蛹卵巢細胞系的生物學特征觀察和測定I.經實驗觀察，該細胞系大部分為貼壁細胞，也有部分懸浮于培養液中。細胞的形狀有3種類型大部分細胞圓形、少部分梭形，較少似巨噬細胞形，易聚集形成細胞團；熒光信號轉染初期較強，轉染效率高。
2. IOZCAS-Spex IX對甜菜夜蛾核型多角體病毒及苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒敏感,可以觀察到典型的細胞病理特征，即細胞核增大，內含大量的多角體顆粒，感染率分別為92. 41%和83. 15% ;并且至少可以連續傳代3代。3.按照 McIntosh and Ignoffo, 1989 (McIntosh, A. H. and C. M. IgnoffoJ.Invertebr. Pathol. 1989,54 :97 102)的方法，測定第10代細胞生長曲線和群體倍增時間。以2. 5X105細胞/mL的濃度接種到24孔培養板中，27°C培養，每48h測定細胞濃度，繪制生長曲線，并按公式T = tlg2/[lg(N/N0)]計算，第10代的細胞群體倍増時間為70. 09小吋。其中T =在對數期平均增長一倍所需的時間t =接種到測定細胞數的時間NO =接種時的細胞數N =時刻t所測定的細胞總數4.按照 Takahashi et al. (Takahashi, Mitsuhashi and Ohtaki (1980) Develop.Growth and Differ. 22 :11-19)的方法，測定了第12代細胞的核型。由于甜菜夜蛾的染色體數目 n = 31(Hara,Tsuda,Funakoshi and Kawarabata In Vitro Cell. Dev. Biol. 1993,29A(12) :904 907)，而IOZCAS-Spex IX的染色體數目在116-131之間，因此，新建立的細胞系IOZCAS-Spex IX由4倍體細胞組成。5.使用 DAF-PCR 的方法(McIntosh, Grasela and Matteri (1996), InsectMol.Biol. 5 187 195)鑒定了細胞系IOZCAS-SpexIX確是來源于甜菜夜蛾，而非其它細胞系的污染。由IOZCAS-SpexIX提取的DNA與甜菜夜蛾蛹DNA、來源于甜菜夜蛾幼蟲脂肪體的IOZCAS-SpexII-A的DNA擴增后主要的帶型相同；而與對照，來源于草地貪夜蛾的Sf9、棉鈴蟲脂肪體的I0ZCAS-Ha-I、美洲棉鈴蟲蛹卵巢的BCIRL-Hz-AMl的細胞帶型明顯不同。6.使用傳統細胞凍存的方法對一定代次的部分細胞進行凍存處理，保存細胞的種資，并成功復蘇。
以下，結合附圖來詳細說明本發明的實施方案，其中圖I為本發明所述的IOZCAS-Spex IX的培養形態圖，圖中標尺所示為400 ii m ;
圖2為本發明所述的IOZCAS-Spex IX的轉染熒光(綠色熒光GFP標記)圖，圖中標尺所示為400 μ m ;圖3為本發明所述的IOZCAS-Spex IX感染甜菜夜蛾后獲得大量的病毒多角體試驗結果圖，圖中標尺所示為200 μ m ;圖4為本發明所述的IOZCAS-Spex IX感染苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒后獲得大量的病毒多角體試驗結果圖，圖中標尺所示為200 μ m ;圖5為本發明所述的IOZCAS-Spex IX的生長曲線；圖6為本發明所述的IOZCAS-Spex IX的核型；
圖7為DAF-PCR鑒定IOZCAS-Spex IX的DNA指紋擴增瓊脂糖電泳圖，圖中I為IOZCAS-Spex IX，2 為甜菜夜蛾蛹(Spodoptera exigua pupa), 3 為脂肪體的 IOZCAS-SpexII-A，4為棉鈴蟲脂肪體的IOZCAS-Ha-I，5為美洲棉鈴蟲蛹卵巢的BCIRL-Hz-AMl，6為草地貪夜蛾的Sf9，7為DNA標記(DNAMarker)；圖8為表達載體質粒pIZT-V5_His，具有多克隆位點、桿狀病毒早起啟動子、V5表位和抗Zeocin基因；圖9為表達載體質粒pIB-V5-His，具有多克隆位點、桿狀病毒早起啟動子、V5表位和抗Blasticidin基因；圖10為轉基因昆蟲細胞系PCR擴增的瓊脂糖電泳結果示意圖，圖中I為IOZCAS-Spex IX細胞系，2 為甜菜夜蛾卵巢(spodoptera exigua ovary), 3 為 DNA標記(DNAMarker)。
具體實施例方式以下實施例中所使用的技術，包括基因擴增，基因克隆，細胞轉染，以及細胞培養、檢測技術，除非特別說明，均為本領域的技術人員已知的常規技術；所使用的儀器設備、試齊U、細胞等，除非是說明書中特別說明，均為本領域技術人員可以通過公共途徑獲得的。實施例I.轉基因甜菜夜蛾蛹卵巢細胞系的建立取末齡的甜菜夜蛾5天雌性蛹浸沒在3%次氯酸溶液中5分鐘，75%乙醇溶液中10-20分鐘，進行表面消毒。解剖該蛹取出卵巢組織，操作時盡量保持其完整。用生理鹽水清洗該組織2-3次，再用細胞培養液I (以TNM-FH為主，含100U/mL的青霉素，100U/mL的鏈霉素和10% (v/v)的胎牛血清，pH = 6. 2)清洗1-2次，放入使用ImL培養液潤洗過的25cm2的細胞培養瓶中，放入攝氏27°C無光照的細胞培養箱中培養24小時。然后加入3mL細胞培養液I，放入同樣條件下培養。注意該方法成功建立細胞系的關鍵是要使組織緊貼在細胞培養瓶底，勿使組織懸浮在細胞培養液中。以后每7-10天左右吸出半量的培養液，并同時換入半量的新細胞培養液II。在此操作第3天后可以觀察到組織周圍游離出大量單個的細胞，并逐漸向外圍擴展。當甜菜夜蛾卵巢的原代細胞增殖至10天時,根據invitrogen公司Cellfectin II Reagent (Cat. no. 10362-100，10362-125)方法將本實驗室構建的人端粒酶逆轉錄酶重組質粒轉染到原代細胞中，27°C無光照的細胞培養箱中培養。轉染后第三天可通過熒光倒置顯微鏡觀察轉染效果。轉染初期，部分細胞漂浮死亡，每7天半量換細胞培養液II，觀察細胞增殖情況。當細胞有聚團增殖趨勢時，加入400 μ g/mL博萊霉素(zeocin)篩選，成功轉染了重組質粒基因的細胞貼壁生長正常，未轉染的細胞則漂浮死亡。11天后當細胞增殖至將要鋪滿整個培養瓶時，細胞連同全部的培養液吸出放入新培養瓶中，并加入2mL新的細胞培養液III或IV (含50 μ g/mL博萊霉素(zeocin))。細胞系建立初步成功。在細胞開始傳代的第17天后開始第二次分瓶傳代，以后傳代時間逐漸縮短，傳到第5代時，傳代時間縮短至10天，細胞生長開始穩定，傳至第12代時，傳代時間已縮短至4-5天。最終該細胞系被命名為IOZCAS-Spex IX。IOZCAS-Spex IX已于2010年12月28日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號=CGMCC No. 4506，分類命名甜菜夜蛾蛹卵巢轉基因細胞株。實施例2.人端粒酶逆轉錄酶(hTERT)某閔重鉬質粒DlZT_hTERT和DlB_hTERT的構建利用載體質粒pIZT-V5_His構建重組質粒pIZT_hTERT。如圖8所示，載體質粒pIZT-V5-His具有多克隆位點、桿狀病毒早起啟動子、V5表位和抗Zeocin基因。將載體質粒pIZT-V5-His進行EcoR I和EcoR V限制性酶切，將hTERT基因(其序列如SEQ ID NO I所示)(來自質粒pBABE-puro-hTERT)進行Sal I限制性酶切，dNTP補平、EcoR I酶切后， 克隆到載體質粒中獲得hTERT重組質粒pIZT-hTERT。利用載體質粒PIB-V5_Hi s構建重組質粒pIB_hTERT。如圖9所示，載體質粒pIB-V5-His具有多克隆位點、桿狀病毒早起啟動子、V5表位和抗Blasticidin基因。將載體質粒pIB-V5-His進行EcoR I和EcoR V限制性酶切，將hTERT基因(來自質粒pBABE-puro-hTERT)進行Sal I限制性酶切，dNTP補平、EcoR I酶切后，克隆到載體質粒中獲得hTERT重組質粒pIB-hTERT。實施例3. IOZCAS-Spex IX的牛物學特件觀察和測定(I)形態特征經顯微鏡觀察，該細胞系細胞易于形成細胞團且可忍受高密度生長環境，突破了接觸抑制。如圖1-2所示，細胞的形狀有3種類型圓形、梭形和橢圓形。大部分細胞貼壁。(2)細胞的生長27°C下，細胞系第10代在含10%胎牛血清、100U/mL的青霉素、100U/mL的鏈霉素、50 μ g/mL博萊霉素的TNM-FH培養液中，群體倍增時間為70. 09h。如圖5所示，細胞最高密度約可達2. 7 X IO6個細胞/mL。(3)核型分析如圖6所示，IOZCAS-Spex IX第12代細胞是4倍體細胞，染色體數目范圍 116-131 (2n = 62)。(4) DAF-PCR鑒定如圖7所示，細胞系IOZCAS-Spex IX確是來源于甜菜夜蛾，而非其它細胞系的污染。由IOZCAS-Spex IX提取的DNA同于甜菜夜蛾蛹和脂肪體的DNA指紋擴增圖譜,而不同于草地貪夜蛾的Sf9、棉鈴蟲脂肪體的IOZCAS-Ha-I、美洲棉鈴蟲蛹卵巢的BCIRL-Hz-AMl的圖譜。(5)凍存和復蘇使用傳統細胞凍存的方法對一定代次的部分細胞進行凍存處理，保存細胞的種資，并可以成功復蘇。實施例4.病毒敏感件IOZCAS-Spex IX對甜菜夜蛾核型多角體病毒敏感將SeNPV及AcMNPV出芽型病毒粒子BV以O. 001幼蟲當量/毫升的濃度接種IOZCAS-SpexIX，培養7天后，如圖3_4所示，通過倒置顯微鏡可以觀察到典型的細胞病理特征，即細胞核增大，內含大量的多角體顆粒。并且至少可以連續傳代3代。病毒感染率分別為92. 41%和83. 15%。
實施例5.轉hTERT某閔細朐中hTERT某閔的測定利用PCR技術，測定轉hTERT基因的細胞系IOZCAS-Spex IX中hTERT基因的存在。引物hTERT 上游引物AGC TGC GGC CCT CCT TCC TAC TCAhTERT 下游引物GAC GCT CGG CCC TCT TTT CTC TGC 反應條件95°C,2min ；95°C /30S, 57°C /30S, 72°C /60S ；30 個循環72°C, 5min0如圖10所示，PCR檢測結果證明，轉基因的細胞株內存在hTERT基因。
權利要求
1.一種高產桿狀病毒的轉基因卵巢細胞系，該細胞系的名稱為IOZCAS-Spex IX的轉基因昆蟲細胞系，其保藏號為CGMCC No. 4506。
2.根據權利要求I所述的轉基因卵巢細胞系，其特征在于，所述轉基因卵巢細胞系含有人端粒酶逆轉錄酶基因。
3.根據權利要求2所述的轉基因卵巢細胞系，其特征在于，所述人端粒酶逆轉錄酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO I所示。
4.根據權利要求I至3任一項所述的轉基因卵巢胞系的制備方法，包括以下步驟 步驟I :培養甜菜夜蛾卵巢細胞； 步驟2 :將含人端粒酶逆轉錄酶基因轉化入已知表達載體中，獲得重組表達載體； 步驟3 :將所述重組表達載體引入所述的甜菜夜蛾卵巢細胞中；和 步驟4 :使所述甜菜夜蛾卵巢細胞能夠表達人端粒酶逆轉錄酶，獲得轉基因昆蟲細胞系O
5.根據權利要求4所述的轉基因卵巢細胞系的方法，其特征在于，在步驟2中，所述已知的表達載體為pIZT-V5-His或pIB-V5-His。
6.根據權利要求I至3任一項所述的轉基因卵巢細胞系的應用，所述轉基因卵巢細胞系在桿狀病毒生產中的應用。
7.根據權利要求6所述的應用，其特征在于，所述桿狀病毒為甜菜夜蛾核型多角體病毒或苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒。
全文摘要
本發明提供一種高產桿狀病毒的轉基因昆蟲細胞系及其制備方法和應用，所述轉基因昆蟲細胞系的名稱為IOZCAS-Spex IX，該細胞系的保藏號為CGMCC No.4506；所述轉基因昆蟲細胞系的制備方法，包括以下步驟培養甜菜夜蛾卵巢細胞；將含人端粒酶逆轉錄酶基因轉化入已知表達載體中，獲得重組表達載體；將所述重組表達載體引入所述的甜菜夜蛾卵巢細胞中；和使所述甜菜夜蛾卵巢細胞能夠表達人端粒酶逆轉錄酶，獲得轉基因昆蟲細胞系；所述轉基因昆蟲細胞系的應用為其在桿狀病毒生產中的應用。
文檔編號C12R1/93GK102807969SQ20111014889
公開日2012年12月5日 申請日期2011年6月3日 優先權日2011年6月3日
發明者李瑄, 張寰, 秦啟聯, 王雁玲, 王紅托, 張繼紅, 苗麟, 孟茜, 張寧, 朱未, 周桂靈, 楊青 申請人:中國科學院動物研究所