專利名稱：以稻谷加工副產物為原料生產飼用葡萄糖氧化酶的方法
技術領域：
本發明涉及一種飼用葡萄糖氧化酶的生產方法，尤其涉及一種利用稻谷加工副產物節碎米、米糠，通過固體發酵生產飼用葡萄糖氧化酶的方法。
背景技術：
目前，飼用葡萄糖氧化酶的生產采用液體深層發酵法，該方法在具體應用中存在許多不足，例如，發酵設備成本高，液體深層發酵需要專業的發酵設備，如發酵罐等，一個30噸的發酵罐造價達100萬；發酵過程能耗高，需要不斷攪拌；對發酵工作人員技術素質要求較高；三廢(廢水，廢渣，廢氣)對環境污染較重等(微生物學雜志2009，1 (29)p86-89 ；食品與發酵工業2003，29 (6) ρ 87-91)。飼用葡萄糖氧化酶的液體發酵法生產還有一個顯著缺點發酵過程所用原料主要是優質綿白糖，原料成本高(《飼料與畜牧;^〉2008 (7)p37-39)。
發明內容
本發明的目的是，克服目前所采用生產技術的上述缺點，提供一種原料來源廣、設備成本低，工藝簡單，對環境無污染的飼用葡萄糖氧化酶的生產方法。本發明的目的是通過以下技術方案實現的，一種飼用葡萄糖氧化酶的生產方法， 包括以下步驟
⑴將高產葡萄糖氧化酶的點青霉接種裝有馬鈴薯瓊脂培養基(PDA培養基)的10 cm微生物培養皿，25 30 °C培養36 48 h ；
所述馬鈴薯瓊脂培養基配制去皮馬鈴薯200 g煮汁30 min，4層紗布過濾，濾液中添加葡萄糖20 g，瓊脂15 g，補蒸餾水至1000 ml，115°C滅菌20 min，鋪平皿備用；
⑵種子培養液體種子培養基經115 121 °C滅菌2(T30 min后，將步驟(1)培養皿中活化的點青霉轉接液體種子培養基，接種量為一個10 cm培養皿接種50(T1000 ml液體種子培養基；接種后于25 3(TC培養6(T72 h ；
所述液體種子培養基配方廣6wt%綿白糖，0. 05 0. 2wt% KH2PO4, 0. 05 0. 2wt%NaCl, 0. ΟΓΟ. 06wt%MgS04 ‘ 7H20, 0. Γθ. 4wt% NaNO3 :0. ΟΟΓΟ. 025wt% FeCl3, 0· 05 0· 2wt % CaCl2，余為水，pH自然，115°C滅菌20 min備用；
⑶固體發酵培養基的配制將節碎米與米糠按10: Γ3的重量比混合，9(T10(TC蒸煮 25 40 min ；
⑷接種培養固體發酵培養基攤涼后，接種步驟(2)得到的點青霉種子，接種量為 500^1000 ml種子培養液接種500 kg培養基，混合均勻，裝入鋪有麻袋的竹筐中，再以麻袋覆蓋，直至點青霉孢子萌發后，轉入發酵床，25 30 °C，加濕通風條件下培養48飛0 h； ( 固體發酵結束后，將培養基置于100 120 °C干燥2 4 h，粉碎至40 80目，即成。本發明采用廉價的稻谷加工副產物節碎米、米糠為底物，采用固體發酵技術，無需發酵罐等特殊設備，無后提取等復雜工藝，無“三廢”產生，對無環境無污染，工藝簡單，易操作，降低了葡萄糖氧化酶的原料成本、設備成本和生產過程成本，原料來源廣，能實現稻谷加工副產物的高值化利用；既適合農村小作坊發酵，也適合工業化大生產。產品葡萄糖氧化酶活力高，酶活性高達200 U;10(Tl20 °C高溫下干燥2 h，酶活損失小于5%。
具體實施例方式以下結合實施例對本發明作進一步詳細說明。實施例1
⑴將高產葡萄糖氧化酶的點青霉接種裝有馬鈴薯瓊脂培養基(PDA培養基)的10 cm微生物培養皿，28 °C培養40 h ；
所述馬鈴薯瓊脂培養基配制去皮馬鈴薯200 g煮汁30 min，4層紗布過濾，濾液中添加葡萄糖20 g，瓊脂15 g，補蒸餾水至1000 ml，115°C滅菌20 min，鋪平皿備用；
⑵種子培養液體種子培養基配方5wt %優質綿白糖，0.1 wt% KH2P04, 0.1 wt% NaCl，0. 02wt% MgS04 · 7H20, 0. 2 wt% NaN03 :0.0015wt % FeCl3，0. 1 wt% CaCl2，蒸餾水配制，PH自然)，經115 °C滅菌20 min后，將培養皿中活化的點青霉轉接液體種子培養基，接種量為一個10 cm培養皿接種500 ml液體種子培養基；接種后于培養至大量形成孢子；
⑶固體發酵培養基的配制將節碎米與米糠按10: 1的比例混合，100°C蒸煮30 min ； ⑷接種培養固體發酵培養基攤涼后，接種點青霉種子，接種量為500 ml種子培養液接種500 kg培養基，混合均勻，裝入鋪有麻袋的竹筐中，再以麻袋覆蓋，當溫度上升到45°C 時，倒出培養基，攪拌冷卻，再裝入原竹筐中，直至培養基表面出現淡綠色的霉點，轉入發酵床，28 °C，加濕通風條件下培養60 h ；
⑶固體發酵結束后，將培養基置于115 °C干燥2 h。粉碎至80目，即成。采用下述葡萄糖氧化酶活力測定方法對各實施例產品的酶活力進行檢測
2.5 ml鄰聯茴香胺緩沖液(0. 1 g鄰聯茴香胺，溶于10 ml pH6. 0磷酸緩沖液，實驗前取0.1 ml鄰聯茴香胺溶液，加入到12 ml緩沖液中使用)，加入0.3 ml 18%葡萄糖溶液(稱取D-無水葡萄糖18g，溶于IOOml蒸餾水中)，加入0. 1 ml 0. 03%過氧化物酶溶液(稱取辣根過氧化物酶10 mg溶于30 ml蒸餾水)，25°C保溫3 min加入稀釋好的酶液讀出OD46tl在1 min的變化值。1個單位的葡萄糖氧化酶的活性(1 U)定義為在25°C，pH 6.0的測定條件下葡萄糖氧化酶催化葡萄糖每分鐘生成ι μ mol H2O2的酶量為一個單位。經檢測，本實施例產品的酶活力為203 U。實施例2
⑴將高產葡萄糖氧化酶的點青霉接種裝有馬鈴薯瓊脂培養基(PDA培養基)的10 cm微生物培養皿，30 °C培養36 h ；
所述馬鈴薯瓊脂培養基配制去皮馬鈴薯200 g煮汁30 min，4層紗布過濾，濾液中添加葡萄糖20 g，瓊脂15 g，補蒸餾水至1000 ml，115°C滅菌20 min，鋪平皿備用；
⑵種子培養液體種子培養基配方10 wt%優質綿白糖，0. 15wt% KH2P04, 0. 15wt% NaCl, 0. 03 wt% MgS04 · 7H20, 0. 3wt% NaN03 :0. 003wt% FeC13, 0. 15wt% CaCl2,余為水，pH自然，經115 °C滅菌30 min后，將培養皿中活化的點青霉轉接液體種子培養基，接種量為一個10 cm培養皿接種1000 ml液體種子培養基；接種后于30°C培養至大量形成孢子；
⑶固體發酵培養基的配制節碎米、米糠按10: 3的比例混合，100°C蒸煮40 min ；⑷接種培養固體發酵培養基攤涼后，接種點青霉種子，接種量為600 ml種子培養液接種500 kg培養基，混合均勻，裝入鋪有麻袋的竹筐中，再以麻袋覆蓋，當溫度上升到45°C 左右時，倒出培養基，攪拌冷卻，再裝入原竹筐中，直至培養基表面出現淡綠色的霉點，轉入發酵床，30 °C，加濕通風條件下培養50 h；
( 固體發酵結束后，將培養基置于120 °C干燥3 h。粉碎至80目即成。經檢測，本實施例產品的酶活力為221 U。以上所述，僅是本發明的較佳實施例，并非對本發明作任何形式上的限制，任何熟悉本專業的技術人員，在不脫離本發明技術方案范圍內，利用上述揭示的技術內容作出些許更動或修飾為等同變化的等效實施例，均仍屬于本發明的保護范圍。
權利要求
1. 一種飼用葡萄糖氧化酶的生產方法，其特征在于，包括以下步驟(1)將高產葡萄糖氧化酶的點青霉接種裝有馬鈴薯瓊脂培養基的10cm微生物培養皿，25 30 °C培養36 48 h ；所述馬鈴薯瓊脂培養基配制去皮馬鈴薯200 g煮汁30 min，4層紗布過濾，濾液中添加葡萄糖20 g，瓊脂15 g，補蒸餾水至1000 ml，115°C滅菌20 min，鋪平皿備用；(2)種子培養液體種子培養基經115 121 °C滅菌20 30 min后，將步驟(1)培養皿中活化的點青霉轉接液體種子培養基，接種量為一個10 cm培養皿接種500 1000 ml 液體種子培養基；接種后于25 30°C培養60 72 h ；所述液體種子培養基配制1 6wt%綿白糖，0. 05 0. 2wt% KH2PO4, 0. 05 0. 2wt%NaCl, 0. 01 0. 06wt%MgS04 ·7Η20，0· 1 0. 4wt% NaNO3 :0. 001 0. 025wt% FeCl3, 0. 05 0. 2wt % CaCl2，余為水，pH 自然，115°C滅菌 20 min 備用；(3)固體發酵培養基的配制將節碎米與米糠按10:1 3的重量比混合，90 100°C 蒸煮25 40 min ；(4)接種培養固體發酵培養基攤涼后，接種步驟(2)得到的點青霉種子，接種量為 500 1000 ml種子培養液接種500 kg培養基，混合均勻，裝入鋪有麻袋的竹筐中，再以麻袋覆蓋，直至點青霉孢子萌發后，轉入發酵床，25 30 °C，加濕通風條件下培養48 60 h；(5)固體發酵結束后，將培養基置于100 120°C干燥2 4 h，粉碎至40 80目， 即成。
全文摘要
以稻谷加工副產物為原料生產飼用葡萄糖氧化酶的方法，其包括以下步驟(1)將高產葡萄糖氧化酶的點青霉接種裝有PDA培養基的10cm微生物培養皿進行培養；(2)種子培養液體種子培養基經115～121℃滅菌20～30min后，將步驟(1)培養皿中活化的點青霉轉接液體種子培養基；(3)固體發酵培養基的配制將節碎米與米糠按10∶1～3的重量比混合，90～100℃蒸煮25～40min；(4)接種培養固體發酵培養基攤涼后，接種點青霉種子進行培養；(5)固體發酵結束后，將培養基置于100～120℃干燥2～4h，粉碎至40～80目。本發明原料來源廣，無“三廢”產生，工藝簡單，產品葡萄糖氧化酶活力高達200U。
文檔編號C12R1/80GK102220295SQ20111013857
公開日2011年10月19日 申請日期2011年5月26日 優先權日2011年5月26日
發明者劉俊文, 周慧, 楊濤, 林親錄 申請人:長沙理工大學