專利名稱：一種重組酶法生產右旋糖酐和果糖的方法
技術領域：
本發明涉及一種聯合誘導低成本制備重組右旋糖酐蔗糖酶的方法以及由此酶催化生產生物多糖和單糖的方法，特別涉及重組右旋糖酐蔗糖酶采用間隙振蕩的酶催化方法，一步法催化合成右旋糖酐與果糖的方法。
背景技術：
右旋糖酐蔗糖酶(DextransucrashEC 2. 4. 1. 5)是一種由腸膜狀明串珠菌 (Xeuconstoc mesenteriodes)產生的葡萄糖基轉移酶(Glucosyltransferases),由 1250 到1600個不同的氨基酸構成，分子量約為170KDa，其在多糖類藥物合成、藥用果糖、色譜分離介質和保健食品的制備等多個領域均具有重要應用。該酶的催化是以蔗糖為底物，將蔗糖分子中D-葡萄糖基催化轉移形成D -glucosyl-Enzyme，并釋放出果糖，其結果生成兩類重要產品①催化合成不同分子量右旋糖酐；②制備高純的藥用果糖。右旋糖酐(dextran)是由若干葡萄糖脫水形成的聚合物，主要由α (1_6)苷鍵連接。因其具有安全、無毒、生物相容性好等多種優點，已被廣泛應用于醫藥、食品等多個方面。臨床應用有三種規格右旋糖酐70、右旋糖酐40和右旋糖酐20，是一種優良的血容量補充藥，同時也是生產補血藥右旋糖酐鐵的重要原料。分子量7萬左右的右旋糖酐是目前公認的優良血漿代用品之一，有增加血容量作用，臨床主要用于治療失血性休克；分子量4 萬和2萬左右的右旋糖酐具有改善微循環作用，主要通過解除紅細胞聚集，減少血液粘度等作用而改善微循環，同時也具有一定的補充血容量作用。果糖是一種左旋性的六碳糖，在人體內代謝比葡萄糖快，容易被機體吸收，且不依賴胰島素，對血糖影響很小，適用于葡萄糖代謝及肝功能不全的患者補充能量，同時它還具有促進有益細菌繁殖，改善腸功能和代謝，不致齲齒等特性，因此果糖是糖尿病人、肥胖病人、兒童食品的理想甜味劑。運動前攝入果糖不會引起低血糖癥，而通常如果在超長時間鍛煉后攝入快速吸收的碳水化合物將引起此類低血糖癥。歐、美、日和我國均已將果糖列入藥典，作為口服或注射用，特別是葡萄糖代謝障礙者(糖尿病人)適用。目前國內生產右旋糖酐工藝主要采用厭氧發酵、乙醇捏洗、鹽酸水解、乙醇劃分等。該工藝乙醇消耗量大，生產環境惡劣，發酵過程中菌體與葡聚糖互相纏繞而使菌體不能除去，生產中又引入了雜氮、氯離子、硫酸鹽灰分等雜質，致使其產品質量指標達不到日本、 歐美的藥典標準，無法進入國際市場，缺少競爭力；而且雜質含量高的藥用右旋糖酐導致臨床過敏性副反應多。國內對右旋糖酐生產工藝研究僅限于在傳統發酵工藝中對發酵液過濾，水解、分級劃分等單元操作的改進，不能從工藝本質上提高產品質量。本發明人于2005年從腸膜狀明串珠菌中克隆獲得了此酶的完整基因 / ^^ (GenBank No. DQ345760)。然后以此基因為基礎構建了能高效表達的重組右旋糖酐蔗糖酶大腸桿菌，該基因工程菌已經獲得了專利(ZL 200710134765. 4)。本發明從擁有自主知識產權的基因工程菌BL21 (DE3)/pET28-dexYG入手，獲得成本較低的IPTG與乳糖聯合誘導制備重組右旋糖酐蔗糖酶的方法，并利用重組右旋糖酐蔗糖酶采用間隙振蕩的酶催化方法，一步法生產右旋糖酐和果糖，大幅提高了轉化效率。實現一酶多用、回收果糖，降低了成本， 提高產品質量，并解決了右旋糖酐原生產工藝中付產物果糖對環境的污染問題。
發明內容
本發明的目的在于運用成本較低的IPTG與乳糖聯合誘導法制備游離重組右旋糖酐蔗糖酶，然后以此重組酶基礎，由底物蔗糖開始采用間隙振蕩的酶催化方法一步制備右旋糖酐和果糖，此生產方法取代由腸模狀明串珠菌生產右旋糖酐的工藝，避免隨著細菌的生產過程中出現的菌體，消除雜蛋白，提高產品質量；實現一酶多用、回收果糖，降低了成本，并解決了右旋糖酐原生產工藝中付產物果糖對環境的污染問題。本發明的重組酶法生產右旋糖酐和果糖的方法，包括下述步驟
(1)游離重組右旋糖酐蔗糖酶的制備將基因工程菌株BL21(DE;3)/pEI^8-deXYG轉接到含40-60 μ g/mL卡那霉素的新鮮LB培養基中，并于35_40°C下培養15_1他，再將其接種到產酶培養基B中于35-40°C下發酵培養，當0D_=2. 5-4. 0時，采用IPTG與乳糖聯合誘導至IPTG終濃度為0. 07-0. 12 mmol/L、乳糖終濃度為2. 0 -3. Og/L，誘導溫度為20_30°C，誘導時間為4- ；培養后的液體于0-5°C離心得菌體后加入pH5. 4醋酸緩沖液，超聲破碎，離心取上清液即得重組右旋糖酐蔗糖酶液；
(2)以重組右旋糖酐蔗糖酶催化合成右旋糖酐和果糖采用下述步驟
(a)用50mL的5mmol/L的pH5.4乙酸-乙酸鈉緩沖液溶解10_15g蔗糖配制酶底物反應液；再向其中加入酶活70-170u/ml的重組右旋糖酐蔗糖酶液10-15 mL后，用5mmol/L的 PH5. 4乙酸-乙酸鈉緩沖液定容到IOOmL ；
(b)在25-30°C下反應開始時采用振蕩器對反應液進行120n/min振蕩5h，然后靜置反應5h，依此交替進行反應，22-25h后結束催化反應；
(c)將催化后的反應液進行醇沉洗滌，真空干燥稱重，得到高分子右旋糖酐，將醇沉液經過離心過濾去除大分子雜質，再經過超濾去除小分子低聚糖、濾液經過真空濃縮、噴霧干燥得到果糖。本發明中所述步驟(1)中培養基B用于大腸桿菌的發酵和酶的誘導，其中含有甘油、蛋白胨及培養基常用的無機鹽組分，其可采用如下配方
培養基B的成分甘油5g/L ；蛋白胨(trypyone) 10 g/L ；硝酸鉀10 g/L ；MgSO4 0. 1 mmol/L ；NH4Cl 1 g/L ；Na2HPO4 · 7H20 12. 8 g/L 或者 Na2HPO4 · 12H20 17. 1 g/L ；KH2P043g/L。本發明中所述步驟(1)中發酵培養時，采用IPTG與乳糖聯合誘導法制備右旋糖酐蔗糖酶，優選當0D_=3. 0時，采用IPTG與乳糖聯合誘導至最佳終濃度分別為0. 09mmol/L和 2. 5g/L，誘導培養25°C。本發明中所述步驟(2)中優選加入的重組右旋糖酐蔗糖酶液的酶活為145-170U/ ml ο本發明中的基因工程菌BL21 (DE3)/pEI^8-dexYG菌種接種、培養與富集可采用下述方式
從斜面中用接種環挑取菌體，轉接到20mL新鮮LB培養基(含卡那50 yg /mL)中， 37°C、300r/min過夜培養，培養時間為16_1他。再按照1%的接種量接種過夜培養的菌液到
培養基B中發酵培養。
發酵液于37°C、300r/min培養，前池每小時取發酵液lmL，用無菌水稀釋10倍，以培養基作對照，測量0 ,之后每1. 5h取發酵液lmL，用無菌水稀釋10倍，以培養基作對照，測量0D_。當0D_=3. 0-4.0，發酵培養結束，轉入下一步誘導產酶。LB培養基配方如下
LB平板固體培養基用于菌體的篩選，斜面固體培養基用于菌體短期(約1個月)保藏， LB液體培養基用于菌體的過夜培養。LB培養基的成分胰蛋白胨(bacto-trypyone) 10 g/L ；酵母浸膏(yeast extract) 5 g/L ；NaCl 10 g/L ；蒸餾水 1000 mL,用 1 mol/L 的 NaOH 或者 HCl 調 pH 值為 7.0,0. IMPa滅菌20min，用前加入卡那霉素至50ug/mL。固體培養基還需加入1. 5-2%的瓊脂，0. IMPa滅菌20min，待冷卻到50-60°C時，加入卡那霉素至50ug/mL，冷卻成斜面或者平板。培養基B用于大腸桿菌的發酵和酶的誘導，配方如下
培養基B的成分甘油5g/L;蛋白胨(trypyone) 10 g/L ；硝酸鉀10 g/L ；MgSO4 0. 1 mmol/L ；NH4Cl 1 g/L ；Na2HPO4 · 7H20 12. 8 g/L 或者 Na2HPO4 · 12H20 17. 1 g/L ；KH2P043g/L。在制備右旋糖酐之前，先檢測所制備的右旋糖酐蔗糖酶的活力，右旋糖酐蔗糖酶活力的測定采用3，5_ 二硝基水楊酸試劑法測還原糖的量(DNS法)。步驟為取5mL發酵液，8000r/min 離心 lOmin，取上清液 2ml (酶液)與 2ml 底物(0· 2M NaAc 860mL, 0. 2M HAc 140ml,蔗糖100g, ρΗ5· 4)混合，取出0. 5ml加入0. 375ml DNS試劑，在沸水浴中加熱5min， 待其冷卻到室溫后，加入5. 375ml蒸餾水，搖勻放入冰箱作為空白。余下的混合溶液25°C下培養60min，取出0. 5mL加入0. 375ml DNS試劑，在沸水浴中加熱5min，待其冷卻到室溫后， 加入5. 375ml蒸餾水，搖勻。在520nm波長下，測其OD值。同時配制標準曲線，從標準曲線上查出酶液的果糖含量，計算在各種培養條件下右旋糖酐蔗糖酶的酶活力。酶活力定義 在35°C下，每小時催化底物蔗糖產生0. Img果糖所需的酶量定義為一個酶活力單位(U)。本發明提供了一種利用基因工程菌株BL21 (DE3)/pEI^8-dexYG并采用IPTG與乳糖聯合誘導法制備游離的重組右旋糖酐蔗糖酶，此法大幅降低由IPTG單獨誘導時的制酶成本、活性高，有利于規模化生產。同時，利用本發明的成本低、活力高的游離重組右旋糖酐蔗糖酶，采用間隙振蕩的酶催化方法，一步催化合成右旋糖酐和果糖，轉化率高。實現一酶多用、回收果糖，降低了成本，并解決了右旋糖酐原生產工藝中付產物果糖對環境的污染問題。
具體實施例方式實施例1
(1)聯合誘導制備重組右旋糖酐蔗糖酶發酵
基因工程菌株BL21 (DE3) /pET28-dexYG,從斜面中轉接到20mL新鮮LB培養基(含卡那50 yg /mL)中，37°C、300r/min過夜培養，培養時間為16h，再按照1%的接種量接種到培養基B中發酵培養。發酵液于37°C、300r/min培養，每小時取發酵液lmL，用無菌水稀釋 10倍，測量0D_。采用IPTG與乳糖聯合誘導法制備右旋糖酐蔗糖酶，當0D_=3. 0時，加入IPTG至終濃度為0. 09 mmol/L,乳糖終濃度2. 5g/L，于25°C、300r/min誘導培養，誘導時間為4h。發酵后的液體在4°C、12000r/min離心15min得菌體后加入pH5. 4醋酸緩沖液，超聲破碎 IOmin,離心取上清液得粗酶液，酶活達到145 160U/mL，降低了由IPTG單獨誘導時的制酶成本。(2)應用上述聯合誘導的重組右旋糖酐蔗糖酶采用間隙振蕩的酶催化方法，一步法催化合成右旋糖酐及果糖，步驟為
1)酶底物反應液配制用50mL的5mmol/L的乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH5.4)溶解14g蔗糖，不同體積可按此比例配制；
2)按底物反應液在上述50mL酶底物反應液加入酶活為145 160U/mL的酶液15 mL后，用相同緩沖液定容到IOOmL ；
3)上述混合液在25°C、采用間隙振蕩的酶催化方法，可以大幅提高轉化效率。即反應開始時采用振蕩器對反應液進行120n/min振蕩證，然后靜置反應5h，依此交替進行反應， 2 后結束催化反應；
4)將催化后的反應液進行醇沉洗滌，真空干燥稱重，得到高分子右旋糖酐，將醇沉液經過離心過濾去除大分子雜質，再經過超濾去除小分子低聚糖、濾液經過真空濃縮、噴霧干燥得到果糖，摩爾轉化率達到90%。
實施例2
(1)聯合誘導制備重組右旋糖酐蔗糖酶發酵2
基因工程菌株BL21 (DE3) /pET28-dexYG,從斜面中轉接到20mL新鮮LB培養基(含卡那50ug/mL)中，37°C、300r/min過夜培養，培養時間為16h，再按照1%的接種量接種到培養基B中發酵培養。發酵液于37°C、300r/min培養，每小時取發酵液lmL，用無菌水稀釋10 倍，測量0D_。當0D_=3. 5時，采用IPTG與乳糖聯合誘導法制備右旋糖酐蔗糖酶至IPTG終濃度為0. 12 mmol/L、乳糖終濃度為3. Og/L，于、300r/min誘導培養，誘導時間為釙。發酵后的液體在4°C、12000r/min離心15min得菌體后加入pH5. 4醋酸緩沖液，超聲破碎lOmin， 離心取上清液得粗酶液，酶活達到160 170U/mL。(2)應用上述聯合誘導的重組右旋糖酐蔗糖酶采用間隙振蕩的酶催化方法，一步法催化合成右旋糖酐及果糖，步驟為
1)酶底物反應液配制用50mL的5mmol/L的乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH5.4)溶解14g蔗糖，不同體積可按此比例配制；
2)按底物反應液在上述50mL酶底物反應液加入酶活為160 170U/mL的酶液10mL 后，用相同緩沖液定容到IOOmL ；
3)上述混合液在30°C采用間隙振蕩的酶催化方法，即反應開始時采用振蕩器對反應液進行120n/min振蕩5h，然后靜置反應5h，依此交替進行反應，2 后結束催化反應，大幅提高了轉化效率。(4)將催化后的反應液進行醇沉洗滌，真空干燥稱重，得到高分子右旋糖酐，將醇沉液經過離心過濾去除大分子雜質，再經過超濾去除小分子低聚糖、濾液經過真空濃縮、 噴霧干燥得到果糖。摩爾轉化率達到95%。
權利要求
1.一種重組酶法生產右旋糖酐和果糖的方法，其特征在于包括下述步驟(1)游離重組右旋糖酐蔗糖酶的制備將基因工程菌株BL21(DE;3)/pEI^8-deXYG轉接到含40-60 μ g/mL卡那霉素的新鮮LB培養基中，并于35_40°C下培養15_1他，再將其接種到產酶培養基B中于35-40°C下發酵培養，當0D_=2. 5-4. 0時，采用IPTG與乳糖聯合誘導至IPTG終濃度為0. 07-0. 12 mmol/L、乳糖終濃度為2. 0 -3. Og/L，誘導溫度為20_30°C，誘導時間為4- ；培養后的液體于0-5°C離心得菌體后加入pH5. 4醋酸緩沖液，超聲破碎，離心取上清液即得重組右旋糖酐蔗糖酶液；(2)以重組右旋糖酐蔗糖酶催化合成右旋糖酐和果糖采用下述步驟(a)用50mL的5mmol/L的pH5.4乙酸-乙酸鈉緩沖液溶解10_15g蔗糖配制酶底物反應液；再向其中加入酶活70-170u/ml的重組右旋糖酐蔗糖酶液10-15 mL后，用5mmol/L的 PH5. 4乙酸-乙酸鈉緩沖液定容到IOOmL ；(b)在25-30°C下反應開始時采用振蕩器對反應液進行120n/min振蕩5h，然后靜置反應5h，依此交替進行反應，22-25h后結束催化反應；(c)將催化后的反應液進行醇沉洗滌，真空干燥稱重，得到高分子右旋糖酐，將醇沉液經過離心過濾去除大分子雜質，再經過超濾去除小分子低聚糖、濾液經過真空濃縮、噴霧干燥得到果糖。
2.如權利要求1所述的重組酶法生產右旋糖酐和果糖的方法，其特征在于所述步驟 (1)中培養基B用于大腸桿菌的發酵和酶的誘導，其中含有甘油、蛋白胨及培養基常用的無機鹽組分。
3.如權利要求1所述的重組酶法生產右旋糖酐和果糖的方法，其特征在于所述步驟(1)中發酵培養時，當0D_=3.0時，采用IPTG與乳糖聯合誘導法制備右旋糖酐蔗糖酶，加入 IPTG和乳糖的終濃度分別為0. 09mmol/和2. 5g/L，然后于25°C誘導培養。
4.如權利要求1所述的重組酶法生產右旋糖酐和果糖的方法，其特征在于所述步驟(2)中加入的重組右旋糖酐蔗糖酶液酶活為145-170u/ml。
全文摘要
本發明公開了一種重組酶法生產右旋糖酐和果糖的方法，其包括步驟(1)采用基因工程菌株BL21(DE3)/pET28-dexYG培養制備游離重組右旋糖酐蔗糖酶；(2)以重組右旋糖酐蔗糖酶催化合成右旋糖酐和果糖。本發明提供了一種利用基因工程菌株BL21(DE3)/pET28-dexYG并采用IPTG與乳糖聯合誘導法制備游離的重組右旋糖酐蔗糖酶，此法大幅降低由IPTG單獨誘導時的制酶成本，有利于規模化生產。同時，采用間隙振蕩的酶催化方法，一步催化合成右旋糖酐和果糖，轉化率高，實現了一酶多用、回收果糖，降低了成本，也解決了右旋糖酐原生產工藝中副產物果糖對環境的污染問題。
文檔編號C12P19/02GK102229970SQ20111013230
公開日2011年11月2日 申請日期2011年5月23日 優先權日2011年5月23日
發明者崔維華, 張洪斌, 楊運根, 胡雪芹, 衣學福 申請人:六安華源制藥有限公司, 合肥工業大學