專利名稱：一種產生聚蘋果酸的菌株及利用其發酵生產聚蘋果酸的方法
技術領域：
本發明涉及一種高產聚蘋果酸[poly (β-L- malic acid), PMLA]的菌株以及利用該菌株發酵生產聚蘋果酸的方法。
背景技術：
聚蘋果酸[poly (β-L- malic acid)，PMLA]是以蘋果酸為唯一單體、相互通過酯鍵聯接而成的一種特殊的脂肪族聚酯，它是天然多聚物中新近開發的一種生物多聚物。 PMLA是以蘋果酸為基本結構單元，以一個蘋果酸分子的-OH和另一個蘋果酸分子的α或 β -COOH連接而成。目前發現有3種結構的PMLA α型、β型和Υ型三種聚蘋果酸可以通過化學的或生物的方法合成，目前兩種方法都在研究中。通過學合成可以得到3種類型聚蘋果酸；而從微生物細胞中分離的聚蘋果酸有β型一種。聚蘋果酸含有很多自由羧基和非對稱碳原子，具有良好的水溶性，生物可降解性， 生物相容性和生物可吸收性。這些性質使得聚蘋果酸及其衍生物在制藥、醫學、食品和化妝品領域有很重要的應用。目前已經涉及應用的領域包括藥物載體及微膠囊材料、生物醫學材料如固體藥物外包裝、滲析袋、醫療器械附加高分子涂層、組織工程的支架材料等、化妝產品輔料等。目前聚蘋果酸的制備主要有化學合成法和生物合成法兩種。生物合成法采用微生物發酵生產聚蘋果酸。聚β-L-聚蘋果酸可以由各種各樣的黏菌和絲狀真菌合成。短梗霉屬菌株合成較低等分子量的聚蘋果酸，分子量約為llKDa，由黏菌合成的聚蘋果酸分子量約為50 300KDa。短梗霉屬菌株生產的聚蘋果酸產量很高，菌株A/r⑶如Μ Τ/ sp.以葡萄糖、丁二酸銨分別為碳氮源，添加適量的丁二酸，CaCO3調節發酵液的pH值，得到的發酵液中含量為47 g/Ι聚蘋果酸。普魯蘭多糖是短梗霉屬菌株生產聚蘋果酸時產生的主要副產物，同時很多短梗霉屬菌株還產生大量黑色素。由黏菌產生的聚蘋果酸產量相對較低，最大3.3g/l。另外，生物合成的聚蘋果酸具有高度的光學純度，均為聚-L-蘋果酸。化學合成法有直接聚合法和開環聚合法。一般來說，直接聚合得到的主要是Y 型聚蘋果酸，其相對分子質量比較低，最大只有51(徹，且催化劑有毒性，較難分離得到產物。開環聚合法得到的聚蘋果酸相對分子質量較大，最大可以達到174KDa。由于目前研究關注的熱點是在微生物體內發現的天然β型聚蘋果酸，而β型的聚蘋果酸只有內酯開環法可以合成，但該方法形成內酯的步驟較多、且產率太低，中間產物分離提純步驟繁瑣，反應對于原料和裝置都有很高要求，導致了高成本，這些制約了該方法的實際應用。生物法合成聚蘋果酸可以利用可再生的生物資源發酵生產，成本低廉，合成條件溫和，產物的分子量相對較高，從發酵液中提取純化步驟簡單，通過甲醇或乙醇反復沉淀就可以得到聚蘋果酸鈣鹽。因此生物法合成具有很大優勢，但其開發和應用受到了高成本，低效率的制約，目前還沒有一個優化的可以工業化生產的路線，只有少量的天然聚蘋果酸和人工合成聚蘋果酸可以提供。如果能夠提高天然聚蘋果酸的產量，降低其生產成本，其應用
3領域將會得到進一步開發。
發明內容
本發明的目的是提供一種產生聚蘋果酸的菌株及利用該菌株發酵生產聚蘋果酸的方法
技術領域：
本發明的產生聚蘋果酸的菌株，是從植物葉片表面篩選得到的不產生黑色素的菌株， 分類命名為出芽短梗霉，拉丁文學名為(Aureobasidium pullulans)ZD-3D,該菌株已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，編號為CGMCC No. 4605。保藏日期 2011. 2.對，保藏單位地址中國科學院微生物研究所。本發明所述的菌株其形態特征為菌落表面粘稠，最初為白色，逐漸變為黑色，邊緣有菌絲伸入瓊脂內部，沒有氣生菌絲。可產生橢圓形酵母樣芽生孢子，厚壁孢子，腫脹孢子和菌絲。通過將該菌株的rDNA的ITS序列和其他真菌的比對，結果證實本發明的菌株為出芽短梗霉{Aureobasidium pullulans )。利用產生聚蘋果酸的菌株生產聚蘋果酸的方法，包括以下步驟
1)取25°C培養48 60h的出芽短梗霉ZD-3D斜面菌種一環，接種于液體種子培養基，裝液量為500ml三角瓶中3(T60ml培養基，轉速為16(T220rpm，2(T30°C培養48 80h得到種子液；
上述的種子培養基為:4(Tl60g/l碳源，0. 5 4g/l氮源，0. Γ . 0g/lK2C03,0. Γ . Og/ IKH2PO4,0. Γ . 0g/lMgS04 · 7Η20，0· 0Γ0. lg/1 ZnSO4 · 7Η20，0· 5 2g/l 玉米菜，10 30g/l 碳酸鈣；
2)將制備好的種子液按59TlO%比例接種到發酵培養基中，裝液量500ml三角搖瓶中 3(T60ml培養基，轉速為16(T220rpm，25°C，培養10(Tl80h ；或者將制備好的種子液接種到發酵罐，發酵培養基裝液量為發酵罐容積的40-70%，接種量59TlO%，溫度25°C，通氣量 0. 2 0. 4m3/h，轉速 20(T400rpm，發酵時間 120 180h ；
上述的發酵培養基:10(Tl60g/l 碳源，0. 5 4g/l 氮源，0. Γ . 0g/lK2C03,0. Γ . Og/ IKH2PO4,0. Γ . 0g/lMgS04 ·7Η20，0· 0Γ0. lg/1 ZnSO4 ·7Η20，0· 5 2g/l 玉米漿，10 40g/l 碳酸鈣；
3)將步驟2)得到的發酵液用硅藻土抽濾除去菌體和剩余碳酸鈣，過濾的上清液中加入等倍體積的甲醇，輕輕攪動后，放置lh，用濾紙過濾除去多糖沉淀，在上清液中繼續加入等倍體積甲醇，4°C放置過夜后，離心去上清，沉淀物用80%甲醇洗滌，冷凍干燥后得到聚蘋果酸。上述培養基中的碳源可以為葡萄糖、蔗糖、果糖、木糖、半乳糖或麥芽糖。培養基中的氮源可以為硝酸銨、硝酸鈉、氯化銨、蛋白胨、酵母膏、尿素或玉米漿。本發明所述的培養基中，碳酸鈣可以起調節發酵液PH的作用。除了調節pH外，添加碳酸鈣可以減少副產物普魯蘭多糖的產生，同時增加聚蘋果酸的產量。碳酸鈣在本培養基中的作用是關鍵的，使用其他堿性試劑代替碳酸鈣調節PH不能起到相同的效果。而過量的碳酸鈣會抑制細胞生長。本發明得到的聚蘋果酸[poly (β-L- malic acid), PMLA]具有如下性質1.易溶于水，不溶于甲醇、乙醇、丙酮等有機溶劑。2.聚蘋果酸經過2M硫酸在90°C水解18 24h后，經HPLC檢測，其水解產物為單一
產物蘋果酸。3.聚蘋果酸經過紅外光譜測定，具有1172 CnT1 ( - C - 0 - C)和1732 cnT1 ( - C=O) 酯鍵特征吸收峰，1732 cnT1 ( - C=O)和14 cnT1 ( - C - 0)羧基特征吸收峰。聚蘋果酸鹽具有1602 cm—1羧酸鹽吸收峰。4.聚蘋果酸經過核磁共振碳譜測定，化學位移分別為C-I (-C00H-) 175.6， C-2 (-CH0H-)71. 5，C_3 (-CH2-) 35. 8，C-4 (-C0-) 171. 6。5.聚蘋果酸經過GPC檢測，Mn，Mw和分散度分別為4247，4631和1. 09。本發明的有益效果
1.本發明提供了一種自行篩選的出芽短梗霉菌株(編號為CGMCC No. 4605)，可以高效的發酵產生聚蘋果酸(PMLA)。2.本發明所提供的菌株不產生黑色素，發酵液為白色，有利于簡化后期處理工藝。3.本發明所提供的方法通過加入碳酸鈣來調節副產物普魯蘭多糖的產生，提高聚蘋果酸的產量，有利于聚蘋果酸的分離純化。4.本發明所提供的方法簡單易行，所用的原料簡單，聚蘋果酸產量最高可達到 5(T60g/l，為商業化，大規模生產提供了適合的方法。5.本發明所得的聚蘋果酸產品為白色，提取方法簡單，產品無毒害，具有良好的水溶性和生物可降解性，可以廣泛應用與醫藥，化妝品或食品行業。
圖1是發酵過程曲線。
具體實施例方式以下實施例用以說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。實施例1
1)取25°C培養48h的出芽短梗霉ZD-3D斜面菌種一環，接種于液體種子培養基，裝液量為500ml三角瓶中60ml培養基，轉速為220rpm，25°C培養4 得到種子液；
2)將制備好的種子液按10%比例接種到發酵培養基中，裝液量500ml三角搖瓶中60ml 培養基，轉速為220rpm，25°C，培養160h ；
上述的種子培養基為80g/l葡萄糖，2g/l硝酸鈉，0. 04%K2C03,0. 01%KH2P04, 0. 01%MgS04 · 7Η20，0· 01% ZnSO4 · 7Η20，0· 5g/l 玉米菜，20g/l 碳酸鈣；
上述的發酵培養基:120g/l葡萄糖，2g/l硝酸鈉，0. 04%K2C03,0. 01%KH2P04, 0. 01%MgS04 · 7Η20，0· 01% ZnSO4 · 7Η20，0· 5g/l 玉米菜，30g/l 碳酸鈣。碳酸鈣單獨滅菌后與已滅菌的其他培養基成分混合。3)將步驟2)得到的發酵液用硅藻土抽濾除去菌體和剩余碳酸鈣，過濾的上清液中加入等倍體積的甲醇，輕輕攪動后，放置lh，用濾紙過濾除去多糖沉淀，在上清液中繼續加入等倍體積甲醇，4°C放置過夜后，離心去上清，沉淀物用80%甲醇洗滌2次，冷凍干燥后得到聚蘋果酸白色粉末。經PMLA產量測定，產量可達到49. 76g/l。
PMLA產量測定方法如下
聚蘋果酸水溶液加入等體積的2M H2SO4,，90°C水解12h，水解后的蘋果酸含量經高效液相色譜分析，色譜柱Bio-Rad Aminex HPX-87H，色譜條件流動相5mM H2SO4,流速0. 6ml/ min，溫度 45 °C ο實施例2
1)取25°C培養48h的出芽短梗霉ZD-3D斜面菌種一環，接種于液體種子培養基，裝液量為500ml三角瓶中60ml培養基，轉速為220rpm，25°C培養4 得到種子液；
2)將制備好的種子液按10%比例接種到發酵培養基中，裝液量500ml三角搖瓶中60ml 培養基，轉速為220rpm，25°C，培養160h ；
上述的種子培養基為:80g/l葡萄糖，2g/l硝酸鈉，0. 04%K2C03，0. 01%KH2P04, 0. 01%MgS04 · 7Η20，0· 01% ZnSO4 · 7Η20，0· 5g/l 玉米菜，20g/l 碳酸鈣。上述的發酵培養基:120g/l蔗糖，2g/l 硝酸鈉，0. 04%K2C03,0. 01%KH2P04, 0. 01%MgS04 · 7Η20，0· 01% ZnSO4 · 7Η20，0· 5g/l 玉米菜，30g/l 碳酸鈣。碳酸鈣單獨滅菌后與已滅菌的其他培養基成分混合。3)將步驟2)得到的發酵液用硅藻土抽濾除去菌體和剩余碳酸鈣，過濾的上清液中加入等倍體積的甲醇，輕輕攪動后，放置lh，用濾紙過濾除去多糖沉淀，在上清液中繼續加入等倍體積甲醇，4°C放置過夜后，離心去上清，沉淀物用80%甲醇洗滌2次，冷凍干燥后得到聚蘋果酸白色粉末。經PMLA產量測定，產量可達到53. 65g/l。實施例3 1)同實施例1。2)同實施例1，區別在于發酵培養基120g/l葡萄糖，2g/l NH4NO3,0. 04%K2C03, 0. 01%ΚΗ2Ρ04，0· 01%MgS04 · 7Η20，0· 01% ZnSO4 · 7Η20，0· 5g/l 玉米漿，30g/l 碳酸鈣。3)同實施例1。經PMLA產量測定，產量可達到50. 75g/l。實施例4 1)同實施例1。2)同實施例1，區別在于發酵培養基120g/l葡萄糖，2g/l硝酸鈉，0. 04%K2C03, 0. 01%KH2P04,0. 01%MgS04 · 7H20,0. 01% ZnSO4 · 7H20,0. 5g/l 玉米菜，5g/l 富馬酸鈉，30g/l 碳酸鈣。3)同實施例1。經PMLA產量測定，產量可達到62. 27g/l。實施例5 1)同實施例1。2)同實施例1，區別在于發酵培養基120g/l木糖，2g/l NH4NO3,0. 04%K2C03, 0. 01%ΚΗ2Ρ04，0· 01%MgS04 · 7Η20，0· 01% ZnSO4 · 7Η20，0· 5g/l 玉米漿，30g/l 碳酸鈣。3)同實施例1。經PMLA產量測定，產量可達到29. 63g/l。實施例6 1)同實施例1。
2)同實施例1，區別在于發酵培養基120g/l葡萄糖，2g/l硝酸鈉，0. 04%K2C03， 0. 01%ΚΗ2Ρ04，0· 01%MgS04 ·7Η20，0· 01% ZnSO4 ·7Η20，0· 5g/l 玉米漿，0、10、20、30、40g/l 碳酸鈣(碳酸鈣添加量對PMLA和副產物普魯蘭多糖產量的影響見表1 )。碳酸鈣單獨滅菌后與已滅菌的其他培養基成分混合。3)同實施例1。PMLA產量測定和普魯蘭多糖含量測定 PMLA產量測定方法同實施例1。普魯蘭多糖采用苯酚-硫酸法測定首先對硅藻土抽濾除菌后的發酵液用95%的乙醇沉淀多糖，將獲得的多糖在濃硫酸的作用下水解成單糖，并迅速脫水生成糖醛衍生物， 然后與苯酚生成橙黃色化合物，在490nm處測定光吸收值。以已知含量葡萄糖做標準曲線。測定結果見表1。隨著碳酸鈣添加量的增加，PMLA產量也增加，當添加40g/l碳酸鈣時，PMLA產量達到最大45. 42g/l，而副產物多糖產量減少到最少0. 76g/l。表1碳酸鈣添加量對PMLA和副產物普魯蘭多糖產量的影響
權利要求
1.一種產生聚蘋果酸的菌株，其特征在于該菌株是從植物葉片表面篩選得到的不產生黑色素的菌株，分類命名為出芽短梗霉，拉丁文學名為(Aureobasidium pullulans)ZD-3D, 該菌株已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，，編號為CGMCC No. 4605。
2.用權利要求1所述的產生聚蘋果酸的菌株發酵生產聚蘋果酸的方法，其特征在于包括以下步驟1)取25°C培養48 60h的出芽短梗霉ZD-3D斜面菌種一環，接種于液體種子培養基，裝液量為500ml三角瓶中3(T60ml培養基，轉速為16(T220rpm，2(T30°C培養48 80h得到種子液；上述的種子培養基為:4(Tl60g/l碳源，0. 5 4g/l氮源，0. Γ . 0g/lK2C03,0. Γ . Og/ IKH2PO4,0. Γ . 0g/lMgS04 · 7Η20，0· 0Γ0. lg/1 ZnSO4 · 7Η20，0· 5 2g/l 玉米菜，10 30g/l 碳酸鈣；2)將制備好的種子液按59TlO%比例接種到發酵培養基中，裝液量500ml三角搖瓶中 3(T60ml培養基，轉速為16(T220rpm，25°C，培養10(Tl80h ；或者將制備好的種子液接種到發酵罐，發酵培養基裝液量為發酵罐容積的40-70%，接種量59TlO%，溫度25°C，通氣量 0. 2 0. 4m3/h，轉速 20(T400rpm，發酵時間 120 180h ；上述的發酵培養基:10(Tl60g/l 碳源，0. 5 4g/l 氮源，0. Γ . 0g/lK2C03,0. Γ . Og/ IKH2PO4,0. Γ . 0g/lMgS04 ·7Η20，0· 0Γ0. lg/1 ZnSO4 ·7Η20，0· 5 2g/l 玉米漿，10 40g/l 碳酸鈣；3)將步驟2)得到的發酵液用硅藻土抽濾除去菌體和剩余碳酸鈣，過濾的上清液中加入等倍體積的甲醇，輕輕攪動后，放置lh，用濾紙過濾除去多糖沉淀，在上清液中繼續加入等倍體積甲醇，4°C放置過夜后，離心去上清，沉淀物用80%甲醇洗滌，冷凍干燥后得到聚蘋果酸。
3.根據權利要求2所述的用產生聚蘋果酸的菌株發酵生產聚蘋果酸的方法，其特征在于培養基中的碳源為葡萄糖、蔗糖、果糖、木糖、半乳糖或麥芽糖。
4.根據權利要求2所述的用產生聚蘋果酸的菌株發酵生產聚蘋果酸的方法，其特征在于培養基中的氮源為硝酸銨、硝酸鈉、氯化銨、蛋白胨、酵母膏、尿素或玉米漿。
全文摘要
本發明公開的產生聚蘋果酸的菌株，是從植物葉片表面篩選得到的不產生黑色素的菌株，分類命名為出芽短梗霉，拉丁文學名為(Aureobasidium pullulans)ZD-3D,該菌株保藏編號為CGMCC No.4605。利用該菌株發酵生產聚蘋果酸方法簡單易行，有利于聚蘋果酸的分離純化，產量最高可達到50~60g/L。
文檔編號C12P7/62GK102220248SQ20111013156
公開日2011年10月19日 申請日期2011年5月20日 優先權日2011年5月20日
發明者張慧莉, 徐志南, 蔡謹, 黃磊 申請人:浙江大學