專利名稱：一株產甘草次酸的甘草內生真菌的制作方法
技術領域：
本發明涉及一株內生真菌。
背景技術：
植物內生真菌是產生活性物質和新化學物質的潛在資源，不但可以幫助維護人類健康，也可以維護動物和植物的健康。藥用植物本身就能產生多種活性物質，實驗研究表明，植物與內生細菌在相互作用的過程中，有內生細菌能產生與植物相同或相似的活性物質，因此從藥用植物中分離到產生活性物質的內生細菌已成為當今學者的研究趨勢。
發明內容
本發明提供了一株產甘草次酸的甘草內生真菌。產甘草次酸的甘草內生真菌，它為輪枝孢屬菌RE7 (Verticillium dahlia Re7), 屬于絲孢科輪枝孢屬(Verticillium)，已在中國典型培養物保藏中心保藏，保藏編號為 CCTCC No :M2011114，保藏地址為武漢市武漢大學，保藏日期為2011年4月9日；它的分生孢子頭呈圓柱狀，分生孢子梗細長、有分支，頂端小梗下部膨大而尖端細削，分生孢子單生， 為單細胞；它在PDA固體培養基上形成白色圓形菌落，基質為黃紅色，菌落直徑為7 9cm， 中心凸起，菌落邊緣整齊，緊貼培養基，菌絲致密，呈氈毛狀。本發明中產甘草次酸的甘草內生真菌，它為輪枝孢屬菌RE7 (Verticillium dahlia Re7)，其ITS序列提交至NCBI網頁，通過Blast搜索與所得到的序列相似性高的序列，并通過DNAMAN軟件構建系統進化樹，RE7菌株的ITS序列與輪枝孢屬菌(Verticillium dahlia，編號⑶461624. 1)菌株的同源性都達到了 96%以上，結合形態學觀察結果，確定輪枝孢屬菌RE7 (Verticillium dahlia Re7)為絲孢科輪枝孢屬的一個新菌種。本發明中產甘草次酸的甘草內生真菌，它為輪枝孢屬菌RE7 (Verticillium dahlia Re7)，屬于絲孢科輪枝孢屬(Verticillium)，已在中國典型培養物保藏中心保藏， 保藏編號為CCTCCNo =M 2011114，保藏地址為武漢市武漢大學，保藏日期為2011年4月9 曰。本發明利用微生物制藥手段提取分離甘草健康植株的內生真菌，以抑菌活性為指標，采用濾紙片法進行抑菌實驗，篩選得到抑菌活性較強的RE7，并以薄層層析法，HPLC法為分析手段，從甘草內生真菌中找到能夠產生活性成分的菌株，并從其發酵液中提取分離活性物質，測定其活性代謝產物，最后將獲得的RE7菌株通過形態學觀察和16S rDNA序列分析鑒定其種屬。本發明中產甘草次酸的甘草內生真菌，它為輪枝孢屬菌RE7 (Verticillium dahlia Re7)，其代謝物具有較好的抑菌活性，同時從其代謝物中發現其含有甘草次酸，甘草次酸是經典的抗炎藥物目前在醫藥化妝品等領域中廣泛應用，還具有防癌和抗癌作用； 本發明對采用甘草內生真菌RE7生產甘草次酸具有指導意義。
圖1為具體實施方式
一中產甘 草次酸的甘草內生真菌的孢子顯微結構圖；圖2 為具體實施方式
一中產甘草次酸的甘草內生真菌的PCR擴增的電泳圖，其中M泳道表示 Marker, G泳道表示RE7 ；圖3為具體實施方式
一中產甘草次酸的甘草內生真菌的系統進化樹圖；圖4為具體實施方式
一中甘草次酸對照品的HPLC色譜圖，其中a表示甘草次酸；圖5 為具體實施方式
一中供試品晶體A的HPLC色譜圖，其中a表示供試品晶體A ；圖6為具體實施方式
一中加入對照品后供試品晶體A的HPLC色譜圖，其中a表示加甘草次酸后供試品晶體A。
具體實施例方式具體實施方式
一本實施方式產甘草次酸的甘草內生真菌，它為輪枝孢屬菌 RE7 (Verticillium dahlia Re7)，屬于絲孢科輪枝孢屬(Verticillium)，已在中國典型培養物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCC No :M2011114，保藏地址為武漢市武漢大學，保藏日期為2011年4月9日；它的分生孢子頭呈圓柱狀，分生孢子梗細長、有分支，頂端小梗下部膨大而尖端細削，分生孢子單生，為單細胞，孢子直徑為1. 4m ；它在PDA固體培養基上形成白色圓形菌落，基質為黃紅色，菌落直徑為7 9cm，中心凸起，菌落邊緣整齊，緊貼培養基， 菌絲致密，呈氈毛狀。本實施方式中輪枝孢屬菌RE7 (Verticillium dahlia Re7)，其生長溫度為28°C， 生長PH值為7。本實施方式中產甘草次酸的甘草內生真菌，它為輪枝孢屬菌RE7 (Verticillium dahliaRe7)，該菌株分離自健康的野生甘草的根莖，采自大慶地區，植株年齡3年，植株健壯，無病蟲害，其樣本現存于黑龍江大學生命科學學院生物制藥專業實驗室；它按以下步驟進行分離培養(1)材料預處理選取健康的野生甘草的根莖用自來水沖洗干凈后以無菌濾紙吸干水分，切成Icm小段，備用；(2)表面消毒于無菌超凈臺內將甘草的根莖按下述方法進行表面消毒75%酒精浸泡lmin-2%次氯酸鈉浸泡15min-無菌水沖洗3次；用無菌手術刀將甘草的根莖從中間切開，分別置于馬鈴薯固體分離培養基和馬鈴薯液體分離培養基中，分別在28°C恒溫培養箱和搖床中培養，待其邊緣及頂端長出菌絲后，挑取菌落轉移到相應的培養基中；(3)陰性對照取最后一次無菌水沖洗液涂布培養平板或取適量此沖洗液倒入馬鈴薯液體培養基內作對照，另將消毒后的實驗材料在馬鈴薯固體分離培養基上滾動一周作對照，于相同的條件下培養；(4)菌體培養將消毒后的實驗材料分別置于5%甘草提取液馬鈴薯固體分離培養基和5%甘草提取液馬鈴薯液體分離培養基中，于28°C恒溫水浴搖床和恒溫培養箱中， 培養3 5d，待實驗材料周圍長出菌體，挑取菌體轉入平板多次劃線分離純化，將純化后的菌株置于斜面固體培養基中，4°C保存備用；其中5%甘草提取液馬鈴薯固體分離培養基每L由200g的馬鈴薯、20g的葡萄糖、 20g的瓊脂和余量的5%甘草提取液組成，pH值為7. 0 7. 2，121°C下高壓滅菌30min ；5 %甘草提取液馬鈴薯液體分離培養基每L由200g的馬鈴薯、20g的葡萄糖和余量的5%甘草提取液組成，pH值為7. O 7. 2，121°C下高壓滅菌30min ；
斜面固體培養基為取5mL的5%甘草提取液馬鈴薯固體分離培養基裝于試管中， 121°C高壓滅菌30min后，鋪成斜面冷卻，以備保存菌種。結果從甘草的根莖中分離出內生真菌RE7，并且陰性對照中對照平板和對照液體培養基內均無任何菌長出，多次重復均如此，證明所分到的菌是植物內生真菌，而不是表面的附生菌。篩選出的內生真菌RE7根據《真菌分類學》、《真菌鑒定手冊》和《半知菌屬圖解》進行形態學鑒定，其菌落特征和孢子形態與輪枝孢屬菌特征極為相近，孢子顯微結構如圖1所示；分子鑒定內生真菌RE7發酵液抽濾得菌絲體用5%乙醇漂洗2次，滅菌的去離子水沖洗2次，離心去上清液，提取總DNA后進行目的片段的PCR擴增，將含有目標條帶的PCR 產物全部進行再一次的點樣，用2%的瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下用解剖刀將目的條帶切下，用DNA膠回收試劑盒回收，制備感受態大腸桿菌細胞，將PCR產物與pMDIS-T載體進行連接后，連接產物加入到感受態細胞中，進行菌落PCR驗證；挑取單菌落進行大腸桿菌轉化子的PCR檢測，證明目的片段已成功轉化進入感受態細胞中后，將克隆陽性菌株送上海生工生物工程技術服務有限公司測序；所測定的核苷酸序列在NCBI數據庫中應用BLAST分析進行同源性比較，并根據分子系統學研究的基本原理選擇相應種屬代表菌株的18S rDNA序列應用軟件CLUSTALX 1.83和MEGA 4. 1以近鄰結合法(Neighbor-joining)構建系統發育樹，bootstrap檢驗值> 50% (1000重復)，確定目標菌株的分類地位；內生真菌RE7基因組經尿素法提取后，采用PCR擴增后凝膠成像結果如圖2所示， 在750bp附近得到一擴增片段，證明已成功從內生真菌RE7菌株中提取出其基因組DNA ；根據內生真菌RE7的ITS序列提交至NCBI網頁，通過Blast搜索與所得到的序列相似性高的序列，并通過DNAMAN軟件構建系統進化樹(見圖3)，RE7菌株的ITS序列與輪枝孢屬菌(Verticillium dahlia，編號⑶461624. 1)菌株的同源性都達到了 96%以上，結合形態學觀察結果，確定篩選出的內生真菌RE7為絲孢科輪枝孢屬的一個新菌種，命名為輪枝孢屬菌 RE7 (Verticillium dahlia Re7)。本實施方式中產甘草次酸的甘草內生真菌，它為輪枝孢屬菌RE7 (Verticillium dahliaRe7)，其發酵液的甲醇提取物抑菌活性實驗，結果如表1所示，甘草內生真菌發酵液的甲醇提取物抑菌活性實驗結果表明，RE7對單增李斯特菌具有較強的抑制作用。表1 RE7發酵液甲醇提取物對12種試驗菌的抑菌活性篩選結果
權利要求
1. 一株產甘草次酸的甘草內生真菌，其特征在于它為輪枝孢屬菌 RE7 (Verticilliumdahlia Re7)，屬于絲孢科輪枝孢屬(Verticillium)，已在中國典型培養物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCC No =M 2011114，保藏地址為武漢市武漢大學，保藏曰期為2011年4月9日。
全文摘要
一株產甘草次酸的甘草內生真菌，它涉及一株內生真菌。產甘草次酸的甘草內生真菌，它為輪枝孢屬菌RE7(Verticillium dahlia Re7)，屬于絲孢科輪枝孢屬，已在中國典型培養物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCC M2011114，保藏地址為武漢市武漢大學，保藏日期為2011年4月9日。本發明中產甘草次酸的甘草內生真菌，它為輪枝孢屬菌RE7，其代謝物具有較好的抑菌活性，同時從其代謝物中發現其含有甘草次酸，甘草次酸是經典的抗炎藥物目前在醫藥化妝品等領域中廣泛應用，還具有防癌和抗癌作用；本發明對采用甘草內生真菌RE7生產甘草次酸具有指導意義。
文檔編號C12R1/645GK102220247SQ20111013154
公開日2011年10月19日 申請日期2011年5月19日 優先權日2011年5月19日
發明者孫婷媛, 孫雅北, 白長勝, 譚佳音, 鄭春英 申請人:黑龍江大學