專利名稱：一種t載體的構建方法
技術領域：
本發明涉及基因工程技術領域，具體的說是涉及一種T載體的構建方法。
背景技術：
基因克隆技術是現代基因工程研究的一項基本技術，是研究基因結構與功能的前提，利用T載體進行基因克隆是其中一種最簡捷、方便的方法。利用Taq DNA聚合酶進行 PCR擴增時，會在PCR產物的3’末端多加上一個A堿基，可與T載體的3’末端突出的T堿基配對，在DNA連接酶的作用下形成閉合環狀分子，轉化入大腸桿菌感受細胞內，過夜培養長成克隆菌落。可以利用菌落PCR和抽提質粒后限制性酶切的方法來初步篩選陽性克隆， 最后通過測序來鑒定克隆到的基因片段是否是目的基因片段。因此T載體在基因克隆方面應用非常廣泛。目前T載體的構建方法主要是用產生平末端的限制性內切酶(如EcoRV)將質粒 DNA切開，利用Taq DNA聚合酶和ddTTP在線性質粒兩條鏈的3，端加T制成T載體，如 Takara的pMD系列T載體和Promega的pGEM系列T載體。但該方法存在兩方面的缺陷一是線性質粒3’末端在DNA聚合酶作用下加T可能不完全，造成克隆過程中自身環化率高， 假陽性率較高；二是該方法需要經過EcoRV酶切、DNA聚合酶加T、電泳凝膠回收DNA片段等多個步驟，需要進行質量控制的環節較多，影響T載體克隆效率的因素也很多。同時也促使 T載體的生產過程繁瑣，成本較高，最終導致商業化T載體的價格較高。
發明內容
本發明目的是提供一種簡便高效的T載體構建方法，利用該方法可獲得高質量、 高穩定性的T載體，其克隆效率和正確率高，為基因克隆提供有力工具。為實現本發明的目的，本發明采用以下技術路線
步驟1 利用含AhdI識別序列的特異引物對(上游引物SEQ ID No:2，下游引物SEQ ID No: 3)以pEGFP-Cl載體為模板擴增Kanalr抗性基因片段(SEQ ID No: 1)，利用商業化PCR 回收試劑盒純化后得到kana抗性基因片段，在其兩端除含有AhdI位點外還含有另外兩個限制性酶BamHI和HindIII的識別位點；
步驟2 利用識別上述兩個限制性位點的內切酶BamHI和HindIII分別對kanf抗性基因片段和PUC-18質粒進行消化并利用商業化DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段；
步驟3 將消化后的kanf片段和pUC-18質粒以適當比例(摩爾比為1 :3)混合，在T4 DNA連接酶作用下連接成閉合環狀分子，后轉化入大腸桿菌DH5 α感受態細胞，利用卡那霉素篩選得到陽性克隆，從中提取質粒并經測序鑒定，即為T載體前體質粒；
步驟4 :Τ載體前體質粒經內切酶AhdI完全消化，并經回收得到大片段，即為T載體。本發明在構建T載體前體質粒時引入了新的抗性基因kanf進行篩選，方法簡便、 可操作性高，同時效率很高，而在得到前體質粒后利用限制性酶切的方法生產T載體與常規方法相比，操作步驟和控制環節大為減少，生產效率和T載體的質量和穩定性也大為提高。同時也可以將T載體轉化入大腸桿菌感受態并再利用卡那霉素進行篩選來進行T載體的質量控制。本方案所 述T載體的構建方法，所述AhdI識別位點序列為GACNNINNGTC，N為A， C，T，G中任一種堿基，該識別序列也可被任一種具有相似酶切特點的限制性內切酶的識別位點所替代，如Bst4CI的識別序列ACIGT，這類酶消化DNA后會在3’端留下一個堿基的突出末端(下劃線標示的堿基為酶切后突出的末端堿基)，而該類酶的識別序列中該突出末端位點可以是 T，這類酶還包括 Bmrl、HPyAV、MnlI、BciVI、HphI、MboII、XcmI、Bst4CI、TaaI、 Tsp4CI、AspEI、BmeRI、Hpy 1881 和 HpyCH4III 等。本方案所述T載體構建方法中提到的AhdI識別位點外側的兩個限制性酶位點為 BamHI和Hindlll，也可為骨架載體pUC_18質粒上其他滿足定向克隆條件的任一對多克隆位點所替代，如EcoRI和SalI。其中pUC_18載體也可為其他載體如pUC_19所代替，所選用限制性酶位點也應根據所選載體多克隆位點做相應變化。本方案所述T載休構建方法中提及的擴增得到的間隔在兩個AhdI位點間的基因片段為kanf基因片段，也可為其他抗性基因片段如氯霉素抗性基因片段所替代，但該基因片段應與所選骨架載體如PUC-18所含抗性基因不同；也可為其他具有可篩選特點的基因片段所代替。本發明所述T載體構建方法簡單高效，利用此方法所獲得的T載體仍保留有骨架載體的優點，在生產過程中可利用新引入的抗性基因片段來控制T載體的質量，具有質量穩定、自身環化率低、克隆效果高等特點。
圖1示用含AhdI位點的引物對以pEGFP-Cl質粒為模板經PCR擴增得到的產物 kanar電泳結果。泳道1為PCR擴增得到的SOObp左右大小的目的條帶，泳道2為回收后的 PCR產物電泳結果，泳道3為PCR產物經BamHI和HindIII雙酶切電泳回收后的片段。泳道 M所示為Takara生產的DL-2000 DNA分子量標志物。圖2示篩選得到的陽性T載體前體克隆經BamHI和HindIII雙酶切鑒定的凝膠電泳結果。泳道M為Takara生產的DL-2000 DNA分子量標志物，泳道1，2，3分別為挑選的三個陽性T載體前體克隆酶切結果，均有一條2000bp和800bp大小的目的條帶，2000bp大小的片段為骨架載體PUC-18質粒，而SOObp對應的是擴增得到的PCR產物kanf基因片段。
具體實施例方式實施例1 含AhdI位點的基因片段的擴增制備
以pEGFP-Cl質粒為模板，用具有SEQ ID No: 2和SEQ ID No: 3所示核苷酸序列的引物對，進行PCR擴增得到kanf對應的基因片段。PCR擴增反應體系(總體積20ul)為 pEGFP-Cl 質粒(10ng/ul)Iul IOuM上游引物 Iul IOuM下游引物 IulPremix Taq(Takara)7ul
ddH20IOul
PCR反應程序為
1)94 °C5min
2)94 °C15s
3)60 °C15s
4)72 °C15s
5)返回步驟2)，重復29次，共計30個循環
6)72 0CIOmin
7)16 0C5min
所得PCR產物經純化回收，1%瓊脂糖凝膠電泳壇檢測，結果見圖1。實施例2 =T載體前體質粒的制備
對實施例1中回收得到的PCR產物和pUC-18質粒分別用BamHI和HindIII雙酶切(所用內切酶及相應緩沖液均以Takara的產品為例)，反應體系如下 A管中加入以下成分 PCR產物Iug
BamHI(15U/ul) Iul HindIII (15U/ul) Iul 10* K Buffer 3ul ddH20 加足至 30ul。B管中加入以下成分 pUC-18 質粒 lug BamHI(15U/ul) Iul HindIII (15U/ul) Iul 10* K Buffer 3ul ddH20 加足至 30ul。將A，B兩管放入37°C恒溫水浴6-8小時進行酶切消化，后將酶切產物進行凝膠電泳并進行DNA凝膠回收。將兩種酶切后的片段按以下比例進行連接
連接反應體系
酶切后PCR產物片段IOOng
酶切后的pUC-18質粒IOOng
T4 DNA連接酶Iul
10*連接酶緩沖液2ul
ddH20補足至20ul
16°C連接過夜(8-12小時)。將連接產物轉化入DH5 α感受態細胞，利用PCR產物對應的抗生素卡那霉素進行篩選陽性克隆，并進行培養提取質粒，再利用BamHI和HindIII酶切鑒定得到有SOObp長的片段的質粒即為T載體前體質粒，并進行測序證實實施例3 :T載體的制備
用限制性內切酶AhdI按以下方式酶切實施例2所得T載體前體質粒，電泳回收得到 2000bp左右大小的線性載體即為T載體。
酶切反應體系
質粒Iug
AhdI (NEB 公司產品，5U/ul) Iul
NEB buffer 43ul
BSA0. Iul
ddH20補足至30ul
37° C恒溫水浴酶切消化6-8小時后，凝膠電泳并回收酶切后的線性載體。
權利要求
1.一種τ載體的構建方法，包括將上下游均含有特定的限制性性內切酶AhdI識別序列的基因片段定向克隆到骨架載體的兩個多克隆位點處，得到T載體前體；用內切酶AhdI 完全消化T載體前體并從電泳后凝膠中回收大片段，即為T載體。
2.根據權利要求1所述方法，特定限制性內切酶是指消化DNA后會在3’端留下一個堿基的突出末端，而該類酶的識別序列中該突出末端位點可以是T，這類酶還包括Bmrl、 HPyAV, MnlI、BciVI、HphI、MboII、XcmI、Bst4CI、TaaI、Tsp4CI、AspEI、BmeRI、Hpy 1881 禾口 HpyCH4III 等。
3.根據權利要求2的方法，該限制性內切酶為Ahdl，識別序列為GACNNINNGTC，下劃線的堿基為酶切后的突出末端堿基。
4.根據權利要求1和的3方法，上下游均含有特定限制性內切酶識別序列的基因片段是利用特異引物對PCR擴增得到，兩個AhdI識別位點之間間隔有200-2000bp的基因片段， 在上下游AhdI識別序列的外側分別有不同的常用的限制性內切酶識別位點，在這兩個限制性酶切位點的外側各有1-6個堿基的保護序列。
5.根據權利要求4的方法，該基因片段用特異引物對以pEGFP-Cl質粒為模板經PCR擴增得到的如SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列的卡那霉素抗性基因片段。
6.根據權利要求5的方法，該特異引物對的核苷酸序列為SEQID N0:2和SEQ ID NO:3 所示的核苷酸序列。
7.根據權利要求1的方法，骨架載體是包含PUC18質粒在內的任一種克隆用載體。
8.根據權利要求6的方法，骨架載體是pUC18質粒。
9.根據權利要求1，4，6的方法，兩個限制性內切酶位點是該種骨架載體上的兩個不同的多克隆位點。
10.根據權利要求7和8的方法，該兩種限制性內切酶位點為BamHI和HindIII的識別序列。
全文摘要
本發明涉及基因工程技術領域，提供了一種T載體的構建方法，該方法為將上下游均含有特定的限制性性內切酶AhdI識別序列的基因片段定向克隆到骨架載體的兩個多克隆位點處，得到T載體前體；用內切酶AhdI完全消化T載體前體并從電泳后凝膠中回收大片段，即得到T載體。利用該方法可獲得高質量、高穩定性的T載體，其克隆效率和正確率高。
文檔編號C12N15/66GK102220363SQ20111013152
公開日2011年10月19日 申請日期2011年5月20日 優先權日2011年5月20日
發明者周江寧, 方輝 申請人:方輝