專利名稱：一種鑒定茶樹無性系品種的分子標(biāo)記方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種鑒定農(nóng)作物品種純度的方法，特別涉及一種鑒定茶樹無性系品種純度的分子標(biāo)記方法。
背景技術(shù)：
茶葉是云南傳統(tǒng)支柱產(chǎn)業(yè)之一，也是山區(qū)農(nóng)民經(jīng)濟收入的重要來源。隨著名優(yōu)茶生產(chǎn)的發(fā)展，各地積極推進茶園良種化進程，經(jīng)過多年努力，云南省無性系良種茶園面積已超過160萬畝，良種化率達(dá)到30%。按照云南省委省政府每年發(fā)展無性系良種茶園面積10萬畝的規(guī)劃，年需良種苗木3億株(每畝3000株)。同時，隨著良種茶園的擴大，又大大促進了名優(yōu)茶的發(fā)展，為茶農(nóng)增收起到了巨大的作用。良種與名茶，相得益彰。統(tǒng)計還表明，無性系良種與當(dāng)?shù)厝后w種比較，其收益要高出1-3倍。因此，今后云南省對良種的需求將更 加迫切。茶樹是多年生作物，良種一經(jīng)應(yīng)用，收益將是長期的?？墒沁x育一個新品種需要十多年艱苦和細(xì)致的工作。由于技術(shù)條件的限制，以往品種種性真實性鑒定依據(jù)主要是形態(tài)特征和生化成分，因其易受環(huán)境條件、栽培措施和發(fā)育階段的影響，可靠性不強。由于缺乏有效的品種鑒別手段，在良種推廣過程中，出現(xiàn)品種假冒或有爭議時難以進行有效的監(jiān)督和仲裁。為了使云南省茶園良種化進程健康地發(fā)展，切實保護好新品種知識產(chǎn)權(quán)，迫切需要建立穩(wěn)定可靠的茶樹無性系品種鑒別方法和檢驗技術(shù)規(guī)程。現(xiàn)已表明分子標(biāo)記技術(shù)是進行作物品種鑒別的最有效手段(王忠華.DNA指紋圖譜技術(shù)及其在作物品種資源中的應(yīng)用[J].分子植物育種，2006，4(3) :425-430.)。這項技術(shù)的特點是可反映不同品種基因組水平上的變異；不受環(huán)境條件變化的影響；具有遺傳穩(wěn)定性；多態(tài)性好等等。目前，已有多種分子標(biāo)記技術(shù)在茶樹品種鑒別研究上應(yīng)用，并顯示出很好的實用性。而與其他分子標(biāo)記相比，SSR(Simple Sequence Repeat)標(biāo)記技術(shù)具有多態(tài)性高、共顯性、通用性好、開發(fā)快速、費用低等諸多優(yōu)點，已在多種農(nóng)作物遺傳連鎖圖譜構(gòu)建、遺傳多樣性研究、標(biāo)記和定位基因以及分子標(biāo)記輔助選擇等方面得到應(yīng)用，并發(fā)揮著越來越重要的作用。特別在茶樹上，已經(jīng)在茶樹遺傳多樣性、親緣關(guān)系、分子指紋圖譜等方面開展了應(yīng)用(劉振，王新超，趙麗萍，姚明哲，王平盛，許玫，唐一春，陳亮.基于EST-SSR的西南茶區(qū)茶樹資源遺傳多樣性和未緣關(guān)系分析.分子植物育種，2008, (6) 1 :100-110 ;姚明哲，劉振，陳亮，王新超，馬春雷，梁月榮.利用EST-SSR分析江北茶區(qū)茶樹資源的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu).茶葉科學(xué)，2009，29 (3) :243-250 ;王麗鴛，劉本英，姜燕華，段云裳，成浩，周健，唐一春.用SSR分子標(biāo)記研究茶組植物種間親緣進化關(guān)系.茶葉科學(xué)，2009，29 (5)157-165.)。云南科研單位選育的茶樹無性系良種試驗示范結(jié)果表明，這些品種具有優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、高效、適應(yīng)性廣等特點，是茶區(qū)生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)茶葉及改善茶區(qū)茶樹品種結(jié)構(gòu)的理想品種。為保證優(yōu)質(zhì)良種產(chǎn)生最大的經(jīng)濟效益、社會效益，需要一種權(quán)威、準(zhǔn)確、穩(wěn)定檢測方法進行茶樹無性系品種純度的快速鑒定。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種鑒定茶樹無性系品種純度的分子標(biāo)記方法，它具有多態(tài)性高、遺傳穩(wěn)定、不受環(huán)境條件影響等優(yōu)點，可以彌補傳統(tǒng)檢測方法的不足，從而為茶樹品種的純度檢測建立起高效、準(zhǔn)確、快速的鑒定方法。本發(fā)明所提供的鑒定茶樹無性系品種純度的方法，包括以下步驟I)按照如下方法提取待測茶樹品種的基因組DNA :將待檢測品種的I. Og鮮嫩芽葉放入研缽中，加入液氮充分研磨至粉末狀，加入CTAB緩沖液，65°C水浴30-60分鐘，再加入DNA提取液，提取得到待檢測茶樹品種的基因組DNA。2)按照如下方法對待檢測茶樹品種進行PCR擴增以步驟I)提取的基因組DNA為模板，用SSR引物進行PCR擴增，將所得到的PCR擴增產(chǎn)物進行10%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，得到待檢測茶樹品種的電泳圖譜。
3)將待檢測茶樹品種的電泳圖譜與按照所述步驟I)和2)的方法得到的標(biāo)準(zhǔn)茶樹品種的電泳圖譜進行比較，如待檢測品種與標(biāo)準(zhǔn)品種的譜帶(帶型)組成一致，則待檢測品種與標(biāo)準(zhǔn)品種為同一品種，得出待檢測的品種純度。所述SSR引物對標(biāo)準(zhǔn)茶樹品種能產(chǎn)生特異的譜帶，可從現(xiàn)有的茶樹SSR引物中選取。所述的標(biāo)準(zhǔn)品種為已知的茶樹無性系品種。所述CTAB緩沖液的組成為每IOOml水溶液中含有2g CTAB，pH 8. 0的IOml ImoI/L Tris-HCI, 4ml 0. 5mol/L EDTA, 28ml 5mol/L NaCl，Iml P -巰基乙醇。所述DNA提取液是由體積比為24 I的三氯甲烷和異戊醇配成的混合液。所述PCR擴增的擴增程序為先95°C變性3-5min，然后進行如下30-35個循環(huán)94°C變性 30-358，531、541、551、561、581或601復(fù)性30-358，721延伸 50s，最后 72°C延伸IOmin0所述茶樹品種為茶樹無性系品種，其中云南茶樹無性系品種主要有佛香I號、佛香2號、佛香3號、佛香4號、佛香5號、云茶I號、云茶春毫、云茶春韻、紫娟、云抗10號、云抗12號、云抗14號、云抗17號、云抗27號、云抗37號、云抗43號、云抗47號、云抗48號、云抗50號、73-11、76-38、云選9號、長葉白毫、73_8、云瑰、矮豐、云梅等共27個云南茶樹無性系品種。所述SSR引物由序列表中2對引物SSR12、SSR42組成。所述PCR擴增的擴增程序為先95°C變性3min，然后進行如下35個循環(huán)94°C變性 308，53°〇、541、551、561、581或601復(fù)性 30s，72。。延伸 50s，最后 72°C延伸 IOmin0本發(fā)明對常規(guī)SSR分子標(biāo)記技術(shù)的一些操作環(huán)節(jié)進行了改進和修改，修改后的實驗方法保留了 SSR標(biāo)記的特色和關(guān)鍵技術(shù)，簡化了實驗步驟，降低了技術(shù)含量，用于鑒定茶樹品種純度。該方法操作簡單，能夠在短時間對樣品進行快速鑒定。本發(fā)明的優(yōu)點I、針對SSR擴增對DNA質(zhì)量要求不高的特點，簡化了 DNA提取程序。與常規(guī)SSR分析相比，省略了 DNA純化和降解RNA等步驟，節(jié)約時間和試劑費用。2、常規(guī)SSR分析時一般采用測序膠，即變性聚丙烯酰胺凝膠。制膠技術(shù)要求高，電泳上樣前須對樣品DNA的PCR擴增產(chǎn)物進行變性處理，電泳緩沖液和電泳后膠板的染色與顯色試劑用量大。本發(fā)明采用10%非變性聚丙烯酰胺凝膠，制膠簡便。電泳前不需變性，操作簡單，膠量、電泳緩沖液和染色與顯色的試劑節(jié)約一半。3、一般的生物工程公司可提供擴增反應(yīng)液的試劑或擴增試劑盒。制膠和染色易掌握，圖譜清晰。由于基因組DNA中SSR的多態(tài)性豐富，遺傳性不受環(huán)境影響，其結(jié)果準(zhǔn)確。本發(fā)明的積極效果其積極的效果是建立穩(wěn)定可靠的茶樹無性系品種鑒別方法和檢驗技術(shù)規(guī)程，促進茶樹良種化進程健康發(fā)展，切實保護好茶樹新品種知識產(chǎn)權(quán)，保障茶葉產(chǎn)業(yè)健康、穩(wěn)定、可持續(xù)發(fā)展。
圖I為整個技術(shù)流程圖
圖2、圖3為部分待檢測茶樹品種和標(biāo)準(zhǔn)茶樹品種(佛香3號)的電泳圖譜。M 50bp分子量標(biāo)準(zhǔn)；1 :云抗10號；2 :佛香3號；3 :佛香I號；4 :紫娟；5 :待檢測品種-I ；6 :待檢測品種-2 ；7 :待檢測品種-3 ；8 :待檢測品種-4 ；9 :待檢測品種-5 ;箭頭所示為佛香3號的特異帶型。
具體實施例方式一、本發(fā)明所用的主要試劑配制Ulmol/L Tris-HCI(pH 8. 0)100ml 12. Ig Tris-HCI(三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽)，加去離子水至100ml，NaOH(氫氧化鈉)調(diào)pH 8. O。2,0. 5mol/L EDTA(pH 8. 0)100ml 18. 6g EDTA(乙二胺四乙酸二鈉)，2g NaOH，4°C保存?zhèn)溆谩?、5mol/L NaCl100ml 29. 2g NaCl (氯化鈉)，加去離子水至 100ml。4、CTAB 緩沖液100ml 2g CTAB，pH 8.0 的 IOml lmol/L Tris-HCI, 4ml 0. 5mol/L EDTA, 28ml5mol/L NaCl, Iml P -巰基乙醇。5、CTAB/NaCl 緩沖液100ml 10g CTAB，4. Ig NaCl，加去離子水溶解定容 100ml。6、DNA提取液(三氯甲烷異戊醇/24v Iv)100ml 4ml異戊醇溶于96ml三氯甲烷。7、3mol/L NaAc(pH5. 2)100ml 60ml H2O中加入40. 824g NaAc 3H20，溶解后，用冰醋酸調(diào)pH至5. 2，然后定溶100ml,滅菌。8、5 X TBE (Tris-硼酸)電泳緩沖液1000ml 54g Tris (三羥甲基氨基甲烷)，27. 5g 硼酸，20ml 0. 5mol/L EDTA (pH8. 0)，加去離子水至1000ml。
9、高鹽TE緩沖液500ml 100ml 5mol/L NaCl，5ml lmol/L Tris-HCI (pH 8.0),0. Iml 0. 5mol/LEDTA (pH 8.0)，加水定容 500ml，滅菌。10、70% 乙醇100ml 70ml 無水乙醇，加水 30ml 至 100ml。11、30%丙烯酰胺
100ml :29g丙烯酰胺，Ig N、N-二甲叉雙丙烯酰胺，37°C助溶，加去離子水定容至IOOml。12、6 X londing Buffer (上樣緩沖液)100ml :0. 25g溴酹藍(lán),0. 25g 二甲苯青F F, 40g鹿糖,加水溶解定容至IOOml。13、10%過硫酸銨IOml lg過硫酸銨，加去離子水至10ml。14、固定液(10%乙醇)500ml :50ml乙醇，2. 5ml乙酸，加去離子水至500ml。15、染色液(0. 2AgN03)500ml :0. Ig AgNO3 (硝酸銀)，加去離子水至 500ml。16、顯色液100ml 1. 5g NaOH, 500 U I 甲醛，加去離子水 100ml。二、鑒定茶樹品種純度的方法I、樣品選取采集待檢測茶樹無性系品種的一芽二葉鮮嫩芽葉，_20°C保存?zhèn)溆谩?、待檢測茶樹品種基因組DNA的提取I)將I. Og鮮嫩芽葉放入研缽中，加入液氮充分研磨，研磨至粉末狀，轉(zhuǎn)入I. 5ml離心管中，加入 0.6ml CTAB 提取液(2% CTAB,0. IM Tris,20mmol EDTA, I. 4M NaCl，pH 8.0)，震蕩混勻，然后轉(zhuǎn)入65°C水浴鍋保溫50min，期間不斷搖勻。2)隨后加入等體積(0.6ml)氯仿/異戊醇(24 I)，充分混勻。3)室溫下IOOOOrpm,離心IOmin,吸上清液(0. 4ml)于新的I. 5ml離心管中，加入1/10 體積 CTAB/NaCl (10% CTAB，0. 7M NaCl)，用等體積氯仿 / 異戊醇(24 I)抽提。4)室溫下IOOOOrpm,離心8min,吸上清液(0. 4ml)于新的I. 5ml離心管中，上清液中加入2/3體積的異丙醇,混勻后于_20°C放置lh, 5000rpm,離心5min,收集沉淀。5)加入 0. 4ml 高鹽緩沖液(IOmmol Tris, 0. Immol ETDA, IM NaCl, pH 8. 0)溶解沉淀，60°C水浴鍋保溫30min。然后IOOOOrpm,離心5min,去除不能溶解雜質(zhì),吸上清液(約0. 4ml)于新的I. 5ml離心管中(無沉淀屬正?，F(xiàn)象)。6)加入1/10體積NaAc (pH 5. 2)及2/3體積體積的異丙醇，混勻后于_20°C放置30min。然后5000rpm離心5min,倒掉上清液,收集沉淀。7)用70%的乙醇洗DNA沉淀3次，每次2min，將離心管倒置于吸水紙上，使DNA干燥，最后溶于300 u I超純水(ddH20)中，并加入2 u I RNase (4mg/ml)，恒溫箱37°C保溫30min，_20°C冰箱保存?zhèn)溆谩?、PCR 擴增
以步驟2提取的待檢測茶樹品種的基因組DNA為模板，用SSR引物進行PCR擴增。其中，PCR擴增體系如下擴增體積為lOiil，其成分為1.0iil 20-50ng/ u I templateDNA, 0. 4 u I 10 u mol/1 primer, I. O u I 10 X PCR buffer (Mg2++free) 0. 7 u I 25mmol/lMgCI2,0. 2 u I 10nmol/l dNTP, 0. I U I 5U/ U I Taq DNA polymerase, 6. 6 U I 滅菌 ddH20。PCR擴增程序先95°C變性3min，然后進行如下35個循環(huán)94°C變性30s，53°C、54°〇、551、561、581或601復(fù)性 30s，72。。延伸 50s，最后 72°C延伸 IOmin04、凝膠制備將配好10%非變性聚丙烯酰胺凝膠灌入事先做好的20X20cm的兩塊玻璃板的間隙中(Imm厚)，立即插入樣品梳，10-15min內(nèi)聚合，聚合后小心抽出樣品梳，并用洗瓶沖洗樣品膠孔。
5、凝膠電泳擴增產(chǎn)物加入I 上樣緩沖液，上樣電泳。電泳緩沖液為I150V，電泳2h 30min左右。6、凝膠銀染I)電泳完畢后,取下膠板,在500ml固定液中固定12-15min(可同時固定2-4塊膠)。2)去離子水漂洗2次，每次5min。3)0. 2%硝酸銀染色液染色12_15min (可同時染色2_4塊膠)。4)去離子水快速漂洗10-20s。5)放入預(yù)冷的500ml顯色液顯色，不斷搖動，至譜帶顯出(可同時顯色2_4塊膠)。6)終止反應(yīng)，用蒸餾水漂洗I次。7)把染色后的凝膠進行帶型分析或掃描紀(jì)錄，或放入5%的甘油溶液中浸泡30min左右制成干膠，室溫干燥后，進行帶型分析或掃描紀(jì)錄。7、鑒定將待檢測樣品的SSR擴增產(chǎn)物的電泳圖譜，與按照上述步驟I至6的方法獲得的標(biāo)準(zhǔn)茶樹品種的電泳圖譜相比較，根據(jù)待檢測茶樹品種樣品SSR擴增產(chǎn)物和標(biāo)準(zhǔn)茶樹品種SSR擴增產(chǎn)物的DNA譜帶的組成(帶型)的一致性，鑒定茶樹品種純度。本發(fā)明的方法對任一茶樹無性系品種有效，但SSR引物有別，下面以茶樹無性系品種佛香3號以及引物SSR12、SSR42為實用范例。實施例I、以佛香3號為標(biāo)準(zhǔn)茶樹品種鑒定茶樹品種純度。鑒定前對來源于云南省的27個品種(含佛香3號)進行了 SSR標(biāo)記的篩選，發(fā)現(xiàn)SSR引物SSR12、SSR42對佛香3號的基因組DNA可產(chǎn)生特異的譜帶，因此，用引物SSR12、SSR42對佛香3號供檢樣品的DNA進行分析。I、樣品選取從云南茶樹無性系品種中選取待檢測品種佛香3號及其他4個待檢測品種(對照)，為檢驗鑒定效果，再摻入云抗10號、佛香I號、紫娟等茶樹品種，采集待檢測茶樹無性系品種的一芽二葉鮮嫩芽葉，_20°C保存?zhèn)溆谩?、茶樹品種基因組DNA的提取I)將I. Og鮮嫩芽葉放入研缽中，加入液氮充分研磨，研磨至粉末狀，轉(zhuǎn)入I. 5ml離心管中，加入 0.6ml CTAB 提取液(2% CTAB,0. IM Tris,20mmol EDTA, I. 4M NaCl，pH 8.0)，震蕩混勻，然后轉(zhuǎn)入65°C水浴鍋保溫50min，期間不斷搖勻。2)隨后加入等體積(0.6ml)氯仿/異戊醇(24 I)，充分混勻。3)室溫下IOOOOrpm,離心IOmin,吸上清液(0. 4ml)于新的I. 5ml離心管中，加入1/10 體積 CTAB/NaCl (10% CTAB，0. 7M NaCl)，用等體積氯仿 / 異戊醇(24 I)抽提。4)室溫下IOOOOrpm,離心8min,吸上清液(0. 4ml)于新的I. 5ml離心管中，上清液中加入2/3體積的異丙醇,混勻后于_20°C放置lh, 5000rpm,離心5min,收集沉淀。5)加入 0. 4ml 高鹽緩沖液(IOmmol Tris, 0. Immol ETDA, IM NaCl, pH 8. 0)溶解沉淀，60°C水浴鍋保溫30min。然后IOOOOrpm,離心5min,去除不能溶解雜質(zhì),吸上清液(約0. 4ml)于新的I. 5ml離心管中(無沉淀屬正?，F(xiàn)象)。 6)加入1/10體積NaAc (pH 5. 2)及2/3體積體積的異丙醇，混勻后于_20°C放置30min。然后5000rpm離心5min,倒掉上清液,收集沉淀。7)用70%的乙醇洗DNA沉淀3次，每次2min，將離心管倒置于吸水紙上，使DNA干燥，最后溶于300 u I超純水(ddH20)中，并加入2 u I RNase (4mg/ml)，恒溫箱37°C保溫30min，_20°C冰箱保存?zhèn)溆谩?、SSR引物的PCR擴增以步驟2提取的待檢測茶樹品種的基因組DNA為模板，用SSR引物進行PCR擴增。其中，PCR擴增體系如下擴增體積為lOiil，其成分為1.0iil 20-50ng/ u I templateDNA, 0. 4 u I 10 u mol/1 primer, I. O u I IOXPCR buffer (Mg2++free) 0. 7 u I 25mmol/lMgCI2,0. 2 u I 10nmol/l dNTP, 0. I u I 5U/ u I Taq DNA polymerase, 6. 6 u I 滅菌 ddH20。PCR擴增程序先95°C變性3min，然后進行如下35個循環(huán)94°C變性30s，53°C、54°〇、551、561、581或601復(fù)性 30s，72。。延伸 50s，最后 72°C延伸 IOmin04、凝膠制備將配好10%非變性聚丙烯酰胺凝膠灌入事先做好的20X20cm的兩塊玻璃板的間隙中(Imm厚)，立即插入樣品梳，10-15min內(nèi)聚合，聚合后小心抽出樣品梳，并用洗瓶沖洗樣品膠孔。5、凝膠電泳擴增產(chǎn)物加入I U I上樣緩沖液,上樣電泳。電泳緩沖液為I父18￡，恒壓電壓150V，電泳2h 30min左右。6、凝膠銀染I)電泳完畢后，取下膠板，在500ml固定液中固定12-15min(可同時固定2-4塊膠)。2)去離子水漂洗2次，每次5min。3)0. 2%硝酸銀染色液染色12-15min (可同時染色2_4塊膠)。4)去離子水快速漂洗10-20s。5)放入預(yù)冷的500ml顯色液顯色，不斷搖動，至譜帶顯出(可同時顯色2_4塊膠)。6)終止反應(yīng)，用蒸餾水漂洗I次。7)把染色后的凝膠進行帶型分析或掃描紀(jì)錄，或放入5%的甘油溶液中浸泡30min左右制成干膠，室溫干燥后，進行帶型分析或掃描紀(jì)錄。
7、鑒定將待檢測樣品的SSR擴增產(chǎn)物的電泳圖譜，與按照上述步驟I至6的方法獲得的標(biāo)準(zhǔn)茶樹品種的電泳圖譜相比較，根據(jù)待檢測茶樹品種樣SSR擴增產(chǎn)物和標(biāo)準(zhǔn)茶樹品種SSR擴增產(chǎn)物的DNA譜帶的組成(帶型)的一致性，鑒定茶樹品種純度。結(jié)果表明，5個待檢測品種中只有待檢測品種-I的SSR圖譜帶型與佛香3號相同，其他品種與佛香3號和待檢測品種-I帶型有差異，與預(yù)選摻雜的情況相符，說明待檢測品種-I是佛香3號，其他4個待檢測品種則不是佛香3號。部分待檢測品種和標(biāo)準(zhǔn)品種佛香3號的電泳圖譜如圖2、圖3 所不，圖中，M 50bp分子量標(biāo)準(zhǔn)；1 :云抗10號；2 :佛香3號；3 :佛香I號；4 :紫娟；5 :待檢測品種_1 ；6 :待檢測品種-2 ；7 :待檢測品種-3 ；8 :待檢測品種-4 ；9 :待檢測品種-5 ;箭頭所示為佛香3號的特異帶型。
權(quán)利要求
1.一種鑒定茶樹無性系品種的分子標(biāo)記方法，包括以下步驟 1)按照如下方法提取待檢測茶樹品種的基因組DNA:將待檢測品種的I. Og鮮嫩芽葉放入研缽中，加入液氮充分研磨至粉末狀，加入CTAB緩沖液，65°C水浴30-60分鐘，再加入DNA提取液，提取得到待檢測茶樹品種的基因組DNA。
2)按照如下方法對待檢測茶樹品種進行PCR擴增以步驟I)提取的基因組DNA為模板，用SSR引物進行PCR擴增，將所得到的PCR擴增產(chǎn)物進行10%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，得到待檢測茶樹品種的電泳圖譜。
3)將待檢測茶樹品種的電泳圖譜與按照所述步驟I)和2)的方法得到的標(biāo)準(zhǔn)茶樹品種的電泳圖譜進行比較，如待檢測品種與標(biāo)準(zhǔn)品種的譜帶(帶型)組成一致，則待檢測品種與標(biāo)準(zhǔn)品種為同一品種，得出待檢測的品種純度。
2.根據(jù)權(quán)力要求I所述的方法，其特征在于所述SSR引物對標(biāo)準(zhǔn)茶樹品種能產(chǎn)生特異的譜帶。
3.根據(jù)權(quán)力要求I所述的方法，其特征在于所述CTAB緩沖液的組成為每IOOml水溶液中含有 2g CTAB，pH 8.0 的 IOml lmol/L Tris_HCI，4ml 0. 5mol/L EDTA, 28ml 5mol/LNaCl，lmiP-巰基乙醇。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述DNA提取液是由體積比為24 I的三氯甲烷和異戊醇配成的混合液。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述PCR擴增的擴增程序為先95°C變性3-5min，然后進行如下 30-35 個循環(huán)94°C變性 30_35s，53°C、54°C、55°C、56°C、58°C或 60°C復(fù)性 30-35s，72°C延伸 50s，最后 72°C延伸 IOmin0
6.根據(jù)權(quán)利要求I至5中任一所述的方法，其特征在于所述茶樹品種為茶樹無性系品種，其中云南茶樹無性系品種主要有佛香I號、佛香2號、佛香3號、佛香4號、佛香5號、云茶I號、云茶春毫、云茶春韻、紫娟、云抗10號、云抗12號、云抗14號、云抗17號、云抗27號、云抗37號、云抗43號、云抗47號、云抗48號、云抗50號、73-11、76-38、云選9號、長葉白毫、73-8、云瑰、矮豐、云梅等共27個云南茶樹無性系品種。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述SSR引物為由序列表中的2對引物SSRl2 和 SSR42 組成。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述PCR擴增的擴增程序為先95°C變性3min，然后進行如下35個循環(huán)94°C變性30s，53°C、54°C、55°C、56°C、58°C或60°C復(fù)性30s，72。。延伸 50s，最后 72°C延伸 IOmin0
9.根據(jù)權(quán)利要求I至5中任一所述的方法，其特征在于所述步驟2)中將所得到的PCR擴增產(chǎn)物進行10 %非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。
10.根據(jù)權(quán)利要求I至5中任一所述的方法，其特征在于所述步驟I)中水浴時間為50分鐘。
全文摘要
本發(fā)明提供一種鑒定茶樹無性系品種的分子標(biāo)記方法，屬生物技術(shù)領(lǐng)域。包括以下步驟將待測品種的1.0g鮮嫩芽葉放入研缽，加入液氮研磨至粉末狀，加入CTAB緩沖液，1)65℃水浴30-60分鐘，再加入DNA提取液，得到待測茶樹品種的基因組DNA；2)以步驟1)提取的基因組DNA為模板，用SSR引物進行PCR擴增，將擴增產(chǎn)物進行10％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，得到待測品種的電泳圖譜；3)將待測品種的電泳圖譜與按照所述步驟1)和2)的方法得到的標(biāo)準(zhǔn)茶樹品種的電泳圖譜進行比較，如待檢品種與標(biāo)準(zhǔn)品種的譜帶組成一致，則待測品種與標(biāo)準(zhǔn)品種為同一品種，得出待測品種純度。本發(fā)明與其他方法相比，更能真實反映茶樹品種的遺傳背景和親緣關(guān)系。該技術(shù)可作為鑒定茶樹品種真?zhèn)蔚目茖W(xué)依據(jù)。
文檔編號C12Q1/68GK102776271SQ20111012326
公開日2012年11月14日 申請日期2011年5月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月13日
發(fā)明者劉本英, 孫雪梅, 李友勇, 汪云剛 申請人:劉本英