一種豬鏈球菌2型雙基因缺失活疫苗及應用的制作方法

專利名稱：一種豬鏈球菌2型雙基因缺失活疫苗及應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于動物基因工程技術領域。涉及基因疫苗技術領域，本發明具體涉及一個豬鏈球菌2型雙基因缺失疫苗株的構建，疫苗制備及應用。
背景技術：
豬鏈球菌2型(Streptococcus suis Serotype 2,簡稱SS2)引起的豬鏈球菌病是一種重要的人畜共患傳染病，該病廣泛分布于世界各養豬國家，不僅給養豬業造成了巨大的經濟損失，同時給人類的健康也造成了極大的威脅(Lun ZR, et al. Streptococcussuis an emerging zoonoticpathogen. Lancet Infect Dis, 2007, 7 :201-209)。在我國，由豬鏈球菌2型引起的豬鏈球菌病也廣泛存在，并且近幾年有逐漸增多的趨勢，目前在我國已成為分布最廣、危害最嚴重的一種豬鏈球菌病。1998年，我國江蘇南通地區發生的豬鏈球菌2型引起的鏈球菌病造成25人感染，14人死亡(姚火春等.豬鏈球菌1998分離株病原 特性鑒定.南京農業大學學報，1999，02 :67-70)。2005年7、8月間，我國四川資陽地區發生的豬鏈球菌2型引起的鏈球菌病導致215人感染,38人死亡(Tang J, et al. Streptococcaltoxic shock syndrome caused by Streptococcus suisserotype 2. PLoS Med,2006,3 668-676)，不僅給我國的養豬業造成巨大沖擊，而且給公共衛生帶來嚴重威脅，同時給人們的心理也造成了巨大的壓力。豬鏈球菌病的防治主要通過疫苗接種與抗生素的使用，但抗生素的長期使用會導致抗藥性菌株的出現，從而影響防治的效果，此外還會引起藥物殘留及食品安全等方面的問題。同時對于傳染病來講，預防比治療更為重要、更為有效，也更加經濟。目前臨床上主要通過滅活疫苗來進行免疫預防(何孔旺等.豬鏈球菌疫苗研究進展.獸醫導刊，2009,08 :21-22)，但滅活疫苗對豬只難以提供完全的保護，并且生產成本高，副作用大，嚴重影響了其發展應用(HOLT ME, et al. Immunization of pigs with killed cultures ofStreptococcus suis type 2. Res VetSci 1990,48:23—27 ；Quessy S,et al. Immunizationof mice against Streptococcus suis type 2infection using a live avirulentstrain. Can J Vet Res，1994，58 :299-301)。隨著豬鏈球菌病流行的日益嚴重，針對豬鏈球菌尤其是影響與危害最大的豬鏈球菌2型，開展新型、安全、有效的疫苗研究成為當務之急O細菌的致病過程是細菌與宿主細胞相互作用的復雜過程，需要多種毒力因子的協調作用。在此過程中，致病菌依靠復雜而精密的信號系統來感受、傳導和響應外界環境的變化，進而調節相應的基因表達模式以做出適應性反應，包括下調非必需基因的表達，上調表達在宿主體內存活和致病過程中起關鍵作用的基因(徐建國.分子醫學細菌學，科學出版社.2000,179-196.)。當病原菌入侵宿主體內時，環境中各種營養物質的含量、溫度、滲透壓和pH值等都發生了改變；另外，一些毒性物質也出現在其生存的環境中(Smith H E，et al. Environmentally regulated genes of Streptococcus suis !identification bythe use of iron—restrictedconditions in vitro and by experimental infectionof piglets. Microbiology, 2001, 147 :271-280 ；Huang YT, et al. Streptococcus suisinfection. J Microbiology, Immunology and Infection, 2005, 58 :306-313)。環境因素的改變必然會對病原菌的生存產生巨大的壓力，而病原菌為了及時正確地捕捉環境中各種理化因素的變化，并據此迅速調節自身的結構和生理行為，達到適應新環境和生存繁殖的目的，就必須有一套特有的對外部環境持續監控的信號系統。目前認為二元信號轉導系統(TCS)和密度感應(quorum sensing)系統起著主要的作用。二元信號轉導系統是在細菌中普遍存在的一種跨膜信號轉導系統，它在細菌感受外界環境變化并做出適應性反應的過程中起著非常重要的作用(Alexander Y, et al. Signal integration inbacterial two-componentregulatory systems. Genes, 2008, 5 :2601-2611)。最簡單的TCS由兩種蛋白質成分組成,其一為組氨酸激酶(histidine kinase, HK),通常位于細胞膜上，其功能是識別并翻譯外界的環境信號；另一為位于胞漿內的反應調控因子(response regulator, RR)，主要功能是調節某些基因的表達或改變細菌的某種局部運動形式以響應夕卜界信號(Ba-Thein ff, et al. The virR/virS locusregulates the transcriptionof genes encoding extracellular toxin production in Clostridiumperfringens. JBacteriol, 1996，178 :2514-2520)。豬鏈球菌2型二元信號轉導系統Salk/SalR是豬鏈球菌2型強毒株05ZYH33潛在的89K毒力島上的一對二元信號轉導系統，其與介導細菌分泌的salivaricin( 一種細菌素)有關(Tang J, et al. Streptococcal toxic shock syndromecaused byStreptococcus suis serotype 2. PLoS Med, 2006, 3 :668-676)。華中農業大學農業微生物學國家重點實驗室譚臣博士(譚臣，豬鏈球菌2型Ecel的致病性及6PGD蛋白的免疫原性研究，中國知網，2010, http://epub. cnki. net/grid2008/detail. aspx QueryID = 3&CurRec = I)已經成功的構建了豬鏈球菌 2 型AEcel單基因缺失菌株，各種生物學實驗數據表明其毒力下降明顯，但仍有一定的殘余毒力，為了獲得安全性更高的豬鏈球菌2型雙基因缺失突變株，申請人以豬鏈球菌2型AEcel單基因缺失菌株為親本菌株，采用同源重組的方法缺失Salk/R基因，獲得豬鏈球菌2型Λ Ecel/Λ Salk/R雙基因缺失菌株，生物學實驗證實所獲得的豬鏈球菌2型AEcel/Λ Salk/R雙基因缺失菌株遺傳性能穩定、安全性高、免疫原性良好。進一步研制成豬鏈球菌2型Λ Ecel/Δ Salk/R雙基因缺失活疫苗，并對其安全性、免疫劑量、接種途徑和免疫原性進行了評價，各項評價結果顯示該豬鏈球菌2型Λ Ecel/ Λ Salk/R雙基因缺失活疫苗可以作為一種防治豬鏈球菌病的良好疫苗。

發明內容
本發明的第一個目的是在豬鏈球菌2型AEcel單基因缺失菌株的基礎上進一步缺失Salk/R基因，獲得安全性高、免疫原性好的豬鏈球菌2型Λ Ecel/ Λ Salk/R雙基因缺失菌株。本發明的第二個目的是利用構建的豬鏈球菌2型Λ Ecel/Λ Salk/R雙基因缺失菌株制備成豬鏈球菌2型雙基因缺失活疫苗。本發明的第三個目的是該豬鏈球菌2型雙基因缺失活疫苗的應用。本發明通過以下技術方案實施涉及本發明的核心生物材料的豬鏈球菌2型Λ Ecel/Δ Salk/R菌株(Streptococcussuis II ΔEcel/Δ Salk/R)是申請人自行構建的，申請人將該雙基因缺失菌株命名為豬鏈球菌II型(Streptococcus suis II) Δ Ecel/Δ Salk/R,將該菌株于2010年12月21日送交湖北省武漢市武漢大學內的中國典型培養物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏編號為 CCTCC NO M 2010360。本發明的雙基因缺失突變體的構建方法是設計引物擴增Salk/R基因的上下游同源臂，將其連接到自殺性質粒pSET4s (Daisuke T et al. Construction andcharacterization ofStreptococcus suis—Escherichia coli shuttle cloningvectors. Plasmid, 2001,45 :101-113)上構建重組穿梭質 粒，再將重組質粒電轉化到豬鏈球菌2型AEcel單基因缺失菌株中，利用溫度與抗性進行篩選，獲得一種豬鏈球菌2型Δ Ecel/Δ Salk/R雙基因缺失菌株。本發明的主要優點是本發明是在豬鏈球菌2型Ecel單基因缺失菌株的基礎上構建的豬鏈球菌2型Δ Ecel/Δ Salk/R雙基因缺失菌株，Salk/R基因缺失后其毒力大幅度下降，安全性高，不存在毒力返強的風險，免疫原性高，能夠保護免疫豬抵抗豬鏈球菌2型強毒菌株(地方分離株SC19)的攻擊，且制作工藝簡單，成本低，為有效控制我國豬鏈球菌病的發生與流行提供了有用的工具。為深入評價用該豬鏈球菌2型Λ Ecel/△ Salk/R雙基因缺失菌株制備的豬鏈球菌2型雙基因缺失活疫苗在預防豬鏈球菌2型的感染中的應用，用制備的豬鏈球菌2型雙基因缺失活疫苗在試驗動物35-42日齡仔豬上進行了安全性評價和免疫效果的評價。


序列表SEQ ID NO 1是缺失基因Ecel的核苷酸序列(GenBank登錄號GeneID 5099191)。序列表SEQ ID NO 2是缺失基因Salk/R的核苷酸序列(即Salk與SalR為雙組份信號轉導系統兩個元件，其GenBank登錄號GeneID :5099618和GeneID =5100603)。圖I :溫敏型自殺性質粒PSET4S- Δ Salk/R的構建流程圖。圖2 :溫敏型自殺性質粒pSET4s_ASalk/R的酶切鑒定結果。圖中 Ml 為 DNA marker (DL 15000) ;M2 為 DNA marker (DL 2000) ;1，2 為 Hind III和 EcoR I 雙酶切 pSET4s- Δ Salk/R。圖3 :豬鏈球菌2型Λ Ecel/Λ Salk/R雙基因缺失菌株的PCR鑒定結果。圖中標記M1:DNA marker (DL 15000) ；M2 DNA marker (DL 2000) ;1_4，用 p5/p6引物進行擴增；5-8，用p7/p8引物進行擴增；9-12，用pl/p2引物進行擴增；13_16，用p3/口4引物進行擴增；1，5，9，13:模板為332強毒菌株(豬鏈球菌2型地方分離株SC19) ;2，6，10，14 :模板為豬鏈球菌2型AEcel單基因缺失菌株；3，7，11，15 :模板為豬鏈球菌2型ΔEcel/Δ Salk/R雙基因缺失菌株;4，8，12，16 :空白對照。圖4 :豬鏈球菌2型Λ Ecel/Λ Salk/R雙基因缺失菌株在體外傳代的遺傳穩定性檢測結果。圖中標記Ml 為 DNA marker (DL 15000) ;M2 為 DNA marker (DL 2000) ;1_15 為引物pl/p2擴增豬鏈球菌2型Λ Ecel/ Λ Salk/R雙基因缺失菌株1_15代菌。
圖5:豬鏈球菌2型Λ Ecel/Λ Salk/R雙基因缺失菌株、豬鏈球菌2型AEcel單基因缺失菌株與SS2地方分離株SC19的生長曲線。圖6:豬鏈球菌2型Λ Ecel/Λ Salk/R雙基因缺失菌株、豬鏈球菌2型AEcel單基因缺失菌株與SS2地方分離株SC19對!fep2細胞的黏附比率。圖7:豬鏈球菌2型Λ Ecel/Λ Salk/R雙基因缺失菌株、豬鏈球菌2型AEcel單基因缺失菌株與SS2地方分離株SC19對!fep2細胞的毒性比率圖8 :豬鏈球菌2型Λ Ecel/Λ Salk/R雙基因缺失菌株免疫豬后的抗體水平。圖9 :豬鏈球菌2型Λ Ecel/ Λ Salk/R雙基因缺失菌株免疫后強毒攻擊豬只 存活情況。圖10 :是豬鏈球菌2型Λ Ecel/Λ Salk/R雙基因缺失菌株免疫后強毒攻擊豬只的體溫變化。表I :豬鏈球菌2型Λ Ecel/ Λ Salk/R雙基因缺失菌株免疫后SS2強毒菌株(豬鏈球菌2型地方分離株SC19)攻擊豬只后各組織帶菌量檢測結果。
具體實施例方式實施例I以下結合說明書附圖對本發明作進一步的說明，但不限制本發明的保護范圍。一、引物設計(用于基因克隆和分子檢測)根據GenBank上公布的豬鏈球菌2型05ZYH33株全基因組GB | CP000407. 11 (ChenC, et al. A glimpse of streptococcal toxic shock syndrome from comparativegenomics of S. suis 2 Chineseisolates. PLoS ONE, 2007, 2 :312-315)設計引物 pSul/pSu2和pSdl/pSd2 (序列見后所述)，從豬鏈球菌2型野生菌(地方分離株)SC19 (該菌株2005年5月分離自四川省豬鏈球菌病中的一頭病豬，為強毒株，具有MRP+EF+SLY+表型；參見文獻 Li ff, Liu L, Qiu D, Chen H and Zhou R. Identification of Streptococcus suisserotype 2 genes preferential expressed in the natural host. Int JMed Microb,2010,300 =482-488)基因組中分別擴增Salk/R基因的上游同源臂Salk/R-up (序列長度為996bp)和下游同源臂Salk/R_down(序列長度為986bp)。同時設計位于Salk/R基因兩側的引物對pl/p2和位于Salk/R基因內部的引物對p3/p4，用于篩選鑒定雙基因缺失突變株。根據譚臣(譚臣，豬鏈球菌2型Ecel的致病性及6P⑶蛋白的免疫原性研究，中國知網，2010,博士論文；http://epub. cnki. net/grid2008/detail. aspx QueryID =3&CurRec = I)報道的Ecel基因的鑒定引物序列合成引物對p5/p6和p7/p8用于PCR擴增鑒定豬鏈球菌2型Ecel基因是否缺失，反應條件為94°C預變性IOmin ；94°C lmin,55°C lmin, 72°C 2. 5min，30個循環后，72°C延伸IOmin0 PCR產物經0. 8 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測，若是豬鏈球菌2型AEcel缺失突變株，則引物對p5/p6擴增應得到一條479bp的DNA片斷，若是SS2地方分離株SC19，則得到一條2309bp的DNA片斷。另一對引物p7/p8擴增的目的片段位于Ecel基因的內部，豬鏈球菌2型△ Ecel突變株擴增應為陰性，野生菌株可以擴增到776bp的片段。上述引物均由南京金斯瑞有限公司合成。引物的核苷酸序列如下pSul 5/ —CGCAAGCTTGTAGGAACAATCTATACAGAGGC—3' HindIII 酶切位點
pSu2:5' —CGCGGATCCTTACCCTTTTTACTCATGATTTT—3' BamHI 酶切位點pSdl 5/ --CGCGGATCCGCTGAGCGATATAGATATTAACG—3' BamHI 酶切位點pSd2 5/ —CGCGAATTCATAAGAGAACCTATTTAGCTCCC—3' EcoRI 酶切位點PI : 5' —TGTGCCAAAAACGCTCTATC—3' p2 5/ —CAAACTCCGCTCCCCTAAG—3'p3 5/ --ACAAAGATAAGCCTTTTAGCAAT—3'p4 5/ --TAGACAATCCAAGCGTATCAGTT—3'p5 5/ —GAATTACTTTGTTTGGGAATG—3' p6 5/ --GTTATGACTGGTTAAATAC—3'p7 5/ --ACGTTACTCAAGATATAAAAGACAG—3'p8 5/ —GATTTTAACAACCAATGTATCTAGT—3'二、pSET4s-SalK/R重組轉移質粒的構建(見圖I所示)用引物對pSul/pSu2和pSdl/pSd2從SS2地方分離株SC19基因組中擴增Salk/R基因上下游同源臂Salk/R-up (996bp)和Salk/R-down (986bp)，反應程序為94°C預變性IOmin ；94°C lmin, 55°C lmin, 72°C lmin30sec，35 個循環，最后 72°C延伸 lOmin。用 O. 8%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結果。純化回收目的片段，純化的Salk/R基因上游同源臂擴增產物用HindIII和BamHI雙酶切后直接連接到質粒pSET4s (日本國立動物衛生研究所的Daisuke Takamatsu博士惠贈)的HindIII和BamHI位點，獲得的重組質粒pSET4s_SU,經HindIII和BamHI酶切證實構建正確。隨后將純化的Salk/R基因下游同源臂擴增產物用BamHI和EcoRI雙酶切后連接到所構建的質粒pSET4s_SU的BamHI和EcoRI位點，經HindIII和EcoRI雙酶切證實構建正確，測序證實無堿基誤配，將獲得的質粒命名為pSET4s-Salk/R(見圖2)。質粒的重組、制備、酶切分析均按常規方法進行(J.薩姆布魯克，EF弗里奇，T曼尼阿蒂斯著，黃培堂，王嘉璽等譯，分子克隆實驗指南(第三版)，科學出版社，2002 年)。三、豬鏈球菌2型Λ Ecel/ Λ Salk/R雙基因缺失菌株的篩選與鑒定參照Daisuke Takamatsu 博士報道的方法(Daisuke T et al, Constructionand characterizationof Streptococcus suis—Escherichia coli shuttle cloningvectors. Plasmid, 2001,45 :101-113)，將獲得的自殺性重組轉移質粒 pSET4s_Salk/R 在電轉化參數2. 5KV/cm, 500 Ω和25 μ F的條件下電轉化至豬鏈球菌2型AEcel單基因缺失菌株制成的電轉化感受態細胞中，電轉化后涂100μ g/ml壯觀霉素抗性平皿置28°C下培養，長出單菌落后再置37°C下培養。在此過程中，重組轉移質粒pSET4s-Salk/R與豬鏈球菌2型AEcel單基因缺失菌株基因組發生一次同源重組獲得單交換，單交換鑒定正確后我們把單交換進行傳代來篩選突變株，其會發生第二次同源重組從而獲得雙基因缺失突變體。第二次同源重組有可能產生兩種不同的菌株一種是產生所需要的豬鏈球菌2型Δ Ecel Δ Salk/R雙基因缺失突變株；另一種是產生回復的親本菌株。申請人:通過PCR方法海量篩選豬鏈球菌2型Λ Ecel Λ Salk/R雙基因缺失菌株。挑取各代單交換培養出來的單克隆同時接種無抗性與壯觀霉素抗性的TSA平皿進行培養，然后挑取在壯觀霉素抗性條件下無法生長而在無抗性平皿上生長良好的的單菌落于3ml含10%新生牛血清的TSB液體培養基(購自美國BD公司)中37°C振蕩培養后用作模板，利用引物對pl/p2和p3/p4進行PCR擴增，反應條件為94°C預變性IOmin ;94°C lmin,55°C lmin,72°C 2min30sec，30個循環，最后72°C延伸lOmin。PCR產物經O. 8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，若是豬鏈球菌2型AEcel Δ Salk/R雙基因缺失菌株，則引物對pl/p2擴增應得到一條500bp的DNA片斷，若是回復成親本菌株，則得到一條2268bp的DNA片斷。另一對引物P3/P4擴增的目的片段位于缺失基因的內部，對豬鏈球菌2型Λ Ecel/Λ Salk/R雙基因缺失菌株擴增應為陰性，豬鏈球菌2型地方分離株SC19和豬鏈球菌2型AEcel單基因缺失菌株則可獲得117bp的片段。通過PCR擴增篩選到突變株后再用引物對pl/p2進行擴增，并將擴增的片段進行測序分析，結果證實豬鏈球菌2型△ Ecel/ △ Salk/R雙基因缺失突變株構建成功。四、豬鏈球菌2型Λ Ecel/Λ Salk/R雙基因缺失菌株生物學特性分析4. I遺傳穩定性分析將豬鏈球菌2型AEcel/ASalk/R雙基因缺失菌株于含有10%新生牛血清的 TSA (TrypticSoy Agar購至美國BD公司)平皿上連續傳代,一共傳15代,每一代挑取單菌落于3ml含10%的新生牛血清的TSB液體培養基中37°C振蕩培養，用引物pl/p2對每一代細菌進行PCR擴增，結果均只能獲得500bp的片段(圖4)，說明豬鏈球菌2型AEcel/Δ Salk/R雙基因缺失菌株在體外培養基中連傳15代是穩定的。4. 2生長特性將豬鏈球菌2型地方分離菌株SC19、豬鏈球菌2型Λ Ecel單基因缺失菌株和本發明的豬鏈球菌2型Λ Ecel/ Λ Salk/R雙基因缺失菌株分別接種于5ml含有10%新生牛血清(購自杭州四季青材料有限公司)的TSB培養基(Tryptic Soy Broth購自美國BD公司)中培養，并于培養后每間隔一小時分別取100 μ L菌液測定0D600值，繪制生長曲線(附圖5)。結果顯示豬鏈球菌2型Λ Ecel/Λ Salk/R雙基因缺失菌株、豬鏈球菌2型AEcel單基因缺失菌株和豬鏈球菌2型地方分離株SC19的生長曲線無顯著差異，表明Ecel和Salk/R兩個基因的缺失并不影響豬鏈球菌2型Λ Ecel/Λ Salk/R雙基因缺失菌株的生長。4. 3細胞黏附實驗細菌黏附細胞是細菌感染細胞引起致病的第一步也是關鍵性的一步，細菌黏附細胞的能力與其毒力直接相關。細胞侵入實驗主要參考Charland和Gottschalk(2000)所報道的方法來進行(Charland N, et al. Streptococcus suis serotype 2 interactionswith human brainmicrovascular endothelial cells. Infect Immunity, 2000,68 :637-643 ；Segura M et al. Streptococcussuis interactions with the murinemacrophage cell line J774 adhesion and cytotoxicity. Infectlmmunity，2002，70 4312-4322)，具體操作是取Iml生長到指數生長期的豬鏈球菌2型地方分離株SC19、豬鏈球菌2型AEcel單基因缺失菌株和豬鏈球菌2型Λ Ecel/Λ Salk/R雙基因缺失菌株經6000rpm離心5min收集細菌、用磷酸鹽緩沖溶液PBS(配方NaCl 137mmol/L, KCl2. 7mmol/L, Na2HPO4 4. 3mmol/L, KH2PO4 I. 4mmol/L)洗滌后，重懸于不含抗生素的細胞培養基DMEM(購自Gibco 公司)中，稀釋后按IOm. ο. i.的感染復數接種到H印2細胞(購自中國典型培養物保藏中心)已長成單層的24孔細胞培養板中。然后將細胞板于800g離心IOmin,以加強細菌與單層細胞表面的接觸。之后，將細胞板于37°C，5% C02培養箱中培養2h，使細菌侵入細胞。用磷酸鹽緩沖溶液PBS洗細胞單層3次，然后在每個孔加入Iml含有100 μ g ml-ι慶大霉素和5yg πιΓ1青霉素G的DMEM細胞培養基中，于37°C含5% CO2的培養箱中培養2h以將細胞外的和黏附于細胞表面的細菌殺死。然后用磷酸鹽緩沖溶液PBS洗細胞單層3次，隨后加入500ul的去離子水以破壞細胞膜，并用移液器反復吹打。每孔各取IOOul細菌懸液涂布TSA平板，在37°C，5% CO2培養箱中溫育過夜，觀察菌落的形成情況，并計算出細菌C. f.u.。侵入效率以細菌的c. f.u.來表示。實驗結果表明，本發明的豬鏈球菌2型Λ Ecel/Λ Salk/R雙基因缺失菌株和豬鏈球菌2型Λ Ecel單基因缺失菌株與豬鏈球菌2型地方分離株SC19相比黏附!fep2細胞的能力顯著減弱，但豬鏈球菌2型AEcel/Δ Salk/R雙基因缺失菌株與豬鏈球菌2型Λ Ecel單基因缺失菌株對Ifep2細胞的黏附能力無顯著差異(圖6)。4. 4細胞毒性實驗細菌對細胞的毒性往往是破壞宿主正常細胞結構的重要的一環，本實驗參考Charland 和 Gottschalk(2000)報道的方法(Charland N, et al. Streptococcus suis serotype 2 interactions withhuman brain microvascular endothelial cells. InfectImmunity, 2000,68 :637-643),通過檢測胞內乳酸脫氧酶(lactate dehydrogenase, LDH)向外釋放的量來評價細菌對細胞的毒性。具體操作按試劑盒說明書(細胞毒性檢測試劑盒為Promega公司產品)進行分別離心收集對數生長期的豬鏈球菌2型地方分離菌株SC19、豬鏈球菌2型AEcel單基因缺失菌株和豬鏈球菌2型Λ Ecel/Λ Salk/R雙基因缺失菌株(約3 X IO8個細菌)，磷酸緩沖液PBS洗滌后，分別懸浮于Iml不含血清和抗生素的DMEM中，并用無血清和抗生素的DMEM進行適當的稀釋，將細菌懸液加入H印2細胞已長至單層的96孔細胞板中，使細菌的感染復數為每細胞IOm. ο. i.，各作4個重復。同時設置效應細胞自發乳酸脫氫酶(LDH)釋放對照、靶細胞自發LDH釋放對照、靶細胞最大LDH釋放對照、體積校正對照、培養基背景對照。細胞培養板在37°C ,5%C02培養箱中培養4h，收集上清前45min向革巴細胞最大LDH釋放對照孔加入5 μ L細胞裂解液(Lysis solution)。280g離心5min,用排槍轉移50 μ L上清到一塊新的96孔細胞培養板中，每孔加入50 μ L配制好的底物，避光室溫孵育30min,再加入50 μ L終止液(stopsolution),在OD值490nm下測量吸光值,按計算公式％細胞毒性=[(實驗-效應細胞自發-靶細胞自發)/(靶細胞最大-靶細胞自發)]X 100計算不同菌株對H印2細胞的毒性。結果顯示豬鏈球菌2型ΛEcel/Λ Salk/R雙基因缺失菌株和豬鏈球菌2型AEcel單基因缺失菌株對Ifep2細胞的毒性均顯著低于豬鏈球菌2型地方分離株SC19，但兩個突變體對!fep2細胞的毒性無顯著差異(圖7)。五、豬鏈球菌2型Λ Ecel/ Λ Salk/R雙基因缺失疫苗的制備將鑒定正確、生長特性正常、遺傳穩定，并具有良好生物學活性的豬鏈球菌2型Λ Ecel/Λ Salk/R雙基因缺失菌株以與TSB培養基按照體積比為I : 100的量接種到加有10%新生牛血清(購自杭州四季青材料有限公司)的TSB培養基中培養過夜，5000rpm離心5min收集菌體,用生理鹽水懸浮菌體后再5000rpm離心5min收集菌體,生理鹽水懸浮后，按菌液明膠保護劑為7 I的體積比加入明膠保護劑，充分混勻后按2. OmL/瓶分裝于滅菌青霉素瓶中，置冷凍干燥機中凍干，壓蓋后置4°C保存備用。六、動物實驗6. I安全性試驗用生理鹽水重懸凍干的豬鏈球菌2型Λ Ecel/Λ Salk/R雙基因缺失菌株，經頸部肌肉接種35日齡鏈球菌陰性健康仔豬，分109、108、107c. f. u. 3個劑量組，每組5頭，同時設IO6C. f. u.劑量的豬鏈球菌2型SC19地方分離株感染仔豬對照組和IO7c. f. u.劑量的豬鏈球菌2型AEcel單基因缺失菌株感染仔豬對照組，并于感染后每天觀察實驗豬的臨床表現，共觀察21天。結果在整個觀察期內豬鏈球菌2型Λ Ecel/Λ Salk/R雙基因缺失菌株接種豬沒有出現任何不良反應，而IO6C. f. u.野生菌和IO7C. f. u.劑量的豬鏈球菌2型Λ Ecel單基因缺失菌株感染仔豬后第二天即表現出很明顯的豬鏈球菌病臨床癥狀高稽留熱、食欲不振、嗜睡、乏力、共濟失調、關節腫脹、跛行、角弓反張、全身紅腫、臥地不起等，野生菌感染對照組豬只于感染后5天內全部死亡，豬鏈球菌2型△ Ecel單基因缺失菌株感染對照組豬只4頭于感染后5天內死亡。實驗結果說明豬鏈球菌2型Λ Ecel/Λ Salk/R雙基因缺失菌株比豬鏈球菌2型AEcel單基因缺失菌株毒力要下降很多，IO9, IO8,107c. f. u. 3個劑量的豬鏈球菌2型Λ Ecel/Λ Salk/R雙基因缺失菌株對仔豬均是安全的。6. 2仔豬的免疫與抗體檢測將16頭35日齡豬鏈球菌為陰性的健康仔豬分為3組，其中免疫攻毒組和非免疫 攻毒組各7頭，空白對照組2頭。用生理鹽水重懸凍干的豬鏈球菌2型Λ Ecel/Λ Salk/R雙基因缺失菌，經頸部肌肉接種免疫攻毒組仔豬，每頭接種1ml，菌量為108c. f.u.;非免疫攻毒組和空白對照組經頸部肌肉接種Iml生理鹽水，共免疫I次。所有實驗豬于免疫后2周和3周分別通過頸靜脈叢采血，分離血清后用武漢科前動物生物制品有限責任公司生產的豬鏈球菌CPSELISA抗體檢測試劑盒檢測針對豬鏈球菌2型的抗體水平，結果如圖8所示，免疫組豬只均產生了較高水平的特異性抗體，而非免疫對照組和空白對照組均為陰性。6. 3保護力試驗免疫后第28天，免疫攻毒組與非免疫攻毒組仔豬經耳緣靜脈注射IO6C. f. u.的豬鏈球菌2型地方分離株SC19，空白對照不作處理。于攻毒后第三天剖殺免疫攻毒組與非免疫攻毒組各2頭豬及空白對照組仔豬，以觀察其組織器官的病變情況，同時取樣檢測組織帶菌量。免疫攻毒組與非免疫攻毒組另外的5頭豬用于發病情況與死亡情況的觀察。結果免疫攻毒組豬只在攻毒后兩天內體溫略有升高，以后恢復到正常水平，未表現出其它不良反應，而非免疫攻毒組的所有豬只在攻毒后表現出高稽留熱、食欲不振、嗜睡、乏力、共濟失調、關節腫脹、跛行、角弓反張、全身紅腫、臥地不起等嚴重的豬鏈球菌病癥狀，并于一周內全部發病死亡(圖9、10)，實驗結果說明本發明的豬鏈球菌2型Λ Ecel/Λ Salk/R雙基因缺失菌株能夠保護免疫豬抵抗豬鏈球菌2型強毒菌株SC19的攻擊。剖殺豬只發現免疫攻毒組的豬只各組織器官與空白對照組的豬只基本一樣，未發現有明顯的病理變化。而非免疫攻毒組的豬只解剖后發現其各個組織器官都有一定程度的病變，主要表現在消化道黏膜、上呼吸道粘膜充血、出血，肺腫脹，充血出血；腦膜充血、出血，腦膜下積液，腦組織切面有點狀出血；心內膜出血，心包內有大量淡黃色積液；肝臟、腎臟以及脾臟腫大、出血，脾暗紅或藍紫；關節腔內有黃色膠凍樣或纖維素性、膿性滲出物。稱取采集的腦、肺臟、肝臟、心臟、脾臟、腎臟、淋巴結等組織各O. 2g，加Iml磷酸緩沖液PBS勻漿。各取100 μ L勻漿液并做適當的稀釋后涂布于含有10%新生牛血清的TSA平皿，同時取實驗豬的抗凝血各100 μ L同樣涂布含有10%新生牛血清的TSA平皿，于37°C溫箱中培養24h后計算O. Ig組織的帶菌量(c. f. u. /0. Ig組織)，結果如表I所示，免疫攻毒組豬只除了心臟、腎臟、淋巴結和血液中能檢測到極少量細菌外，其余組織均不帶菌，而非免疫攻毒對照組豬只各組織中均能檢測到大量的細菌。同時對分離獲得的菌用pl/p2引物進行 PCR 擴增(反應條件為94°C 預變性 IOmin ；94°C lmin, 55°C lmin, 72°C I. 5min，30個循環后，72°C延伸IOmin)證實所分離的菌均為豬鏈球菌2型野生菌SC19。實驗結果進一步說明豬鏈球菌2型Λ Ecel/ Λ Salk/R雙基因缺失菌株能夠保護免疫豬抵抗豬鏈球菌2型強毒菌株SC19的攻擊。表.I豬鏈球菌強毒菌株SC19在各組織中的分布情況(單位c. f. u. /0. Ig組織)
權利要求
1.一種豬鏈球菌2型雙基因缺失菌株，其特征在于該菌株是豬鏈球菌II型(streptococcussuis II) Δ Ecel/Δ Salk/R,保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO M2010360o
2.包含權利要求I所述的豬鏈球菌2型雙基因缺失菌株的雙基因缺失活疫苗。
3.權利要求I所述的菌株在制備豬鏈球菌2型雙基因缺失活疫苗上的應用。
全文摘要
本發明涉及動物傳染病疫苗制備技術領域。具體涉及一種豬鏈球菌2型雙基因缺失活疫苗的制備及應用。本發明以豬鏈球菌2型地方分離株SC19為基礎，采用同源重組的方法，在缺失了單基因Ece1的基礎上，繼續缺失另一個Salk/R基因，獲得豬鏈球菌2型ΔEce1/ΔSalk/R雙基因缺失株，以該雙基因缺失株的菌液和明膠為主要材料制備出豬鏈球菌2型雙基因缺失活疫苗。本發明涉及的豬鏈球菌2型ΔEce1/ΔSalk/R株，保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC NOM2010360。本發明制備的豬鏈球菌2型雙基因缺失活疫苗中的Salk/R基因缺失后其毒力大幅度下降，安全性高，不存在毒力返強的風險，且免疫原性高，能夠保護免疫豬抵抗5×LD50豬鏈球菌2型強毒菌株的攻擊。
文檔編號C12N1/20GK102776134SQ20111012234
公開日2012年11月14日 申請日期2011年5月12日 優先權日2011年5月12日
發明者方六榮, 肖少波, 譚臣, 貝為成, 陳煥春, 龍田泗 申請人:華中農業大學