專利名稱：一種篩查轉入靶標基因的轉基因樣本的方法
技術領域：
本發明涉及一種篩查轉入靶標基因的轉基因樣本的方法。
背景技術：
1983年，世界首例轉基因植物一抗病毒轉基因煙草在美國華盛頓大學培育成功， 標志著人類利用轉基因技術改良農作物的開始。基因工程與轉基因作為一種農作物遺傳改良的新方法，極大地提高了育種工作的質量和效率。從首次商業化種植轉基因作物的1996 年到2008年，轉基因作物累計種植面積超過8億公頃，說明轉基因作物已經成為農業人口接受最快的農作物技術。截止到2010年，已有30個國家批準種植轉基因作物，全球轉基因作物面積約達到每年1. 5億公頃。國際上獲得轉基因植株的植物已有超過35個科120多個種，它們主要集中在七大類農作物上，即大豆、玉米、棉花、油菜、馬鈴薯、南瓜、西葫蘆和木瓜。我國也是轉基因作物主要種植國家之一。加強農業轉基因生物安全管理，是推進轉基因技術研究與應用的重要保障。2010 年農業部對市場上普通非轉基因糧食作物品種推行轉基因成份篩查，以避免非轉基因品種中含有轉基因成份，使所有轉基因農作物生產與產品處于可控狀態。因此，從大量樣本中篩查轉基因成份陽性樣本，已成為普通商業品種重要的常規監測內容之一。此外，受植物遺傳轉化技術的限制，現有的遺傳轉化方法的轉化效率并不高，以玉米中應用最為廣泛農桿菌介導的幼胚遺傳轉化方法為例，通常在3-5%左右。因此，一般的遺傳轉化操作與轉基因研究中，也需要從大量樣本中篩除陽性樣本。目前，轉基因生物與環境安全備受關注，而轉基因植物中選擇標記的存在是影響轉基因植物安全評價的重要因素。開發無選擇標記轉基因技術是發展趨勢之一。然而，由于無選擇標記，將面臨從大量材料中選擇陽性個體的步驟，進一步加大的材料篩選的工作量。因此，開發高效的篩查技術將是無選擇轉基因技術的重要保障。當前，基于PCR技術的轉基因陽性樣本篩查都是單個樣本逐一分析，工作量大，效率低，成本高。正是基于轉基因研發本身與轉基因產品監管等需要，開發從大量樣本中高效定性篩查含轉基因成份樣本技術具有重要的技術意義，具備很好的應用前景。
發明內容
本發明的一個目的是提供一種從樣本群中輔助鑒別轉入靶標基因的轉基因樣本的方法。本發明所提供的從樣本群中輔助鑒別轉入靶標基因的轉基因樣本的方法，包括如下步驟1)將待測樣本群按照如下方法進行三維排列設置沿X方向設置m行，即第1行、第2行、……、第m行；沿Y方向設置η列，即第A列、第B列、……、第η列；沿Z方向設置ρ層，即第1層、第2層、……、第ρ層；
每層有m行和η列；2)進行如下PCR擴增反應將每層上的所有待測樣本的DNA或RNA混合，共有ρ種混合物，每種混合物是m*n 個樣本的混合物；每種混合物分別作為PCR反應的模板，則共有ρ個PCR反應；若所述ρ個PCR反應均沒有得到目的PCR擴增產物，則候選地確認所述待測樣本群中不含有轉入靶標基因的轉基因樣本；若所述ρ個PCR反應中至少一個PCR反應得到目的PCR擴增產物，則進行如下步驟3)3)進行如下PCR擴增反應將ρ層的對應的同一行號上的待測樣本的DNA或RNA混合，共有m種混合物，每種混合物是P*n個樣本的混合物；每種混合物分別作為PCR反應的模板，則共有m個PCR反應；將ρ層的對應的同一列號上的待測樣本的DNA或RNA混合，共有η種混合物，每種混合物是P*m個樣本的混合物；每種混合物分別作為PCR反應的模板，則共有η個PCR反應；上述m+n個PCR反應中，得到目的PCR擴增產物的PCR反應所對應的行、列和層的交叉點位置上的樣本即候選為轉入靶標基因的轉基因樣本；所述PCR反應均使用相同的引物；所述引物為用于檢測所述靶標基因的引物；所述目的PCR擴增產物為所述靶標基因或所述靶標基因的片段。上述方法中，m為12，η為8，q為5。上述任一所述方法中，所述待測樣本的DNA或RNA的濃度均為500ng/ μ L。上述任一所述方法中，每個PCR反應中的模板DNA或RNA的體積為2ul，濃度為 50ng/μ L0上述任一所述方法中，所述待測樣本為植物、動物或微生物。上述任一所述方法中，所述植物為農作物，具體為玉米。上述任一所述方法中，所述轉入靶標基因的轉基因樣本為轉外源基因Cryl4b的玉米。上述任一所述方法中，所述引物為如下引物對1)或引物對2)引物對1) =SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO 2 所示 DNA 分子；引物對 2) =SEQ ID NO 3 和 SEQ ID NO 4 所示 DNA 分子.本發明利用三維混合池三維交叉唯一性原理與PCR檢測的靈敏性與特異性，高效定性篩查樣本中的陽性個體。該發明的原理請見圖1。本發明的基本原理以圖1以480個樣本，5個96孔板為例。分別構建三維(X、Y、Z)混合池。X維混合池為各板混合池，每個混合池含單塊96孔板樣本個數，即96個樣本，本例為板I到板V共5個混合池；Y維混合池為各行混合池，指把板I到板V相同的行所有樣本混合構成，1-12行共12個混合池，本例中單個行混合池含5 X 8 = 40個樣本；Z維混合池為各列混合池，共A-H共8個混合池，把板 I到V同一列所有DNA樣本混合構成，本例中單個列混合池含5X 12 = 60個樣本。三維混合池相加共有25個混合池。X、Y、Z三維混合池每一種排列組合的交叉點對應的樣本是唯一的，本例中共25個混合池的排列組合是000=5X12X8 = 480，等于本例中總樣本個數。利用PCR檢測對于DNA模板的靈敏性，分別對各混合池分別作PCR檢測，陽性三維混合池檢測到交叉點對應的樣本為陽性樣本。如板II池、B行池與2列池均檢測到CrylAb
陽性，則表明IIB2樣本為CrylAb陽性樣本。以此類推.......同時，對于樣本II2B進行
再一次的PCR擴增和檢測，以驗證該實驗的可靠性。因此，鑒定480個樣本含有陽性事件檢測的工作量為25個PCR反應，而普通單株檢測則需要480個反應，本方法檢測工作量是分單株檢測的5.2%。如果樣本數擴大到960個，則為10個96孔板，X維池為10個，而Y維與Z維混合池不變，三維共30個混合池，其檢測工作量則為30個反應，而常規則需要960 個反應，工作量為常規方法的3. 13%。本發明方法大大減少了 PCR的反應次數，省時省力， 節約了成本。當前，應加強農業轉基因生物安全管理需要，農業監管部門對市場上普通非轉基因糧食作物品種推行轉基因成份篩查，以避免非轉基因品種中含有轉基因成份，使所有轉基因農作物生產與產品處于可控狀態。本發明可以應用于此類檢測。受植物遺傳轉化技術的限制，現有的遺傳轉化方法的轉化效率并不高，一般的遺傳轉化操作與轉基因研究中，也需要從大量樣本中篩除陽性樣本。尤其是無選擇標記，將面臨從大量材料中選擇陽性個體的步驟，進一步加大的材料篩選的工作量。本發明可以應用于轉基因研究之中。本發明也可應用于基于PCR技術從大量樣本中篩查陽性個體的任何工作。
圖1為DNA混合池法高效篩選陽性PCR檢測方法原理。圖2為以ddH20與陰性DNA為對照，檢測稀釋陽性DNA的PCR檢測的靈敏性。(a) ddH20稀釋陽性DNA的PCR檢測(b)陰性DNA稀釋陽性DNA的PCR檢測M =Marker CK+ 陽性Bt 176 ；ddH20 空白對照；CK_ 陰性對照；數字1 9 陽性樣本被ddH20和陰性DNA模板分別稀釋 16、26、36、46、56、66、76、86、96 倍。圖3為三種混合池的PCR檢測。(a) 5個板池的PCR檢測(b)各板行池和列池的 PCR檢測。M =Marker CK+ 陽性Btl76 ddH20 空白對照；CK—陰性對照I-V 各板混合池A-H 列池1-12 行池。圖4為候選陽性樣本和陽性樣本的單個樣本PCR驗證檢測。(a)候選陽性樣本的 PCR檢測(b)陽性樣本的PCR檢測。M:Marker CK+:陽性Btl76 ddH20:空白對照；CK_ 陰性對照數字推測的陽性樣本、陽性樣本編號。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。Uracil-N-Glycosylase (簡稱 UNG 酶，Fermentas)、rTaq DNA 聚合酶(TAKARA)、 dNTPs (TIANGEN)、瓊脂糖、EB、異丙醇、70 % 的乙醇、分子量 Marker :D2000 (TANGEN)、 10XPCR緩沖液、IX TAE緩沖液、6 X上樣緩沖液、TIANGEN快捷型植物基因組DNA提取系統、液氮等。研缽、臺式小型離心機、Centrifuge 5415D型離心機(Eppendorf)、天平、SPEXGEN0 2010 GRINDER 高通量組織研磨機(SPEX SamplePreP, USA)、冷藏冰凍冰箱、 C1000 Thermal Cycler型基因擴增儀(Bio-Rad)、電泳儀(北京君意東方電泳設備有限公司)、PCR 超凈工作臺、Thermo ΝΑΝΟ DR0P2000 型分光光度計(Thermo Scientific, USA)、 微量移液器、凝膠成像系統(Bio-fcid)、Eppendorf管1. 5mL、2mL ；PCR反應管200 μ L。實施例1、DNA模板濃度的計算以5個96孔板混合樣本為例計算，本方法中最高混合樣本數為各板池，其中有96個樣本混合，96個個體中每個二倍體基因組學10倍覆蓋，則為2500Mb [Patrick S. Schnable,et al. ,2009. The B73 Maize Genome :Complexity,Diversity,and Dynamics. Science 326 (5956) ,1112.](玉米單倍體基因組)X 2 ( 二倍體)X 10 (覆蓋倍數)X96 (混合樣本個數)/978 (每 ρ 克 DNA Mb 數)=4907. 97pg = 4. 9ng (lng = 1 X l(T9g) [Dolezel J' Bartos J'Voglmayr H,Greilhuber J(2003). " Nuclear DNA content and genome size of trout and human" . Cytometry A 51 (2) :127-128.]。因此,96 樣本混合池中，4. 9ng DNA即包含了每個樣本二倍體基因組學10倍覆蓋的DNA量，即IOng DNA模板量中約含有 96個樣本中每個樣本20倍二倍體基因組覆蓋的DNA量，理論上排除因DNA混合模板中由于陽性樣本DNA缺失而導致的假陰性的可能性，此實驗中使用初始濃度為500ng/ μ L進行96 倍混合稀釋，每個PCR反應中模板濃度為2. 45ng/ μ L，2 μ L的模板DNA進行PCR反應，滿足最低DNA濃度的要求。實施例2、混合樣本靈敏度與模板濃度試驗一96倍ddH20稀釋及96倍樣本DNA模板稀釋一、材料1、本發明以玉米CrylAb為例說明，玉米CrylAb陽性種子，普通玉米(CrylAb陰性)種子。2、檢測轉基因玉米外源基因的引物表1中CryIAb。表1、引物信息
權利要求
1.一種從樣本群中輔助鑒別轉入靶標基因的轉基因樣本的方法，包括如下步驟1)將待測樣本群按照如下方法進行三維排列設置 沿X方向設置m行，即第1行、第2行、……、第m行； 沿Y方向設置η列，即第A列、第B列、……、第η列； 沿Z方向設置ρ層，即第1層、第2層、……、第ρ層； 每層有m行和η列；2)進行如下PCR擴增反應將每層上的所有待測樣本的DNA或RNA混合，共有ρ種混合物，每種混合物是m*n個樣本的混合物；每種混合物分別作為PCR反應的模板，則共有ρ個PCR反應；若所述P個PCR反應均沒有得到目的PCR擴增產物，則候選地確認所述待測樣本群中不含有轉入靶標基因的轉基因樣本；若所述P個PCR反應中至少一個PCR反應得到目的PCR擴增產物，則進行如下步驟3)3)進行如下PCR擴增反應將P層的對應的同一行號上的待測樣本的DNA或RNA混合，共有m種混合物，每種混合物是P*n個樣本的混合物；每種混合物分別作為PCR反應的模板，則共有m個PCR反應；將P層的對應的同一列號上的待測樣本的DNA或RNA混合，共有η種混合物，每種混合物是P*m個樣本的混合物；每種混合物分別作為PCR反應的模板，則共有η個PCR反應；上述m+n個PCR反應中，得到目的PCR擴增產物的PCR反應所對應的行、列和層的交叉點位置上的樣本即候選為轉入靶標基因的轉基因樣本；所述PCR反應均使用相同的引物；所述引物為用于檢測所述靶標基因的引物；所述目的PCR擴增產物為所述靶標基因或所述靶標基因的片段。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于m為12，η為8，q為5。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于所述待測樣本的DNA或RNA的濃度均為 500ng/y L0
4.根據權利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于每個PCR反應中的模板DNA或 RNA的體積為2ul，濃度為50ng/y L。
5.根據權利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述待測樣本為植物、動物或微生物。
6.根據權利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于所述植物為農作物，具體為玉米。
7.根據權利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于所述轉入靶標基因的轉基因樣本為轉外源基因CrylAb的玉米。
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于所述引物為如下引物對1)或引物對2) 引物對 1) :SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO 2 所示 DNA 分子；引物對 2) =SEQ ID NO 3 和 SEQ ID NO 4 所示 DNA 分子。
全文摘要
本發明公開了一種篩查轉入靶標基因的轉基因樣本的方法。該方法，包括如下步驟1)將待測樣本群按照如下方法進行三維排列設置沿X方向設置m行，沿Y方向設置n列，沿Z方向設置p層，每層有m行和n列；2)進行如下PCR擴增反應將每層上的所有待測樣本的DNA或RNA混合，共有p種混合物，每種混合物是m＊n個樣本的混合物；每種混合物分別作為PCR反應的模板，則共有p個PCR反應；若所述p個PCR反應均沒有得到目的PCR擴增產物，則候選地確認所述待測樣本群中不含有轉入靶標基因的轉基因樣本。本發明方法大大減少了PCR的反應次數，省時省力，節約了成本。
文檔編號C12Q1/68GK102220429SQ20111012227
公開日2011年10月19日 申請日期2011年5月12日 優先權日2011年5月12日
發明者劉文文, 宋新元, 張世煌, 張德貴, 李新海, 李明順, 李猛, 白麗, 翁建峰, 謝傳曉, 郝轉芳 申請人:中國農業科學院作物科學研究所