專利名稱：控制水稻葉綠體發育的突變致死基因及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于植物基因工程領域。涉及一種控制水稻葉綠體發育的突變致死基因及其應用。具體地說，本發明涉及一種利用圖位克隆技術克隆水稻0SALB3基因，以及利用轉基因實驗鑒定該基因的功能；同時利用該基因作為調節葉綠體發育，應用于水稻制種中。
背景技術：
葉綠體是植物進行光合作用的器官，葉綠體發育關系到植株的生存、植株的生長發育等眾多方面。水稻是重要的糧食作物，也是禾本科作物研究的模式植物。對水稻苗期白化致死突變進行研究可以深入研究葉綠素發育的分子機理，同時白化致死基因可應用于生產實踐中，如應用于常規制種中，防止后代的非法繁殖和自行留種，保護種子生產者的合法權益。水稻中報道了很多白化致死突變體，但克隆苗期白化致死基因的報道還并不多見。葉綠素生物合成及代謝研究已取得很大進展，對葉綠體生物合成前的生物合成途徑及其重要的代謝過程都得到了深入研究，許多與此有關的基因都得到了克隆。但對葉綠素合成啟動的核基因調控機理研究還很不深入，因此，葉綠素合成與植物自身的生長發育密切相關，因此，對調控葉綠素發育的核基因進行研究，可以深入了解葉綠素發育的分子機理，對調節植物的葉綠素含量，最終提高作物的產量具有重要意義。植物Pra基因是一類超級基因家族，其成員編碼的蛋白質中包含35個氨基酸前后相連的PI3R基序，每個PI3R蛋白平均含有2- 個PI3R結構域，每個PI3R結構域含有2個 α -螺旋。根據生物信息學分析，擬南芥和水稻中分別含有450個和650個編碼PI5R蛋白基因。PI3R蛋白基因在植物生長發育過程中扮演重要作用。如參與質體RNA的加工(Nakamura 等 Chloroplast RNA-binding and pentatricopeptide repeat proteins. Biochem Soc Trans，2004，32 :571-574)，細胞質雄性不育(CMQ 的恢復基因(Wang 等 Cytoplasmic male sterility of rice with boro ii cytoplasm is caused by a cytotoxic peptide and is restored by two related PPR motif genes via distinct modes of mrna silencing. Plant Cell, 2006,18 :676-687)。YGLl 基因編碼 0sPPR2 蛋白，其功能缺失突變體影響葉綠體發育，形成黃化轉綠突變體(Wu等A chlorophyll-deficient rice mutant with impaired chlorophyllide esterification in chlorophyll biosynthesis. Plant Physiol, 2007,145(1) 29-40)。但總的來說，對水稻PI3R蛋白基因的克隆和生物學功能的研究還很不深入。
發明內容
本發明要解決的問題是提供一種從水稻苗期白化致死突變體中克隆新基因 0sALB3，該基因編碼一個PI3R蛋白，調控葉綠體的發育。為了解決上述技術問題，本發明提供一種調控葉綠體發育的蛋白質，該蛋白質具有SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列。優選的，其中蛋白質由基因0sALB3編碼。作為本發明的水稻調控葉綠體的發育的基因0sALB3編碼的蛋白質的改進氨基酸序列還包括在SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列中添加、取代、插入或缺失一個或多個氨基酸或其他物種的同源序列而生成的氨基酸序列或衍生物。本發明還提供了編碼上述蛋白質的基因，該基因具有SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列。作為本發明的基因的改進核苷酸序列還包括在SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列中添加、取代，插入或缺失一個或多個核苷酸而生成的突變體、等位基因或衍生物。本發明還提供了含有上述基因的質粒。本發明還提供了含有上述基因的植物表達載體。本發明還提供了一種宿主細胞，該宿主細胞含有上述基因序列。作為本發明的宿主細胞的改進該細胞為大腸桿菌細胞、農桿菌細胞或植物細胞。本發明還提供了一種調控水稻葉綠體的發育，導致苗期白化致死的方法，包括用上述植物表達載體轉化植物細胞，再將轉化的植物細胞培育成植株，其中植物表達載體包含SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列。實現本發明的具體技術步驟如下一、水稻苗期白化致死突變體alb3的分離和遺傳分析突變體alb3來源于組織培養后代，通過對TO代，Tl代和突變體與野生型水稻正反雜交實驗，證明該突變體受一對隱性核基因控制，突變體表型如圖1所示。二、葉綠體超微結構觀察利用透射電鏡(TEM)觀察野生型和alb3的葉綠體超微結構，發現野生型的葉綠體片層結構正常，而alb3未見成熟的葉綠體結構，只見到類似前質體結構，含有部分內囊體膜和淀粉粒(圖2)三、圖位克隆苗期白化致死基因0sALB3 1、0sALB3基因的分子定位為了分離0sALB3基因，本發明首先建立了一個大的多態性高的F2定位群體，由 ALB3雜合體(粳稻品種中花11)為母本，選用秈稻品種龍特甫B為父本進行雜交，掛牌收獲 ALB3單株鑒定后代基因型，對獲得的F2群體中有表型分離的群體選取其中的隱性個體進行基因定位，利用SSR標記分子對ALB3位點進行初步定位，將其初步定位在第3染色體的長臂上，并介于RM16133和RM6987兩SSR標記之間。然后通過對RM16133和RM6987兩標記之間的BAC序列進行分析，發展了新的STS標記，將ALB3精確定位于PAC克隆AC093018和 AC091247之間重疊區段上STS標記RS3-6和RS3-15之間89Kb的范圍之內，并且與RS3-12 共分離(圖幻，通過分析此區段開放閱讀框(ORF)推測候選基因并基因測序分析，尋找突變位點。2、0sALB3基因的鑒定和功能分析根據精細定位的結果，在891Λ范圍內根據RiceGAAS (Rice Automat ed Systrm, http://ricegaas. dna. affrc. go. jp/)禾口 TIGR(http://rice, plantbiology. msu. edu/)的預測，發現在此區間內共有13個候選基因，我們設計了各基因的測序引物，采用PCR的方法分別從alb3和野生型品種基因組中擴增出所有候選基因進行測序分析。發現其中1個基因的1個DNA片段中，突變體alb3擴增的產物與野生型品種比較有31個堿基的缺失。野生型品種擴增的基因的序列為SEQ ID N0:1，命名為0sALB3基因。通過轉基因技術，將野生型0sALB3基因全長(包括啟動子和終止子)基因組序列構建到載體上轉化突變體，載體見圖4。結果表明獲得了恢復正常表型的轉基因水稻植株 (圖6)，分子生物學檢測證明獲得的轉化植株是alb3恢復功能的陽性株(圖7)，證明了本發明正確克隆了 0sALB3基因，明確了 0sALB3基因的DNA序列(SEQ ID NO :1)，氨基酸序列分析表明0sALB3編碼PI3R蛋白。水稻白化致死突變可以應用于雜交稻純度監測和防止后代留種，保護育種家的利益。本發明利用水稻苗期白化致死突變體，通過圖位克隆法克隆到了 0sALB3基因，該基因編碼一個新的PI3R蛋白。通過轉基因互補實驗鑒定了 0sALB3基因的功能。因而本發明能調節水稻葉綠體發育獲得苗期白化致死表型。為該基因的進一步利用打下了基礎。
圖1是粳稻品種中花11野生型和的苗期白化致死突變體0sabl3表型；左邊為野生型，右邊為突變體。圖2是野生型和突變體的透射電鏡觀察圖，A和C為野生型，C和D突變體，Cp為葉綠體，Thy為類囊體。圖3是0sALB3基因在水稻第6染色體上的精細定位；圖 4 是 pCAMBI2300_0sALB3 載體圖譜；圖5是白色胚芽提取DNA進行基因型鑒定。Marker為IOObp Ladder, WT為野生型中花11，MT為純合alb3突變體，1-18為其中的18個白色胚芽提取的DNA擴增的結果。圖6是功能互補實驗，TO轉基因水稻的表型；左圖是alb3，為突變體，右圖是 ALB3/alb3，為轉基因植株。圖7是pCAMBI2300-0sALB3的轉基因分子檢測圖。圖7A圖為潮霉素引物擴增，P 為pCAMBI2300-0sALB3質粒對照，CK為alb3未轉基因對照，1-5為轉化植株；圖7B為STS 標記鑒定，WT為野生型，MT為alb3突變體，1-5為轉化植株。
具體實施例方式為了理解本發明，下面以實施例進一步說明本發明，但不限制本發明。實施例1 :0sALB3基因的克隆1、水稻材料水稻(Oryza sativa L)突變體alb3 (albin03)，原始野生型材料為粳稻品種中花 11。2、電鏡觀察利用透射電鏡(TEM)觀察野生型和alb3的葉綠體超微結構，發現野生型的葉綠體片層結構正常，而alb3未見成熟的葉綠體結構，只見到類似前質體結構，含有部分內囊體膜和淀粉粒(圖2)。3、遺傳分析和定位群體利用自交和回交等方法確定alb3為隱性突變體，選取雜合體和原始野生型品種龍特甫B進行雜交，Fl代自交，單株收種種植F2群體，從有分離的群體中選出5 個隱性個體(白化苗)作為定位群體。在三葉期每株取1克左右的嫩葉，用來提取總DNA進行基因定位。
4、0sALB3基因的初步定位和精細定位采用水稻微量DNA的快速提取方法從水稻葉片中提取用于基因定位的基因組 DNA，該 DNA 抽提的方法為 CTAB 法(參照 Liu 等，A genome-wide analysis of wide compatibility in rice and the precise location ofthe S5 locus in the molecular map, Theor Appl Genet，1997 :809-814)。取大約IOOmg水稻葉片，經液氮冷凍，在直徑5cm 的小研缽中磨成粉狀，轉移到2ml離心管里提取DNA，獲得的DNA沉淀溶解于120 μ 1超純水中。每一個PCR反應用1.2μ1 DNA樣品。在0sALB3基因的初步定位，對由93個F2個體組成的小群體進行SSR分析，根據公布的粳稻和秈稻創建的分子遺傳圖譜，選取近似均勻分布于各條染色體上的SSR引物， 根據已知的反應條件進行PCR擴增，經4%瓊脂糖凝膠電泳分離和浪化乙錠(EB)染色，檢測 PCR產物的多態性，將0sALB3初步定位在第3號染色體長臂并介于RM16133和RM6987兩 SSR標記之間。根據初步定位的結果對0sALB3基因進行精細定位，通過對RM16133和RM6987兩個SSR標記之間，發展了 12個STS標記，對F2群體中選出的582個表現白化致死表型一致的個體進行STS分析。將0sALB3精確定位于PAC克隆AC093018和AC091247之間重疊區段上STS標記RS3-6和RS3-15之間89Kb的范圍之內，并且與RS3-12共分離(圖3)，通過分析此區段開放閱讀框(ORF)推測候選基因并基因測序分析，尋找突變位點。STS標記引物序列RS3-6F CTACCAAGAGTTGAAATCTAAACC(SEQ ID NO 3)RS3-6R :CTGCATGGAAACTAGCCGAG(SEQ ID NO 4)RS3-12F CGAAGCAAATGATCATGGGC(SEQ ID NO 5)RS3-12R :GTAGACGTTGACGGAGAAGG(SEQ ID NO :6)RS3-15F CCTCGTCTGAACACTGAATAC(SEQ ID NO :7)RS3-15R :TCTACTGCTTCTCGCCTCAC(SEQ ID NO :8)5、基因預測和比較分析根據精細定位的結果，在891Λ范圍內根據RiceGAAS (Rice Automat ed Systrm, http://ricegaas. dna. affrc. go. jp/)禾口 TIGR(http://rice, plantbiology. msu. edu/)的預測，發現在此區間內共有13個候選基因，我們設計了各基因的測序引物，采用PCR的方法分別從alb3和野生型品種基因組中擴增出所有候選基因進行測序分析。發現其中1個編碼 PI3R蛋白的基因第一外顯子中，突變體alb3擴增的產物與野生型品種比較有31個堿基的缺失，引起了 mRNA的變化，導致蛋白質翻譯提前終止。將這段序列重復測序兩次，確認alb3 突變體與野生型品種比較確定在這個基因中有31個堿基的缺失，根據RiceGAAS和TIGR的注釋信息，預測此基因編碼一個PI3R重復蛋白。從野生型中花11中擴增的基因測序得到的基因序列為SEQ ID NO :1，命名為0sALB3基因，其編碼的蛋白質測序得到的核苷酸序列為 SEQ ID NO :2。實施例2 轉基因實驗植物轉化1、載體構建設計一對完全覆蓋整個0sALB3基因ORF的引物，包括ATG上游約2. 2kb的啟動子序列和終止密碼子下游約11Λ的序列。在引物上分別設計酶切位點KpnI和Sail， PCR擴增野生型基因組DNA，電泳檢測后切膠回收，回收產物用KpnI和MlI酶切，連接至同樣酶切的PCAMBIA2300載體上，測序確認沒有發生堿基突變，構建后的載體結構圖為 pCAM BIA2300-ALB3 (圖4)，把構建好的載體通過電擊的方法轉入農桿菌(A grobacterium tumefaciens)EHA 105 菌株中。擴增ORF序列的引物序列為WK04-GEN0ME-KpnI :5，-GCCAAAGGTACCTGAAAGGCAGCTGAGAAAGCCATG-3’ (SEQ ID NO 9)WK04-GEN0ME-SalI :5’ -TACAGTCGACTACAAAATACTCGCTCGCACAGGCTTG-3’ (SEQ ID NO 10)2、遺傳轉化(1)轉化受體的選擇將alb3雜合體成熟胚誘導愈傷組織，經過誘導培養基培養3周后，挑選生長旺盛的白色胚芽產生的愈傷組織用作轉化的受體，棄掉綠色胚芽誘導的愈傷，并將白色胚芽剪下用于微量提取DNA，在該缺失兩端設計了一個STS標記，STS標記引物如下ALB3-F 5' -TTCGCTGAAATGCGCCATG-3，(SEQ ID NO 11)ALB3-R 5' -ACACGGGAGAGGTTACCAG-3，(SEQ ID NO 12)野生型DNA可以擴增出210bp的片段，純合突變體可以擴增出ISObp的片段，雜合體可以擴增210bp和ISObp兩條片段。用該STS標記進行PCR擴增，鑒定種子的基因型，發現白色胚芽的基因型均為純合突變型，可用于轉基因實驗(圖5)。(2)遺傳轉化采用農桿菌介導的遺傳轉化方法(Hiei等，Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of T-DNA. Plant J，1994，6 :271-282)，將 pCAMBIA2300 空載體和 PCAMBIA2300-ALB3載體的EHA105菌株侵染水稻愈傷，在黑暗、25°C條件下共培養3天后，在含有120mg/L G418的篩選培養基上培養。篩選抗性愈傷在含有120mg/L預分化培養基上培養10天左右。將預分化的愈傷轉至分化培養基上在光照條件下培養。一個月左右得到抗性轉基因植株。對植株進行鑒定和連續的觀察，發現轉空載體的轉基因植株表型與alb3 突變體相比不發生變化，即仍然為白化苗，而PCAMBIA2300-ALB3載體的陽性轉基因植株表現出綠苗，即恢復了 alb3的突變表型，見圖6。3、分子檢測從獲得的轉化植株剪取一小片嫩葉，微量提取DNA，首先利用轉化 PCAMBIA2300-ALB3中的NPTII的引物進行擴增，質粒陽性對照和轉化苗可以擴增出目標產物，而陰性對照無擴增，表明PCAMBIA2300-ALB3已整合到基因組中(圖7A)。NPTII 引物NptII-F :5，-TATGTCCTGATAGCGGTCCG-3，(SEQ ID NO 13)NptII-R :5，GTGCCCTGAATGAACTCCAG-3，(SEQ ID NO 14)再用實例2所述的STS標記對轉化植株進行鑒定，由于挑選用于轉化的愈傷組織是白化苗(純合突變體)誘導的，如果PCAMBIA2300-ALB3已轉化入基因組中，其攜帶的
7ALB3基因為野生型，轉化苗后代可以擴增出210bp和ISObp兩條片段。結果表明，上述5個植株成功擴增出210bp和ISObp兩條片段(圖7B)，證明獲得的轉化植株確實是alb3恢復表型的植株。 最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發明的若干個具體實施例。顯然，本發明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容直接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發明的保護范圍。
權利要求
1.一種調控葉綠體發育的蛋白質，該蛋白質具有SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列。
2.根據權利要求1所述的蛋白質，其中氨基酸序列還包括在SEQID NO :2所示的氨基酸序列中添加、取代、插入或缺失一個或多個氨基酸或其他物種的同源序列而生成的氨基酸序列或衍生物。
3.一種編碼權利要求1所述蛋白質的基因，該基因具有SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列。
4.根據權利要求3所述的基因，其中核苷酸序列還包括在SEQID NO :1所示的核苷酸序列中添加、取代，插入或缺失一個或多個核苷酸而生成的突變體、等位基因或衍生物。
5.一種調控水稻葉綠體的發育，導致苗期白化致死的方法，包括用植物表達載體轉化植物細胞，再將轉化的植物細胞培育成植株，其中植物表達載體包含SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列。
全文摘要
本發明涉及一種控制水稻葉綠體發育的突變致死基因及其應用，還公開基因編碼的蛋白質，該蛋白質具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。基因具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。該水稻葉綠體發育編碼基因被破壞可導致葉綠體發育受阻，苗期即白化致死。本發明還公開了調控水稻葉綠體發育形成致死突變的方法。將其應用于植物遺傳改良工作，是重要的指示基因。可作為目的基因應用于雜交水稻制種，可以方便檢測雜交后代的純度。應用于常規制種中，由于其純合致死特點，可以防止后代的非法留種和制種有效保護品種擁有者的知識產權。本發明還公開了含有上述基因的質粒、植物表達載體和宿主細胞。
文檔編號C12N5/10GK102212122SQ201110122168
公開日2011年10月12日 申請日期2011年5月12日 優先權日2011年5月12日
發明者嚴松, 劉合芹, 汪慶, 汪得凱, 陶躍之 申請人:浙江省農業科學院