專利名稱：一種多重檢測基因組dna多態性的方法及其專用探針的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域，尤其涉及一種多重檢測基因組DNA多態性的方法及其專用探針。
背景技術：
脫氧核糖核酸(DNA)多態性是指染色體DNA等位基因中核苷酸排列的差異性， 即DNA區域中等位基因(或片段)存在兩種或兩種以上的基因型，可分為單核苷酸多態性 (single nucleotide polymorphism, SNP)禾口插入 / 缺失多態性(insertion/deletion, In/ Del)。(1)單核苷酸多態性(SNP)單核苷酸多態性(SNP)是指染色體基因組水平上單個核苷酸的變異引起的DNA 序列多態性，其中最少一種等位基因在群體中的出現頻率不少于1%。SNP所表現的多態性只涉及到單個堿基的變異，這種變異可由單個堿基的轉換(transition)或顛換 (transversion)所引起，也可由堿基的插入或缺失所致。但通常所說的SNP并不包括后兩種情況。SNP在基因組內可劃分為兩種形式一是遍布于基因組的大量單堿基變異；二是基因編碼區的功能性突變，由于分布在基因編碼區(coding region)，故又稱其cSNP。總的來說，位于編碼區內的SNP (cSNP)比較少，因為在外顯子內，其變異率僅及周圍序列的1/5。但它在遺傳性疾病研究中卻具有重要意義，因此cSNP的研究更受關注。區分SNPs位點的方法包括①基于雜交的方法，②基于酶的方法，③以構象為基礎的方法，④直接測序的方法等。檢測分析技術包括①凝膠分析技術，②熒光檢測技術，③DNA芯片檢測技術，④質譜檢測技術等。理想的檢測SWs方法必須符合以下特點①具有高的靈敏度和準確度(反應原理嚴謹)，②快速、簡便、高通量，③費用相對低廉。但是，目前已有的檢測方法都無法滿足以上要求。(2)插入 / 缺失多態性(insertion/deletion, InDel)插入/缺失多態性(insertion/deletion，InDel)，是指兩生物個體在全基因組中的差異，相對另一個個體而言，其中一個個體的基因組中有一定數量的核苷酸插入或缺失 (Jander, G.，Norris, S. R.，Rounsley, S. D.，Bush，D. F.，Levin, I. Μ. and Last，R. L (2002) Arabidopsis map-based cloning in the post-genome era. Plant Physiol. 129， 440-450)。短的插入與缺失(20-30核苷酸)主要是DNA復制過程的錯配造成，比如滑動鏈的錯配，而長的插入與缺失的發生主要是由不等長的互換或者DNA錯位造成。根據基因組中插入缺失位點，設計一些擴增這些插入缺失位點的PCR引物，這就是插入/缺失anDel) 標記。傳統的檢測插入/缺失標記的方法主要是針對一個插入/缺失位點設計一對PCR引物，經PCR擴增、凝膠或毛細管電泳檢測，一般一次只能檢測一個插入/缺失標記，通量很低
發明內容
本發明的一個目的是提供一種單鏈DNA分子。本發明提供的單鏈DNA分子，從5’末端到3’末端依次由如下部分組成與待測 DNA的5’端互補左側寡核苷酸片段、主體片段和與待測DNA的3’端互補右側寡核苷酸片段；所述主體片段由如下部分組成用于決定所述單鏈DNA分子大小的長度可變區和分別位于所述長度可變區兩側的引物對區和公共片段；所述引物對區為將如下兩條寡核苷酸鏈串聯連接得到1)能擴增所述單鏈DNA分子的一對引物中的一條引物；2)能擴增所述單鏈DNA分子一對引物中的另一條引物的反向互補序列的寡核苷酸；所述長度可變區為大小為45-lOOOnt的寡核苷酸；所述公共片段為大小為13-18nt的寡核苷酸；所述主體片段與所述待測基因不互補。所述一條引物和所述另一條引物的大小均為18_22nt，所述一條引物和所述另一條引物的大小均具體為20nt;所述公共片段為大小具體為15nt的寡核苷酸。以下各個片段為檢測單核苷酸多態性中的DNA分子對應的片段所述長度可變區的核苷酸序列為如下1)-8)中的任一一種序列表中序列1的第68-112位；序列表中序列2的第68-1 位；序列表中序列3的第62-136位；序列表中序列4的第62-153位；序列表中序列8的第64-125位；序列表中序列9的第64-155位；序列表中序列10的第67-278位；序列表中序列11的第67-299位；所述公共片段的核苷酸序列為序列表中序列1的第113-127位或序列表中序列2 的第130-144位或序列表中序列3的第137-151位或序列表中序列4的第1M-168位或序列表中序列8的第U6-140位或序列表中序列9的第156-170位或序列表中序列10的第 279-293位或序列表中序列11的第300-314位；所述引物對區的核苷酸序列為序列表中序列1的第觀-67位或序列表中序列2的第觀-67位或序列表中序列3的第22-61位或序列表中序列4的第22-61位或序列表中序列8的第M-63位或序列表中序列9的第M-63位或序列表中序列10的第27-66位或序列表中序列11的第27-66位。本發明的第二個目的是提供用于檢測DNA單核苷酸多態性的專用扣手探針。本發明提供的用于檢測DNA單核苷酸多態性的專用扣手探針，所述專用扣手探針由m組探針組成，所述每一組探針對應一個待測SNP位點，所述單核苷酸多態性為一個待測 SNP位點存在η種多態性，所述每一組探針由η條所述的單鏈DNA分子組成，
η為大于等于2的自然數；m為大于等于1的自然數；所述每一條單鏈DNA分子的5’端左側寡核苷酸片段與待測SNP位點的上游片段特異結合，所述每一條單鏈DNA分子的3’端右側寡核苷酸與待測SNP位點的下游片段特異結合，所述每一條單鏈DNA分子的3’末端堿基與待測SNP位點的堿基互補。所述探針組的數目與所述待測SNP位點的數目相同；所待測SNP位點的數目至少為兩個；所述每一組探針中的每條所述的單鏈DNA分子的大小均不相同，所述的單鏈DNA 分子的大小由其的所述長度可變區決定；每條所述的單鏈DNA分子的5’末端磷酸化，具體為每條所述的單鏈DNA分子的左側寡核苷酸自5’末端起第一位核苷酸的第5位碳原子上連接磷酸基團。所述專用扣手探針由如下兩個探針組組成探針組1由如下兩條所述單鏈DNA分子組成1)序列表中序列1所示的寡核苷酸；2)序列表中序列2所示的寡核苷酸；探針組2由如下兩條所述單鏈DNA分子組成3)序列表中序列3所示的寡核苷酸；4)序列表中序列4所示的寡核苷酸。本發明的第三個目的是提供一種用于檢測DNA插入或缺失多態性的專用扣手探針。本發明提供的用于檢測DNA插入或缺失多態性的專用扣手探針，所述專用扣手探針由a組探針組成，所述每一組探針對應一個待測DNA插入或缺失位點，所述單核苷酸多態性為一個待測DNA插入或缺失位點存在b種多態性，所述每一組探針由b條所述的單鏈DNA分子組成，b為大于等于2的自然數；a為大于等于1的自然數；所述每一條單鏈DNA分子的5’端左側寡核苷酸片段與待測插入或缺失位點的上游片段特異結合，所述每一條單鏈DNA分子的3’端右側寡核苷酸與待測插入或缺失位點的下游片段特異結合。所述單鏈DNA分子的數目與所述DNA的插入或缺失位點的數目相同；所述DNA的插入或缺失位點至少為2個；所述每條單鏈DNA分子的大小均不相同，所述的單鏈DNA分子的大小由其的所述長度可變區決定；每條所述的單鏈DNA分子的5’末端磷酸化，具體為每條所述的單鏈DNA分子的左側寡核苷酸自5’末端起第一位核苷酸的第5位碳原子上連接磷酸基團；所述專用扣手探針由如下兩個探針組組成探針組1由如下兩條所述單鏈DNA分子組成1)序列表中序列8所示的寡核苷酸；2)序列表中序列9所示的寡核苷酸；
探針組2由如下兩條所述單鏈DNA分子組成3)序列表中序列10所示的寡核苷酸；4)序列表中序列11所示的寡核苷酸。含有所述單鏈DNA分子或所述的專用扣手探針的試劑盒也是本發明保護的范圍。所述單鏈DNA分子或所述的專用扣手探針在DNA分子多態性鑒定中的應用也是本發明保護的范圍。所述多態性為單核苷酸多態性或插入或缺失多態性；所述單核苷酸多態性具體由至少兩個SNP位點引起的單核苷酸多態性；所述插入或缺失多態性具體由至少2個插入或缺失位點引起的插入或缺失多態性。所述生物為植物，所述植物具體為粗山羊草或大麥；所述至少兩個SNP位點引起的單核苷酸多態性具體為序列表中序列5所示DNA分子第62位核苷酸的多態性和序列表中序列6所示DNA分子第174位核苷酸的多態性；所述序列表中序列5所示DNA分子第62位核苷酸的多態性為序列表中序列5所示DNA分子的第62位核苷酸為A或G ；所述序列表中序列6所示DNA分子第174位核苷酸的多態性為序列表中序列6所示DNA分子第174位核苷酸為T或C ；所述序列表中序列5所示DNA分子和序列表中序列6所示DNA分子為粗山羊草 (Aegilops tauschii)的兩個SNP所在的序列。粗山羊草2280和2282品種在序列5中的第62位核苷酸具有多態性，分別為AA和GG ；粗山羊草2280和2282品種在序列6中的第 175為核苷酸具有多態性，分別為TT和CC。所述至少2個插入或缺失位點引起的插入或缺失多態性具體為1)和2)1)序列表中序列12所示的DNA分子自5，末端的第120-121位之間插入CCGTC得到序列表中的序列13所示的DNA分子；或序列表中序列13所示的DNA分子自5’末端的第 121-125位缺失CCGTC得到序列表中的序列12所示的DNA分子；2)序列表中序列15所示的DNA分子自5，末端的第116-117位插入GCCCAT得到序列表中的序列14所示的DNA分子；或序列表中序列14所示的DNA分子自5’末端的第 117-122位缺失GCCCAT得到序列表中的序列15所示的DNA分子。所述序列表中序列12所示DNA分子或序列13所示DNA分子與序列表中序列14 所示DNA分子或序列15所示DNA分子為大麥的兩個插入/缺失標記所在的DNA序列。本發明的第四個目的是提供一種檢測生物基因組單核苷酸多態性的方法。本發明提供的一種檢測生物基因組單核苷酸多態性的方法，包括如下步驟1)將所述用于檢測DNA單核苷酸多態性的專用扣手探針中的所有單鏈DNA分子與基因組片段連接環化，得到扣手探針的環化產物；2)以步驟1)得到的環化產物為模板進行PCR，根據得到PCR產物的大小確定生物
基因組單核苷酸的多態性。步驟1)中，在所述連接環化之前，還包括將所述基因組片段打碎為80_250bp大小的DNA分子；所述連接環化體系包括連接緩沖液、連接酶、扣手探針、80_250bp大小的DNA片段，所述連接酶在所述連接體系中的濃度為0. 04U/ul，所述每個扣手探針在所述連接體系中的濃度均為0. 04ng/ul，所述80-250bp大小的DNA分子在所述連接體系中的濃度為 24ng/ul ；步驟2)中，所述PCR的引物為所述單鏈DNA分子中的引物對區對應的能擴增所述單鏈DNA分子的一對引物中的所述一條引物和所述另一條引物；所述一條引物的核苷酸序列為序列表中序列1的第48-67位或序列表中序列2的第48-67位或序列表中序列3的第42-61位或序列表中序列4的第42-61位；所述另一條引物的反向互補片段的核苷酸序列為序列表中序列1的第觀-47位序列表中序列2的第觀-47位或序列表中序列3的第22-41位或序列表中序列4的第22-41 位。所述根據得到PCR產物的大小確定生物基因組單核苷酸的多態性為通過PCR產物大小，確定與其大小相同的所述專用扣手探針中的一條單鏈DNA分子，通過所述單鏈DNA分子中3’末端的堿基，確定對應的SNP位點，從而確定生物基因組單核苷酸的多態性。本發明的第五個目的是提供一種檢測生物基因組插入或缺失多態性的方法。本發明提供的檢測生物基因組插入或缺失多態性的方法，包括如下步驟1)將所述用于檢測DNA插入或缺失多態性的專用扣手探針的所有單鏈DNA分子與基因組片段連接環化，得到扣手探針環化產物；2)以步驟1)得到的環化產物為模板進行PCR，根據得到PCR產物的大小確定生物基因組插入或缺失的多態性；步驟1)中，在所述連接環化之前，還包括將所述基因組片段打碎為80_250bp大小的DNA分子；所述連接環化的體系包括連接緩沖液、連接酶、扣手探針、80_250bp大小的DNA 片段，所述連接酶在所述連接體系中的濃度為0. 04U/ul，所述每個扣手探針在所述連接體系中的濃度均為0. 04ng/ul，所述80-250bp大小的DNA分子在所述連接體系中的濃度為 24ng/ul ；步驟2)中，所述PCR的引物為所述單鏈DNA分子中的引物對區對應的能擴增所述單鏈DNA分子的一對引物中的所述一條引物和所述另一條引物；所述一條引物的核苷酸序列為序列表中序列8的第44-63位或序列表中序列9的第44-63位或序列表中序列10的第47-66位或序列表中序列11的第47-66位；。所述另一條引物的反向互補片段的核苷酸序列為序列表中序列8的第M-43位或序列表中序列9的第M-43位或序列表中序列10的第27-46位或序列表中序列11的第 27-46 位。所述根據得到PCR產物確定生物基因組插入或缺失的多態性為若有PCR產物，通過PCR產物的大小，確定與其大小相同的所述專用扣手探針中的對應的單鏈DNA分子，根據所述對應的單鏈DNA分子的左側寡核苷酸片段和右側寡核苷酸片段確定與其互補生物基因組上游片段和下游片段間沒有插入或缺失的多態性；若沒有PCR產物，與所述專用扣手探針中其余的單鏈DNA分子的左側寡核苷酸片段和右側寡核苷酸片段的分別互補的生物基因組上游片段和下游片段間有插入或缺失多態性。本發明的實驗證明，本發明提供的單鏈DNA分子，為針對不同脫氧核糖核酸標記位點及其等位位點的不同，設計長度各不相同的扣手探針，通過連接酶反應區別出不同標記和不同等位位點，PCR擴增連接成功的不同長度的扣手探針，經過凝膠或毛細管電泳分離及檢測體系，實現同時檢測多個脫氧核糖核酸標記的多態性，能實現高的靈敏度和準確度， 同時滿足高通量和低費用的要求。
圖1為兩條不同長度扣手探針檢測一個單核苷酸多態性(SNP)標記的兩個等位位點示意2為兩條不同長度扣手探針檢測一個插入/缺失多態性anDel)標記的兩個等位位點示意3為迷你柱狀電泳儀設計4為扣手探針的SNP分型(5%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳)圖5為扣手探針的InDel標記分型(3%瓊脂糖凝膠電泳)圖6為扣手探針的InDel標記分型(5%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳)
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。本發明針對不同脫氧核糖核酸標記位點及其等位位點的不同，設計長度各不相同的扣手探針，通過連接酶反應區別出不同標記和不同等位位點，PCR擴增連接成功的不同長度的扣手探針，經過凝膠或毛細管電泳分離及檢測體系，實現同時檢測多個脫氧核糖核酸標記的多態性，設計方案如圖1和圖2所示。圖1為兩條不同長度扣手探針檢測一個單核苷酸多態性(SNP)標記的兩個等位位點示意圖，其中SP 長度可變的區間，長度可調整范圍45-lOOOnt ；Pl 為公共PCR引物的反向引物，長度為20nt ；P2 為公共PCR引物的正向引物，長度為20nt ；CS 為公共序列，長度為15nt ；LF 為左翼互補序列，長度一般在20-30nt之間，根據與目標DNA匹配程度及退火溫度可調整；RF 為右翼互補序列，長度一般在20-30nt之間，根據與目標DNA匹配程度及退火溫度可調整；Pdp 扣手探針。扣手探針Pdpl的總長度為155nt，Pdp2的總長度為 170nt，它們相差15nt，這兩個扣手探針的PCR產物可以在3%的瓊脂糖凝膠上檢測。A 扣手探針Pdpl的3’末端堿基與目標DNA完全匹配，即C和G互補，在連接酶作用下，Pdpl被環化，用Pl和P2兩條公共引物PCR擴增后，產生155nt的PCR產物，可在5%的聚丙烯酰胺凝膠或者3%的瓊脂糖凝膠或者毛細管電泳分離檢測。B 扣手探針Pdpl的3’末端堿基與目標DNA不匹配，即C和T不互補，在連接酶作用下，Pdpl不能被環化，用Pl和P2兩條公共引物PCR擴增后，沒有PCR產物。C 扣手探針Pdp2的3’末端堿基與目標DNA完全匹配，S卩A禾Π T互補，在連接酶作用下，Pdp2被環化，用Pl和P2兩條公共引物PCR擴增后，產生170nt的PCR產物，可在5%的聚丙烯酰胺凝膠或者3%的瓊脂糖分離檢測。D 扣手探針 Pdp2的3’末端堿基與目標DNA不匹配，即A和G不互補，在連接酶作用下，扣手探針2不能被環化，用Pl和P2兩條公共引物PCR擴增后，沒有PCR產物。圖2為兩條不同長度扣手探針檢測一個插入/缺失多態性anDel)標記的兩個等位位點示意圖，SP 長度可變的區間，長度可調整范圍45-lOOOnt ；Pl 為公共PCR引物的反向引物，長度為20nt ；P2 為公共PCR引物的正向引物，長度為20nt ；CS 為公共序列，長度為15nt ；LF:為左翼互補序列，長度一般在20-30nt之間，根據與目標DNA匹配程度及退火溫度可調整；RF 為右翼互補序列，長度一般在20-30nt之間，根據與目標DNA匹配程度及退火溫度可調整；Pdp 扣手探針。扣手探針Pdp3的總長度為185nt，Pdp4的總長度為 200nt，它們相差15nt，這兩個扣手探針的PCR產物可以在3%的瓊脂糖凝膠上檢測。A 扣手探針Pdp3的左翼互補序列和右翼互補序列與目標DNA完全匹配，在連接酶作用下，扣手探針3被環化，用Pl和P2兩條公共引物PCR擴增后，產生185nt的PCR產物，可在5%的聚丙烯酰胺凝膠或3%的瓊脂糖凝膠或毛細管電泳分離檢測。B 在與Pdp3左翼互補序列和右翼互補序列匹配的目標DNA中間插入一段DNA片段后，在連接酶作用下，扣手探針3不能被環化，用Pl和P2兩條公共引物PCR擴增后，沒有PCR產物。C :Pdp4的左翼互補序列和右翼互補序列與目標DNA完全匹配，在連接酶作用下，扣手探針4被環化，用Pl和P2兩條公共引物PCR擴增后，產生200nt的PCR產物，可在5%的聚丙烯酰胺凝膠或者3%的瓊脂糖凝膠或毛細管電泳分離檢測。D 在與Pdp4左翼互補序列和右翼互補序列匹配的目標 DNA中間缺失一段DNA片段后，Pdp4不能與目標DNA完全匹配，在連接酶作用下，扣手探針 4不能被環化，用Pl和P2兩條公共引物PCR擴增后，沒有PCR產物。實施例1、單核苷酸多態性(SNP)的扣手探針一、粗山羊草(Aegilops tauschii)基因組的兩個SNP檢測1、扣手探針 PdPCJ819266A、PdPCJ819266G、PdPBE6^15T、PdPBE6^15C 的設計粗山羊草(Aegilopstauschii)的染色體組是普通小麥(Triticum aestivum)D 染色體組的供體。PdPCJ819266和PdPBE6^15為粗山羊草(Aegilops tauschii)的兩個 SNP,其中AA和TT為粗山羊草品種2280的基因型，而GG和CC為粗山羊草品種2282的基因型，即粗山羊草2280和2282品種在序列5中的第62位核苷酸具有多態性，分別為AA和 GG ；粗山羊草2280和2282品種在序列6中的第175為核苷酸具有多態性，分別為TT和CC。其中扣手探針PdPCJ819266A特異識別等位基因A，長度為147nt，扣手探針 PdPCJ819266G特異識別等位基因G，長度為16^t，扣手探針PdPBE6^15T特異識別等位基因T，長度為176nt，扣手探針PdPBE6^15C特異識別等位基因C，長度為193nt。四條扣手探針的5’末端均磷酸化，序列設計和結構說明見表1。表1、扣手探針的序列設計與結構說明
權利要求
1.一種單鏈DNA分子，從5’末端到3’末端依次由如下部分組成與待測DNA的5’端互補左側寡核苷酸片段、主體片段和與待測DNA的3’端互補右側寡核苷酸片段；所述主體片段由如下部分組成用于決定所述單鏈DNA分子大小的長度可變區和分別位于所述長度可變區兩側的引物對區和公共片段；所述引物對區為將如下兩條寡核苷酸鏈串聯連接得到1)能擴增所述單鏈DNA分子的一對引物中的一條引物；2)能擴增所述單鏈DNA分子一對引物中的另一條引物的反向互補序列的寡核苷酸； 所述長度可變區為大小為45-lOOOnt的寡核苷酸；所述公共片段為大小為13-18nt的寡核苷酸； 所述主體片段與所述待測基因不互補。
2.根據權利要求1所述的單鏈DNA分子，其特征在于所述一條引物和所述另一條引物的大小均為18-22nt，所述一條引物和所述另一條引物的大小均具體為20nt ；所述公共片段為大小為15nt的寡核苷酸；所述長度可變區的核苷酸序列為如下1)-4)中的任一一種序列表中序列1的第68-112位；序列表中序列2的第68-1 位；序列表中序列3的第62-136位；序列表中序列4的第62-153位；序列表中序列8的第64-125位；序列表中序列9的第64-155位；序列表中序列10的第67-278位；序列表中序列11的第67-299位；所述公共片段的核苷酸序列為序列表中序列1的第113-127位或序列表中序列2的第 130-144位或序列表中序列3的第137-151位或序列表中序列4的第1M-168位或序列表中序列8的第U6-140位或序列表中序列9的第156-170位或序列表中序列10的第279-293 位或序列表中序列11的第300-314位；所述引物對區的核苷酸序列為序列表中序列1的第觀-67位或序列表中序列2的第 28-67位或序列表中序列3的第22-61位或序列表中序列4的第22-61位或序列表中序列 8的第M-63位或序列表中序列9的第M-63位或序列表中序列10的第27-66位或序列表中序列11的第27-66位。
3.用于檢測DNA單核苷酸多態性的專用扣手探針，所述專用扣手探針由m組探針組成， 所述每一組探針對應一個待測SNP位點，所述單核苷酸多態性為一個待測SNP位點存在η 種多態性，所述每一組探針由η條權利要求1或2所述的單鏈DNA分子組成， η為大于等于2的自然數； m為大于等于1的自然數；所述每一條單鏈DNA分子的5’端左側寡核苷酸片段與待測SNP位點的上游片段特異結合，所述每一條單鏈DNA分子的3’端右側寡核苷酸與待測SNP位點的下游片段特異結合，所述每一條單鏈DNA分子的3’末端堿基與待測SNP位點的堿基互補。
4.根據權利要求3所述的專用扣手探針，其特征在于 所述探針組的數目與所述待測SNP位點的數目相同； 所待測SNP位點的數目至少為兩個；所述每一組探針中的每條所述的單鏈DNA分子的大小均不相同，所述的單鏈DNA分子的大小由其的所述長度可變區決定；每條所述的單鏈DNA分子的5’末端磷酸化，具體為每條所述的單鏈DNA分子的左側寡核苷酸自5’末端起第一位核苷酸的第5位碳原子上連接磷酸基團； 所述專用扣手探針由如下兩個探針組組成 探針組1由如下兩條所述單鏈DNA分子組成1)序列表中序列1所示的寡核苷酸；2)序列表中序列2所示的寡核苷酸； 探針組2由如下兩條所述單鏈DNA分子組成3)序列表中序列3所示的寡核苷酸；4)序列表中序列4所示的寡核苷酸。
5.用于檢測DNA插入或缺失多態性的專用扣手探針，所述專用扣手探針由a組探針組成，所述每一組探針對應一個待測DNA插入或缺失位點，所述單核苷酸多態性為一個待測 DNA插入或缺失位點存在b種多態性，所述每一組探針由b條權利要求1或2所述的單鏈DNA分子組成， b為大于等于2的自然數； a為大于等于1的自然數；所述每一條單鏈DNA分子的5’端左側寡核苷酸片段與待測插入或缺失位點的上游片段特異結合，所述每一條單鏈DNA分子的3’端右側寡核苷酸與待測插入或缺失位點的下游片段特異結合。
6.根據權利要求5所述的專用扣手探針，其特征在于 所述DNA的插入或缺失位點至少為2個；所述每條單鏈DNA分子的大小均不相同，所述的單鏈DNA分子的大小由其的所述長度可變區決定；每條所述的單鏈DNA分子的5’末端磷酸化，具體為每條所述的單鏈DNA分子的左側寡核苷酸自5’末端起第一位核苷酸的第5位碳原子上連接磷酸基團； 所述專用扣手探針由如下兩個探針組組成 探針組1由如下兩條所述單鏈DNA分子組成1)序列表中序列8所示的寡核苷酸；2)序列表中序列9所示的寡核苷酸； 探針組2由如下兩條所述單鏈DNA分子組成3)序列表中序列10所示的寡核苷酸；4)序列表中序列11所示的寡核苷酸。
7.含有權利要求1或2所述單鏈DNA分子或權利要求3-6中任一所述的專用扣手探針的試劑盒。
8.權利要求1或2所述單鏈DNA分子或權利要求3-6中任一所述的專用扣手探針在 DNA分子多態性鑒定中的應用；所述多態性為單核苷酸多態性或插入或缺失多態性； 所述單核苷酸多態性具體由至少兩個SNP位點引起的單核苷酸多態性； 所述插入或缺失多態性具體由至少2個插入或缺失位點引起的插入或缺失多態性； 所述至少兩個SNP位點引起的單核苷酸多態性具體為序列表中序列5所示DNA分子第 62位核苷酸的多態性和序列表中序列6所示DNA分子第174位核苷酸的多態性；所述序列表中序列5所示DNA分子第62位核苷酸的多態性為序列表中序列5所示DNA 分子的第62位核苷酸為A或G ；所述序列表中序列6所示DNA分子第174位核苷酸的多態性為序列表中序列6所示 DNA分子第174位核苷酸為T或C ；所述至少2個插入或缺失位點引起的插入或缺失多態性具體為1)和2)1)序列表中序列12所示的DNA分子自5，末端的第120-121位之間插入CCGTC得到序列表中的序列13所示的DNA分子；或序列表中序列13所示的DNA分子自5’末端的第 121-125位缺失CCGTC得到序列表中的序列12所示的DNA分子；2)序列表中序列15所示的DNA分子自5’末端的第116-117位插入GCCCAT得到序列表中的序列14所示的DNA分子；或序列表中序列14所示的DNA分子自5’末端的第117-122 位缺失GCCCAT得到序列表中的序列15所示的DNA分子。所述序列表中序列12所示DNA分子或序列13所示DNA分子與序列表中序列14所示 DNA分子或序列15所示DNA分子為大麥的兩個插入/缺失標記所在的DNA序列。
9.一種檢測生物基因組單核苷酸多態性的方法，包括如下步驟1)將權利要求3或4所述的專用扣手探針中的所有單鏈DNA分子與基因組片段連接環化，得到扣手探針的環化產物；2)以步驟1)得到的環化產物為模板進行PCR，根據得到PCR產物的大小確定生物基因組單核苷酸的多態性；步驟1)中，在所述連接環化之前，還包括將所述基因組片段打碎為80-250bp大小的 DNA分子；所述連接環化的體系包括連接緩沖液、連接酶、扣手探針、80-250bp大小的DNA片段， 所述連接酶在所述連接體系中的濃度為0. 04U/ul，所述每個扣手探針在所述連接體系中的濃度均為0. 04ng/ul，所述80-250bp大小的DNA分子在所述連接體系中的濃度為Mng/ul ； 步驟2)中，所述PCR的引物為所述單鏈DNA分子中的引物對區對應的能擴增所述單鏈 DNA分子的一對引物中的所述一條引物和所述另一條引物；所述一條引物的核苷酸序列為序列表中序列1的第48-67位或序列表中序列2的第 48-67位或序列表中序列3的第42-61位或序列表中序列4的第42-61位；所述另一條引物的反向互補片段的核苷酸序列為序列表中序列1的第觀-47位序列表中序列2的第觀-47位或序列表中序列3的第22-41位或序列表中序列4的第22-41位。
10.一種檢測生物基因組插入或缺失多態性的方法，包括如下步驟1)將權利要求5或6的所述的專用扣手探針的所有單鏈DNA分子與基因組片段連接環化，得到扣手探針環化產物；2)以步驟1)得到的環化產物為模板進行PCR，根據得到PCR產物確定生物基因組插入或缺失的多態性；步驟1)中，在所述連接環化之前，還包括將所述基因組片段打碎為80-250bp大小的 DNA分子；所述連接環化的體系包括連接緩沖液、連接酶、扣手探針、80-250bp大小的DNA片段， 所述連接酶在所述連接體系中的濃度為0. 04U/ul，所述每個扣手探針在所述連接體系中的濃度均為0. 04ng/ul，所述80-250bp大小的DNA分子在所述連接體系中的濃度為Mng/ul ； 步驟2)中，所述PCR的引物為所述單鏈DNA分子中的引物對區對應的能擴增所述單鏈 DNA分子的一對引物中的所述一條引物和所述另一條引物；所述一條引物的核苷酸序列為序列表中序列8的第44-63位或序列表中序列9的第 44-63位或序列表中序列10的第47-66位或序列表中序列11的第47-66位；。所述另一條引物的反向互補片段的核苷酸序列為序列表中序列8的第M-43位或序列表中序列9的第M-43位或序列表中序列10的第27-46位或序列表中序列11的第27-46 位。
全文摘要
本發明公開了一種多重檢測基因組DNA多態性的方法及其專用探針。本發明提供了一種單鏈DNA分子，從5′末端到3′末端依次由如下部分組成與待測DNA的5′端互補左側寡核苷酸片段、主體片段和與待測DNA的3′端互補右側寡核苷酸片段；本發明的實驗證明，本發明提供的單鏈DNA分子，通過連接酶反應區別出不同標記和不同等位位點，PCR擴增連接成功的不同長度的扣手探針，經過凝膠或毛細管電泳分離及檢測體系，實現同時檢測多個脫氧核糖核酸標記的多態性，能實現高的靈敏度和準確度，同時滿足高通量和低費用的要求。
文檔編號C12Q1/68GK102181443SQ20111012124
公開日2011年9月14日 申請日期2011年5月11日 優先權日2011年3月21日
發明者曹曉花, 漆小泉 申請人:中國科學院植物研究所