專利名稱：一株陰溝腸桿菌及其在制備2，3-丁二醇中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一株陰溝腸桿菌溶解亞種及其應用，尤其涉及一株高產2，3_ 丁二醇的陰溝腸桿菌溶解亞種及其在制備2，3_ 丁二醇中的應用，屬于生物工程技術領域。
背景技術：
2，3-丁二醇0，3-butanediol)是一種潛在的非常有價值的平臺化合物，廣泛用于醫藥、化工、食品、燃料以及航空航天等多個領域(CeliAska, E.，Grajek, W.，2009. Biotechnol. Adv. 27，715-725.)。左旋形式的2，3-丁二醇由于其具有較低的凝固點可以作為抗凍劑。2，3_丁二醇可以作為前體物質用于生產在化工領域具有極其廣泛用途的甲乙酮和1，3- 丁二烯。2，3- 丁二醇的燃燒值為27200kJ/kg，同乙醇相當Q9055kJ/kg)，是一種潛在價值很高的燃料添加劑。2，3- 丁二醇還可用來制備聚合物、油墨、香水、熏蒸劑、增濕劑、 軟化劑、增塑劑、炸藥以及藥物的手性載體等等。2，3-丁二醇如此廣泛的用途導致其在國際市場上的需求不斷上漲，作為液體燃料添加劑的研究也引起了世界的廣泛關注。2，3- 丁二醇的生產主要是微生物發酵法，與化學合成法相比，該方法環境友好，工藝簡單，技術上較為成熟，符合綠色化工的要求。細菌是對發酵生產2，3-丁二醇有工業價值的微生物。用于發酵生產2，3-丁二醇的細菌菌屬主要有克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、 沙雷氏菌屬Gerratia)、芽孢桿菌屬(Bacillus)和氣單胞菌屬(Aeromonas)等。關于腸桿菌屬(Enterobacter)生產2，3-丁二醇的報道較少，其2，3-丁二醇的產量均較低(中國專利 CN101709281A, CN101709280A ；Saha, B. C.，Bothast, R. J.，1999. Appl. Microbiol. Biotechnol. 52，321-326，趙世敏等，2008 年.食品與發酵工業.34 (3)，25-28)。經檢索，目前未見有使用陰溝腸桿菌溶解亞種發酵生產2，3_丁二醇的專利報道。
發明內容
針對現有技術的不足，本發明要解決的問題是提供一株高產2，3_ 丁二醇的陰溝腸桿菌溶解亞種(Enterobacter cloacae subsp. dissolvens)，及其所述菌在制備2，3_ 丁
二醇中的應用。本發明所述產2，3_ 丁二醇的陰溝腸桿菌溶解亞種，其特征在于該菌株名為陰溝腸桿菌溶角軍亞種(Enterobacter cloacae subsp. dissolvens) SDM，菌株已于 2010 年 10 月 19日保藏在“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”(簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所)，保藏號為CGMCC No. 4230。上述陰溝腸桿菌溶解亞種(Enterobacter cloacae subsp. dissolvens)菌株SDM是從山東濟南郊區的農田土壤中篩選得到。經德國Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(簡稱 DSMZ)鑒定，其生物學特征是革蘭氏陰性，兼性厭氧，具有運動性的棒桿菌，長1. 2 2. 5 μ m，寬0. 7 0. 8 μ m。 VP反應，ONPG反應，過氧化氫酶，尿酶，精氨酸雙水解酶，鳥氨酸脫羧酶呈陽性。甲基紅反應，氧化酶反應，明膠水解反應和吲哚產生反應呈陰性。其菌落顏色為黃白色，圓形、凸起、有光澤、表面光滑、直徑2 3mm。它可利用葡萄糖、果糖、甘露糖、麥芽糖、D-木糖、蔗糖、海藻糖、L-阿拉伯糖、鼠李糖、半乳糖、檸檬酸鹽和丙二酸鹽，37°C發酵葡萄糖產酸產氣。能在 KCN上生長。其16S rDNA序列如SEQ ID No. 1所示，序列長度為1504bp，所述序列與多株陰溝腸桿菌溶解亞種的16S rDNA序列比對相似性達到99. 9%。本發明所述由陰溝腸桿菌溶解亞種(Enterobacter cloacae subsp. dissolvens) SDMCGMCC No. 4230發酵生產2，3- 丁二醇的方法，其涉及的步驟是(1)菌種選擇。選陰溝腸桿菌溶解亞種(Enterobacter cloacae subsp. dissolvens) SDM CGMCC No. 4230。( 斜面培養活化將陰溝腸桿菌溶解亞種(Enterobacter cloacae subsp. dissolvens) SDM CGMCC No. 4230菌種接種于斜面培養基，30 40°C條件下，靜置培養10 14小時，備用；(3)搖瓶發酵種子培養將步驟( 培養的斜面菌株，在無菌條件下用接種環接 1 2環于40 60mL液體種子培養基的300mL三角瓶中，置于轉速為150 200rpm的搖床上，30 40°C培養10 16小時，得到種子培養液；(4)發酵罐發酵種子培養一級種子培養將步驟( 培養的斜面菌株，在無菌條件下用接種環接1 2環于 80 120mL液體種子培養基的500mL三角瓶中，置于轉速為150 200rpm的搖床上，30 40°C培養10 16小時，得到一級種子培養液；擴大培養將上述培養的一級種子，在無菌條件下以5 10% (體積比)的接種量接種于0. 8 1. 2升液體種子培養基的5升三角瓶中，置于轉速為150 200rpm的搖床上，30 40°C培養10 16小時，得到二級種子培養液；(5)發酵培養搖瓶發酵以5 10% (體積比)的接種量，將種子液接種于裝有80 120mL發酵培養基的500mL三角瓶瓶中，置于轉速為150 200rpm的搖床上，30 40°C培養16 30小時，當發酵液中2，3- 丁二醇濃度不再上升時，發酵停止。50升發酵罐發酵以體積比5 10%的接種量，將二級種子液接種于50升發酵罐中，發酵罐裝液量為30升，然后以初始碳源濃度為60 120g/L、溫度30 40°C、攪拌轉速 200 600rpm、通氣量0. 5 1. 5vvm進行通風攪拌發酵培養，培養時間為20 60小時；發酵液初始PH值調至5. 5 7. 0，發酵過程中，通過流加3 6M的KOH和2 5M的H3PO4來調節PH值，使之控制在pH5. 5 6. 5 ；發酵過程中，每隔3 5小時取樣測定發酵液中的殘糖量和2，3- 丁二醇濃度，并依據殘糖濃度流加碳源，當2，3- 丁二醇濃度不再上升時，發酵結束。上述斜面培養基組成為葡萄糖15g/L，蛋白胨4g/L，酵母膏4g/L，氯化鈉2g/L， 氯化鉀2g/L，硫酸鎂1. 5g/L，瓊脂粉18g/L，pH值調至5. 5 7. 0，蒸餾水配制，115°C滅菌 20分鐘；上述種子培養基組成為碳源30 40g/L，磷酸二氫鉀3 10g/L，氯化銨3 12g/L，氯化鈉1 4g/L，硫酸鎂0. 05 0. lg/L，硫酸亞鐵0. 05 0. lg/L，pH值調至5. 5 7. 0，蒸餾水配制，115°C滅菌20分鐘；
上述發酵培養基組成為碳源60 120g/L，玉米漿干粉5 20g/L，磷酸二氫鉀 3 10g/L，氯化銨5 25g/L，乙酸鉀1 4g/L，氯化鈉1 4g/L，氯化鈣0. 05 0. Ig/ L，硫酸鎂0. 1 0. 5g/L，硫酸鋅0. 2 0. 6g/L，硫酸亞鐵0. 2 0. 6g/L，pH值調至5. 5 7. 0，自來水配制，115°C滅菌20分鐘；上述50升發酵罐發酵培養中流加方式優選脈沖流加，其方法是當糖濃度降到 10 30g/L時，脈沖流加底物，使糖濃度達到50 70g/L。上述種子培養基中的碳源至少含有葡萄糖或木糖。上述發酵培養基中的碳源至少含有葡萄糖、木糖、蔗糖糖蜜、木糖母液、淀粉類原料水解液、木質纖維素原料水解液中的一種；該碳源單獨滅菌，無需調節PH。其中，所述淀粉類原料水解液以如下方法制得取淀粉類原料，以2 8U/g淀粉類原料干重的酶用量加入α -淀粉酶，95°C處理0.證，得到淀粉類原料液化液，然后調pH至4. 2，加入糖化酶，糖化酶的添加量為100 1000U/g淀粉類原料干重，置于60°C水浴搖床中處理至葡萄糖徹底水解，得含糖濃度以質量體積比計為15% 40%的淀粉類原料水解液；所述木質纖維素原料水解液以如下方法制得取粉碎的木質纖維素原料，以質量體積比計，按木質纖維素原料 質量分數為硫酸=1 10 1 3的量加入硫酸，120°C處理1小時，常規離心，上清液即為含糖濃度以質量體積比計為15% 35%的木質纖維素原料水解液。上述淀粉類原料優選淀粉或木薯粉；木質纖維素原料優選木頭、玉米芯或秸稈。上述淀粉類原料水解液中糖濃度以質量體積比計優選為25% 35%;上述木質纖維素原料水解液中糖濃度以質量體積比計優選為25% 30%。上述的應用中，步驟⑵、(3)、⑷、(5)所述培養溫度優選37 士 0. 2°C ；上述的應用中，步驟(2)所述培養時間優選12小時；上述的應用中，步驟(3)所述培養時間優選12 14小時；上述的應用中，步驟(4)所述培養時間優選12 14小時；上述的應用中，步驟( 所述50升發酵罐發酵培養基初始糖濃度優選60 80g/ L0上述的應用中，步驟(5)所述50升發酵罐發酵液pH優選6.0 士 0.2。本發明的顯著特點是從農田土層中篩選得到一株具有發酵潛力的產2，3_ 丁二醇的菌株，經鑒定為陰溝腸桿菌溶解亞種，命名為陰溝腸桿菌溶解亞種(Enterobacter cloacae subsp. dissolvens)SDMCGMCC No. 4230。本發明的用于發酵制備2，3- 丁二醇的菌株陰溝腸桿菌溶解亞種(EntercAacter cloacae subsp. dissolvens) SDM CGMCC No. 4230，具有轉化率高，產物濃度高，底物譜廣等特點，可以穩定地進行2，3- 丁二醇的發酵生產，發酵罐補料分批發酵2，3- 丁二醇的產量能夠達到125 162g/L，2，3- 丁二醇生產率最大為4. lg/(L · h)，轉化率達到理論轉化率的 90 95%，極具工業化應用潛力。
具體實施例方式一般性說明取淀粉類原料，以2 8U/g淀粉類原料干重的酶用量加入α-淀粉酶，95°C處理0. 5h，得到淀粉類原料液化液，然后調pH至4. 2，加入糖化酶，糖化酶的添加量為100 1000U/g淀粉類原料干重，置于60°C水浴搖床中處理至葡萄糖徹底水解，得含糖濃度以質量體積比計為15% 40%的淀粉類原料水解液。上述淀粉類原料優選淀粉或木薯粉。同步糖化發酵底物的準備將α -淀粉酶液化好的淀粉類原料液化液115°C滅菌 20分鐘，用于下一步的同步糖化發酵。木質纖維素原料水解液的制備取粉碎的直徑在0. 45 0. 9mm的木質纖維素原料，以質量體積比計，按木質纖維素原料質量分數為硫酸=1 10 1 3的量加入硫酸，120°C處理1小時，常規離心，上清液即為含糖濃度以質量體積比計為15% 35%的木質纖維素原料水解液。上述木質纖維素原料優選木頭、玉米芯或秸稈。上述淀粉類原料水解液中糖濃度以質量體積比計優選為25% 35%;上述木質纖維素原料水解液中糖濃度以質量體積比計優選為25% 30%。木質纖維素原料水解液成分以及總糖分析方法參考(Wang AL, et al. Appl Microbiol Biotechnol，2010，87 :965-970)。葡萄糖購自濟南市歷城區昌英達化工經營部，木糖購自濟南圣泉唐和唐生物科技有限公司，玉米芯、木糖母液購自山東龍力生物科技股份有限公司，蔗糖糖蜜購自廣西華商國糖貿易有限公司，木薯粉購自上海祥亨貿易有限公司。葡萄糖的測定方法為發酵液稀釋后離心，采用生物傳感分析儀SBA_40C(山東省科學院生物研究所)測定。測定原理為利用固定化葡萄糖脫氫酶膜專一性測定葡萄糖含量。木糖檢測方法為=Agilent 1100高效液相色譜儀，G1311A四元泵，示差折光分析檢測器，進樣量10 μ L。Agilent HPLC 2D色譜工作站。色譜柱為ZORBAX碳水化合物分析柱6 X 150mm)，柱溫30 50°C，流動相為乙腈水=80 20 (ν/ν)，流速1. 2mL/min。以保留時間定性，外標法定量。2，3- 丁二醇的測定方法VARIAN CP-3380氣相色譜儀檢測。乙酸丁酯為萃取劑， 體積比1 1萃取，取上層有機相檢測。具體測定的條件是火焰離子監測器(FID)溫度為 280°C，進樣器溫度為220°C，而毛細管柱溫是從50°C升溫到180°C，升溫速度20°C /min，載氣為氮氣。利用2，3-丁二醇標準品(德國Sigma-Aldrich公司，貨號361461)做出標準曲線，再根據標準曲線計算出發酵液中2，3-丁二醇的含量。實施例 1 陰溝腸桿菌溶解亞種(Enterobacter cloacae subsp. dissolvens) SDM CGMCC No. 4230的分離篩選及鑒定該實施例中所用的培養基的組成如下液體篩選培養基葡萄糖50g/L，乙酸鈉5g/L，氯化鉀0. 5g/L，硫酸鎂0. 15g/L，七水硫酸亞鐵0. 05g/l，七水硫酸錳0. 03g/l, pH為7。固體篩選養基液體篩選培養基，瓊脂粉18g/l，pH為7。發酵培養基葡萄糖100g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨10g/L，乙酸鈉5g/L，pH為7。營養肉湯培養基葡萄糖50g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨10g/L，氯化鈉5g/L，pH為 7。
該實施例的具體操作過程如下1、分離篩選從農田取得土壤，取Ig加入裝有50mL滅菌的液體篩選培養基的300mL三角瓶中， 在37°C條件下，置于搖床上以120rpm的轉速培養48小時。取Iml培養液轉接到相同的液體篩選培養基中相同條件下培養46小時。將培養液以10_3、10_4兩個稀釋度涂布在固體篩選養基的培養皿中，37°C培養20小時，待長出單菌落后，挑選菌落面積大的菌落，接種到發酵培養基中，置于搖床上以ISOrpm的轉速，37°C培養20小時，通過VP反應進行初篩，根據反應時間和顏色變化篩選出陽性菌株。然后測定初篩的陽性菌株的2，3-丁二醇的產量，獲得產量最高的菌株。2、菌株的鑒定將上述篩選得到的菌株在德國 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(簡稱DSMZ)進行鑒定，鑒定結果表明該菌為革蘭氏陰性，兼性厭氧， 具有運動性的棒桿菌，長1. 2 2. 5 μ 1，寬0. 7 0. 8 μ 1。VP反應，ONPG反應，過氧化氫酶，尿酶，精氨酸雙水解酶，鳥氨酸脫羧酶呈陽性。甲基紅反應，氧化酶反應，明膠水解反應和吲哚產生反應呈陰性。其菌落顏色為黃白色，圓形、凸起、有光澤、表面光滑、直徑 2 3mm。它可利用葡萄糖、果糖、甘露糖、麥芽糖、D-木糖、蔗糖、海藻糖、L-阿拉伯糖、鼠李糖、半乳糖、檸檬酸鹽和丙二酸鹽，37°C發酵葡萄糖產酸產氣。能在KCN上生長。其16S rDNA序列如SEQ ID No. 1所示，序列長度為1504bp，所述序列與多株陰溝腸桿菌溶解亞種的16S rDNA序列比對相似性達到99.9%。綜合分析，菌株鑒定為陰溝腸桿菌溶解亞種 (Enterobacter cloacae subsp. dissolvens)，|名為陰溝角軍亞禾中(Enterobacter cloacae subsp. dissolvens)SDM0上述菌株陰溝腸桿菌溶解亞種(Enterobacter cloacae ssp. dissolvens) SDM 已于2010年10月19日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱 CGMCC)，保藏地址北京市朝陽區北辰西路1號院中科院微生物研究所，郵政編碼100101， 其保藏編號為CGMCC No. 4230。實施例2、利用陰溝腸桿菌溶解亞種(Enterobacter cloacae subsp. dissolvens) SDMCGMCC No. 4230以葡萄糖為碳源發酵生產2，3- 丁二醇應用方法涉及的步驟順序如下(1)菌種選擇選用陰溝腸桿菌溶解亞種(Enterobacter cloacae subsp. dissolvens)SDM CGMCC No. 4230 ；(2)斜面培養將菌種接種于斜面培養基上，37°C條件下，靜置培養12小時；(3)種子培養—級種子培養將步驟(2)培養的菌株，在無菌條件下用接種環接2環于IOOmL液體種子培養基的500mL三角瓶中，置于轉速為150rpm的搖床上，37°C培養12小時，得到一級種子培養液；擴大培養將上述培養的一級種子，在無菌條件下以10% (體積比)的接種量接種于1升液體種子培養基的5升三角瓶中，置于轉速為150rpm的搖床上，37°C培養12小時， 得到二級種子培養液；(4)發酵培養德國貝朗(BI0STAT B, B. Braun) 50升發酵罐中加入30升發酵初始培養基。在發酵培養基中接入3升二級種子培養液，發酵罐攪拌轉速400rpm，37°C條件下發酵50小時。每隔3小時取樣測定發酵液中的殘糖量和2，3_ 丁二醇濃度。發酵過程中脈沖補加葡萄糖，使發酵液中的葡萄糖濃度維持在20 40g/L。(5)測定分析取上述發酵液，8，OOOrpm離心5分鐘，取上清液稀釋合適倍數檢測發酵液中2，3-丁二醇濃度、葡萄糖濃度，計算糖轉化率、2，3-丁二醇生產率。發酵結束，測得葡萄糖的濃度為2. 7士0. 5g/L(平均值士標準差)，2，3_ 丁二醇濃度161. 3士0. 7g/L(平均值士標準差)，糖轉化率達到理論轉化率的92. 1 士0. 8% (平均值士標準差)，2，3_ 丁二醇生產率為3. 23士0. Olg/(L · h)(平均值士標準差)。 上述斜面培養基組成為葡萄糖15g/L，蛋白胨4g/L，酵母膏4g/L，氯化鈉2g/L，氯化鉀2g/L，硫酸鎂1. 5g/L，瓊脂粉18g/L，pH值調至6. 0，蒸餾水配制，115°C滅菌20分鐘；上述種子培養基組成為葡萄糖40g/L，磷酸二氫鉀8g/L，氯化銨5g/L，氯化鈉Ig/ L，硫酸鎂0. 05g/L，硫酸亞鐵0. 05g/L, pH值調至6. 0，蒸餾水配制，115°C滅菌20分鐘；上述發酵培養基組成為葡萄糖65g/L，玉米漿干粉6g/L，磷酸二氫鉀4g/L，氯化銨20g/L，乙酸鉀4g/L，氯化鈉2g/L，氯化鈣0. 08g/L，硫酸鎂0. 4g/L，硫酸鋅0. 3g/L，硫酸亞鐵0. 3g/L，pH值調至6. 0,自來水配制，115°C滅菌20分鐘；葡萄糖單獨滅菌。實施例3、利用陰溝腸桿菌溶解亞種(Enterobacter cloacae subsp. dissolvens) SDMCGMCC No. 4230以木糖為碳源發酵生產2，3- 丁二醇應用方法涉及的步驟順序如下(1)菌種選擇選用陰溝腸桿菌溶解亞種(Enterobacter cloacae subsp. dissolvens)SDM CGMCC No. 4230 ；(2)斜面培養將菌種接種于斜面培養基上，35°C條件下，靜置培養12小時；(3)種子培養—級種子培養將步驟(2)培養的菌株，在無菌條件下用接種環接2環于IOOmL液體種子培養基的500mL三角瓶中，置于轉速為150rpm的搖床上，35°C培養12小時，得到一級種子培養液；擴大培養將上述培養的一級種子，在無菌條件下以10% (體積比)的接種量接種于1升液體種子培養基的5升三角瓶中，置于轉速為150rpm的搖床上，35°C培養12小時， 得到二級種子培養液；(4)發酵培養德國貝朗(BI0STAT B,B. Braun) 50升發酵罐中加入30升發酵培養基。在發酵培養基中接入3升二級種子培養液，發酵罐攪拌轉速300rpm，35°C條件下發酵 24小時。每隔3小時取樣測定發酵液中的殘糖量和2，3_ 丁二醇濃度。(5)測定分析取上述發酵液，8，OOOrpm離心5分鐘，取上清液稀釋合適倍數檢測發酵液中2，3- 丁二醇濃度、木糖濃度，計算糖轉化率、2，3- 丁二醇生產率。發酵結束，測得木糖的濃度為2. 5士0. 2g/L(平均值士標準差)，2，3_ 丁二醇濃度 53.6士0.98/1(平均值士標準差)，糖轉化率達到理論轉化率的91.2 士 1.5% (平均值士標準差)，2，3_ 丁二醇生產率為2. 23士0. 04g/(L · h)(平均值士標準差)。上述斜面培養基組成為葡萄糖15g/L，蛋白胨4g/L，酵母膏4g/L，氯化鈉2g/L，氯化鉀2g/L，硫酸鎂1. 5g/L，瓊脂粉18g/L，pH值調至7. 0，蒸餾水配制，115°C滅菌20分鐘；上述種子培養基組成為木糖40g/L，磷酸二氫鉀6g/L，氯化銨5g/L，氯化鈉3g/L，
9硫酸鎂0. lg/L，硫酸亞鐵0. lg/L，pH值調至7. 0，蒸餾水配制，115°C條件下滅菌20分鐘；上述發酵培養基組成為木糖120g/L，玉米漿干粉15g/L，磷酸二氫鉀7g/L，氯化銨15g/L，乙酸鉀4g/L，氯化鈉2g/L，氯化鈣0. 075g/L,硫酸鎂0. 2g/L，硫酸鋅0. 4g/L，硫酸亞鐵0. 2g/L，pH值調至7. 0,自來水配制，115°C滅菌20分鐘；木糖單獨滅菌。實施 列4、禾Ij用陰溝腸桿菌溶角軍亞禾中(Enterobacter cloacae subsp. dissolvens) SDMCGMCC No. 4230以蔗糖糖蜜為碳源發酵生產2，3- 丁二醇應用方法涉及的步驟順序如下(1)菌種選擇選用陰溝腸桿菌溶解亞種(Enterobacter cloacae subsp. dissolvens)SDM CGMCC No. 4230 ；(2)斜面培養將菌種接種于斜面培養基上，40°C條件下，靜置培養10小時；(3)種子培養一級種子培養將步驟(2)培養的菌株，在無菌條件下用接種環接2環于IOOmL液體種子培養基的500mL三角瓶中，置于轉速為150rpm的搖床上，40°C培養12小時，得到一級種子培養液；擴大培養將上述培養的一級種子，在無菌條件下以10% (體積比)的接種量接種于1升液體種子培養基的5升三角瓶中，置于轉速為150rpm的搖床上，40°C培養13小時， 得到二級種子培養液；(4)發酵培養德國貝朗(BI0STAT B, B. Braun) 50升發酵罐中加入30升發酵初始培養基。在發酵培養基中接入3升二級種子培養液，發酵罐攪拌轉速600rpm，40°C條件下發酵40小時。其中，發酵到5小時，開始脈沖流加總糖濃度以質量體積比計為55%的蔗糖糖蜜。每隔4小時取樣測定發酵液中的殘糖量和2，3_ 丁二醇濃度。當發酵液中總糖濃度降到20g/L左右時，脈沖流加蔗糖糖蜜使總糖濃度到50g/L左右。(5)測定分析取上述發酵液，8，OOOrpm離心5分鐘，取上清液稀釋合適倍數檢測發酵液中2，3- 丁二醇濃度、總糖濃度，計算2，3- 丁二醇生產率。發酵結束，測得總糖的濃度為3. 1 士0. 6g/L(平均值士標準差)，2，3_ 丁二醇濃度 112. 4士2. 2g/L(平均值士標準差)，2，3_ 丁二醇生產率為2.81士0. 06g/(L · h)(平均值士標準差)。上述斜面培養基組成為葡萄糖15g/L，蛋白胨4g/L，酵母膏4g/L，氯化鈉2g/L，氯化鉀2g/L，硫酸鎂1. 5g/L，瓊脂粉18g/L，pH值調至6. 5，蒸餾水配制，115°C滅菌20分鐘；上述種子培養基組成為葡萄糖35g/L，磷酸二氫鉀6g/L，氯化銨8g/L，氯化鈉3g/ L，硫酸鎂0. 06g/L，硫酸亞鐵0. 08g/L, pH值調至6. 5，蒸餾水配制，115°C滅菌20分鐘；上述發酵培養基組成為總糖濃度以質量體積比計為55%的蔗糖糖蜜100g/L，玉米漿干粉8g/L，磷酸二氫鉀12g/L，氯化銨12g/L，乙酸鉀4g/L，氯化鈉3g/L，氯化鈣0. 05g/ L，硫酸鎂0. 3g/L，硫酸鋅0. 4g/L，硫酸亞鐵0. 4g/L，自來水配制，該發酵培養基的初始pH為 6. 5，115°C滅菌20分鐘；蔗糖糖蜜單獨滅菌。實施例5、利用陰溝腸桿菌溶解亞種(Enterobacter cloacae subsp. dissolvens) SDMCGMCC No. 4230以木糖母液為碳源發酵生產2，3- 丁二醇應用方法涉及的步驟順序如下(1)菌種選擇選用陰溝腸桿菌溶解亞種(Enterobacter cloacae subsp.dissolvens)SDM CGMCC No. 4230 ；(2)斜面培養將菌種接種于斜面培養基上，30°C條件下，靜置培養14小時；(3)種子培養一級種子培養將步驟(2)培養的菌株，在無菌條件下用接種環接2環于IOOmL液體種子培養基的500mL三角瓶中，置于轉速為150rpm的搖床上，37°C培養12小時，得到一級種子培養液；擴大培養將上述培養的一級種子，在無菌條件下以10% (體積比)的接種量接種于1升液體種子培養基的5升三角瓶中，置于轉速為150rpm的搖床上，37°C培養13小時， 得到二級種子培養液；(4)發酵培養德國貝朗(BI0STAT B, B. Braun) 50升發酵罐中加入30升發酵初始培養基。在發酵培養基中接入3升二級種子培養液，發酵罐攪拌轉速400rpm，37°C條件下發酵44小時。其中，發酵到5小時，開始脈沖流加總糖濃度以質量體積比計為68%的木糖母液。每隔4小時取樣測定發酵液中的殘糖量和2，3_ 丁二醇濃度。當發酵液中總糖濃度降到20g/L左右時，脈沖流加木糖母液使總糖濃度到50g/L左右。(5)測定分析取上述發酵液，8，OOOrpm離心5分鐘，取上清液稀釋合適倍數檢測發酵液中2，3- 丁二醇濃度、總糖濃度，計算2，3- 丁二醇生產率。發酵結束，測得總糖的濃度為4. 7士0. 8g/L (平均值士標準差)，2，3_ 丁二醇濃度 67.9士1.78/1(平均值士標準差)，2，3-丁二醇生產率為1. M士0. 04g/(L *h)(平均值士標準差)。上述斜面培養基組成為葡萄糖15g/L，蛋白胨4g/L，酵母膏4g/L，氯化鈉2g/L，氯化鉀2g/L，硫酸鎂1. 5g/L，瓊脂粉18g/L，pH值調至6. 5，蒸餾水配制，115°C滅菌20分鐘；上述種子培養基組成為木糖35g/L，磷酸二氫鉀6g/L，氯化銨8g/L，氯化鈉3g/L， 硫酸鎂0. 06g/L，硫酸亞鐵0. 08g/L, pH值調至6. 5，蒸餾水配制，115°C滅菌20分鐘；上述發酵培養基組成為總糖濃度以質量體積比計為68%的木糖母液90g/L，玉米漿干粉10g/L，磷酸二氫鉀10g/L，氯化銨5g/L，乙酸鉀4g/L，氯化鈉3g/L，氯化鈣0. 05g/ L，硫酸鎂0. 3g/L，硫酸鋅0. 4g/L，硫酸亞鐵0. 4g/L，自來水配制，該發酵培養基的初始pH為 6. 5，115°C滅菌20分鐘；木糖母液單獨滅菌。實施例6、利用陰溝腸桿菌溶解亞種(Enterobacter cloacae subsp. dissolvens) SDMCGMCC No. 4230以木薯粉水解液為碳源發酵生產2，3- 丁二醇應用方法涉及的步驟順序如下(1)菌種選擇選用陰溝腸桿菌溶解亞種(Enterobacter cloacae subsp. dissolvens)SDM CGMCC No. 4230 ；(2)斜面培養將菌種接種于斜面培養基上，40°C條件下，靜置培養12小時；(3)種子培養:—級種子培養將步驟(2)培養的菌株，在無菌條件下用接種環接2環于IOOmL液體種子培養基的500mL三角瓶中，置于轉速為150rpm的搖床上，40°C培養12小時，得到一級種子培養液；擴大培養將上述培養的一級種子，在無菌條件下以10% (體積比)的接種量接種于1升液體種子培養基的5升三角瓶中，置于轉速為150rpm的搖床上，40°C培養13小時，得到二級種子培養液；(4)發酵培養德國貝朗(BI0STAT B,B. Braun) 50升發酵罐中加入30升發酵初始培養基。在發酵培養基中接入3升二級種子培養液，發酵罐攪拌轉速400rpm，40°C條件下發酵51小時。每隔3小時取樣測定發酵液中的殘糖量和2，3_ 丁二醇濃度。根據殘糖濃度來脈沖流加總糖濃度為320g/L的木薯粉水解液，維持糖濃度在40 80g/L。(5)測定分析取上述發酵液，8，OOOrpm離心5分鐘，取上清液稀釋合適倍數檢測發酵液中2，3- 丁二醇濃度、糖濃度，計算糖轉化率、2，3- 丁二醇生產率。發酵結束，測得葡萄糖的濃度為4. 0士0. 4g/L (平均值士標準差)，2，3_ 丁二醇濃度58.3士 1.5g/L(平均值士標準差)，糖轉化率達到理論轉化率的70. 6士 1.6% (平均值士標準差)，2，3_ 丁二醇生產率為1. 14士0. 03g/(L · h)(平均值士標準差)。上述斜面培養基組成為葡萄糖15g/L，蛋白胨4g/L，酵母膏4g/L，氯化鈉2g/L，氯化鉀2g/L，硫酸鎂1. 5g/L，瓊脂粉18g/L，pH值調至7. 0，蒸餾水配制，115°C滅菌20分鐘；上述種子培養基組成為葡萄糖40g/L，磷酸二氫鉀6g/L，氯化銨5g/L，氯化鈉3g/ L，硫酸鎂0. lg/L，硫酸亞鐵0. lg/L，pH值調至7.0，蒸餾水配制，115°C條件下滅菌20分鐘；上述發酵培養基組成為總糖濃度為320g/L的木薯粉水解液100g/L，玉米漿干粉 15g/L,磷酸二氫鉀3g/L，氯化銨5g/L，乙酸鉀4g/L，氯化鈉2g/L，氯化鈣0. 075g/L,硫酸鎂 0. 2g/L，硫酸鋅0. 4g/L，硫酸亞鐵0. 2g/L，pH值調至7. 0，自來水配制，115°C滅菌20分鐘。實施例 7 利用陰溝腸桿菌溶解亞種(Enterobacter cloacae subsp. dissolvens) SDMCGMCC No. 4230以淀粉水解液為碳源同步糖化發酵生產2，3-丁二醇應用方法涉及的步驟順序如下(1)菌種選擇選用陰溝腸桿菌溶解亞種(Enterobacter cloacae subsp. dissolvens)SDM CGMCC No. 4230 ；(2)斜面培養將菌種接種于斜面培養基上，40°C條件下，靜置培養12小時；(3)種子培養一級種子培養將步驟(2)培養的菌株，在無菌條件下用接種環接2環于IOOmL液體種子培養基的500mL三角瓶中，置于轉速為150rpm的搖床上，40°C培養12小時，得到一級種子培養液；擴大培養將上述培養的一級種子，在無菌條件下以10% (體積比)的接種量接種于1升液體種子培養基的5升三角瓶中，置于轉速為150rpm的搖床上，40°C培養13小時， 得到二級種子培養液；(4)淀粉處理及同步糖化分批發酵培養基的制備將350g淀粉加水調制成淀粉漿定容至1L，調節pH至6. 0，按加酶量為3U/g淀粉干重加入α -淀粉酶，在95°C條件下蒸煮4小時，得到淀粉液化液，115°C滅菌20分鐘，冷卻后作為碳源，用于制備進行同步糖化分批發酵的發酵培養基；(5)50升發酵罐同步糖化分批發酵生產2，3- 丁二醇無菌條件培養好的陰溝腸桿菌溶角軍亞種(Enterobacter cloacae subsp. dissolvens) SDM CGMCC No. 4230種子液按體積比為5%的接種量接入滅菌的發酵培養基， 同時補加過濾除菌的糖化酶，糖化酶添加量為200U/g淀粉干重；發酵罐總裝液量為30L，以發酵溫度為37°C，攪拌轉速為350rpm，通氣量為1. Ovvm進行發酵；發酵初始pH值為6. 5，發酵過程中PH值控制在PH 6.0;發酵時間為40小時。每隔5小時取樣測定發酵液中的殘糖量和2，3-丁二醇濃度。發酵過程中加入滅菌的淀粉液化液和過濾除菌的糖化酶，糖化酶添加量為200U/g淀粉干重，保持發酵液中葡萄糖濃度在15 40g/L。(6)測定分析取上述發酵液，8，OOOrpm離心5分鐘，取上清液稀釋合適倍數檢測發酵液中2，3- 丁二醇濃度、糖濃度，計算糖轉化率、2，3- 丁二醇生產率。發酵結束，測得總糖的濃度為3. 6士0. 4g/L(平均值士標準差)，2，3_ 丁二醇濃度 82. 5士 1.7g/L(平均值士標準差)，2，3-丁二醇生產率為2. 06士0. 04g/(L *h)(平均值士標準差)。上述斜面培養基組成為葡萄糖15g/L，蛋白胨4g/L，酵母膏4g/L，氯化鈉2g/L，氯化鉀2g/L，硫酸鎂1. 5g/L，瓊脂粉18g/L，pH值調至6. 5，蒸餾水配制，115°C滅菌20分鐘；上述種子培養基組成為葡萄糖30g/L，磷酸二氫鉀3g/L，氯化銨8g/L，氯化鈉4g/ L，硫酸鎂0. lg/L，硫酸亞鐵0. 05g/L, pH值調至6. 5，蒸餾水配制，115°C滅菌20分鐘；上述發酵培養基組成為淀粉液化液，其用量為500mL/L，玉米漿干粉7g/L，磷酸二氫鉀6g/L，氯化銨15g/L，乙酸鉀4g/L，氯化鈉3g/L，氯化鈣0. lg/L,硫酸鎂0. 4g/L，硫酸鋅0. 2g/L，硫酸亞鐵0. 2g/L，自來水配制，該發酵培養基的初始pH為6. 5，115°C滅菌20分鐘；淀粉液化液單獨滅菌。
1權利要求
1.一株產2，3-丁二醇的陰溝腸桿菌溶解亞種，其特征在于該菌株名為陰溝腸桿菌溶解亞種(Enterobacter cloacae subsp. dissolvens) SDM，菌株已于 2010 年 10 月 19 日保藏在“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，保藏號為CGMCC No. 4230。
2.權利要求1所述陰溝腸桿菌溶解亞種在制備2，3-丁二醇中的應用，其特征在于由陰溝腸桿菌溶解亞種(Enterobacter cloacae subsp. dissolvens) SDM CGMCC No. 4230 發酵生產2，3- 丁二醇；其中涉及的方法是斜面 舌化培養>lf陰溝腸桿菌溶角軍亞禾中(Enterobacter cloacae subsp. dissolvens) SDMCGMCC No. 4230菌種接種于斜面培養基，30 40°C條件下，靜置培養10 14小時，備用；搖瓶發酵種子培養將上述培養的斜面菌株，在無菌條件下用接種環接1 2環于 40 60mL液體種子培養基的300mL三角瓶中，置于轉速為100 200rpm的搖床上，30 40°C培養10 16小時，得到種子培養液； 發酵罐發酵種子培養一級種子培養將上述培養的斜面菌株，在無菌條件下用接種環接1 2環于80 120mL液體種子培養基的500mL三角瓶中，置于轉速為100 200rpm的搖床上，30 40°C 培養10 16小時，得到一級種子培養液；擴大培養將上述培養的一級種子，在無菌條件下以體積比5 10%的接種量接種于 0. 8 1. 2升液體種子培養基的5升三角瓶中，置于轉速為100 200rpm的搖床上，30 40°C培養10 16小時，得到二級種子培養液； 發酵培養搖瓶發酵以體積比5 10%的接種量，將種子液接種于裝有80 120mL發酵培養基的500mL三角瓶瓶中，置于轉速為100 200rpm的搖床上，30 40°C培養16 30小時， 當發酵液中2，3-丁二醇濃度不再上升時，發酵停止；50升發酵罐發酵以體積比5 10%的接種量，將二級種子液接種于50升發酵罐中， 發酵罐裝液量為30升，然后以初始碳源濃度為60 120g/L、溫度30 40°C、攪拌轉速 200 600rpm、通氣量0. 5 1. 5vvm進行通風攪拌發酵培養，培養時間為20 60小時；發酵液初始PH值調至5. 5 7. 0，發酵過程中，通過流加3 6M的KOH和2 5M的H3PO4來調節PH值，使之控制在pH 5. 5 6. 5 ；發酵過程中，每隔3 5小時取樣測定發酵液中的糖殘量和2，3- 丁二醇濃度，并依據底物的濃度流加底物，當發酵液中2，3- 丁二醇濃度不再上升時，發酵結束；其中上述培養中涉及的培養基及配方是斜面培養基組成為葡萄糖15g/L，蛋白胨4g/L，酵母膏4g/L，氯化鈉2g/L，氯化鉀2g/ L，硫酸鎂1. 5g/L，瓊脂粉18g/L，pH值調至5. 5 7. 0，蒸餾水配制，115°C滅菌20分鐘；種子培養基組成為碳源30 40g/L，磷酸二氫鉀3 10g/L，氯化銨3 12g/L，氯化鈉1 4g/L，硫酸鎂0. 05 0. lg/L，硫酸亞鐵0. 05 0. lg/L，pH值調至5. 5 7. 0，蒸餾水配制，115 °C滅菌20分鐘；發酵培養基組成為碳源60 120g/L，玉米漿干粉5 20g/L，磷酸二氫鉀3 IOg/ L,氯化銨5 25g/L，乙酸鉀1 4g/L，氯化鈉1 4g/L，氯化鈣0. 05 0. lg/L,硫酸鎂 0. 1 0. 5g/L，硫酸鋅0. 2 0. 6g/L，硫酸亞鐵0. 2 0. 6g/L，pH值調至5. 5 7. 0，自來水配制，115 °C滅菌20分鐘。
3.如權利要求2所述陰溝腸桿菌溶解亞種在制備2，3-丁二醇中的應用，其特征在于 所述50升發酵罐發酵培養中流加方式為脈沖流加。
4.如權利要求3所述陰溝腸桿菌溶解亞種在制備2，3-丁二醇中的應用，其特征在于 所述脈沖流加的方式是當糖濃度降到10 30g/L時，脈沖流加底物，使糖濃度達到50 70g/L。
5.如權利要求2所述陰溝腸桿菌溶解亞種在制備2，3-丁二醇中的應用，其特征在于 所述種子培養基中的碳源至少含有葡萄糖或木糖。
6.如權利要求2所述陰溝腸桿菌溶解亞種在制備2，3-丁二醇中的應用，其特征在于 所述發酵培養基中的碳源至少含有葡萄糖、木糖、蔗糖糖蜜、木糖母液、淀粉類原料水解液、 木質纖維素原料水解液中的一種；該碳源單獨滅菌，無需調節PH ；其中，所述淀粉類原料水解液以如下方法制得取淀粉類原料，以2 8U/g淀粉類原料干重的酶用量加入α -淀粉酶，95°C處理0.證，得到淀粉類原料液化液，然后調pH至4. 2，加入糖化酶，糖化酶的添加量為100 1000U/g淀粉類原料干重，置于60°C水浴搖床中處理至葡萄糖徹底水解，得含糖濃度以質量體積比計為15% 40%的淀粉類原料水解液；所述木質纖維素原料水解液以如下方法制得取粉碎的木質纖維素原料，以質量體積比計，按木質纖維素原料質量分數為硫酸=1 10 1 3的量加入硫酸，120°C處理1小時，常規離心，上清液即為含糖濃度以質量體積比計為15% 35%的木質纖維素原料水解液。
7.如權利要求6所述陰溝腸桿菌溶解亞種在制備2，3-丁二醇中的應用，其特征在于 所述淀粉類原料選淀粉或木薯粉；所述木質纖維素原料選木頭、玉米芯或秸稈。
8.如權利要求6所述陰溝腸桿菌溶解亞種在制備2，3-丁二醇中的應用，其特征在于 所述淀粉類原料水解液中糖濃度以質量體積比計為25% 35%;所述木質纖維素原料水解液中糖濃度以質量體積比計為25% 30%。
全文摘要
本發明公開了一株陰溝腸桿菌溶解亞種(Enterobacter cloacae subsp.dissolvens SDM)及其在制備2，3-丁二醇中的應用。該陰溝腸桿菌溶解亞種保藏號為CGMCC No.4230。本發明的菌株能夠利用五碳糖、六碳糖、糖蜜、淀粉類原料水解液、木質纖維素原料水解液，具有轉化率高，產物濃度高，底物譜廣等優點。本發明所述操作方法簡單，成本較低，效率高，發酵罐補料分批發酵2，3-丁二醇產量可達到125～162g/L，轉化率達到理論轉化率的90～95％，2，3-丁二醇最大生產率為4.1g/(L·h)，極具工業化推廣應用前景。
文檔編號C12R1/01GK102226159SQ20111011944
公開日2011年10月26日 申請日期2011年5月10日 優先權日2010年11月29日
發明者李理想, 王愛龍, 許平, 馬翠卿 申請人:山東大學